방법 논문

고밀도 기능성 단백질 마이크로 어레이를 프로빙하는 단백질 - 단백질 상호 작용을 검출하기

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DOI:

10.3791/51872

⸱

2015년 8월 2일

 ,  , 
1Department of Genetics, Stanford University, 2Stanford Center for Genomics and Personalized Medicine, Stanford University

이 논문에서

요약

거의 전체 (S)를 포함하는 단백질 마이크로 어레이를 사용하여 cerevisiae의 프로테옴은 병렬 단백질 - 단백질 상호 작용의 수천의 신속한 편견 심문 프로브된다. 이 방법은 단백질 - 소분자, 번역 후 수정 및 높은 처리량의 다른 분석을 위해 이용 될 수있다.

초록

~ 4,200 재조합 효모 단백질을 함유하는 고밀도 기능성 단백질 마이크로 어레이는 판독에 대한 V5 에피토프 태그를 함유하는 친 화성 정제 효모 키나제 융합 단백질을 사용하여 키나아제 단백질 - 단백질 상호 작용을 조사한다. 정제 키나제 키나제 V5 융합체는 GAL 유도 성 프로모터 하에서 구축 플라스미드를 함유하는 형질 높은 사본 단백질 생산을 위해 최적화 효모 균주의 배양을 통해 얻어진다. 효모는 2 %의 갈락토오스와 유도 한 다음 6 시간 동안 중립 탄소원과 제한 배지에서 성장시킨다. 그 다음, 배양 물 수거되고 키나제 분석에 사용하기위한 고순도의 단백질 키나아제를 얻었다 표준 친화 크로마토 그래피 기술을 사용하여 정제한다. 정제 키나아제 분석을 위해 적절한 범위로 키나아제 완충액으로 희석하고 단백질 마이크로 어레이는 종래 단백질 마이크로 어레이와 하이브리드 화를 차단한다. 혼성화 후, 어레이는 단클론 V5의 antib로게나ODY은 키나제-V5 단백질에 의해 결합 단백질을 식별합니다. 마지막으로, 어레이는 표준 마이크로 어레이 스캐너를 사용하여 스캔되고, 데이터는 생체 내에서 검증을 위해 하류 단백질 상호 작용의 세트 높은 신뢰도를 결정하기 위해 하류 정보학 분석 1,2- 위해 추출된다.

서론

단백질 생화학 및 생체 내에서 결합 활성의 글로벌 분석을 수행 할 필요가 단백질 - 단백질 상호 작용 (프로톤 펌프 억제제) 및 전체 프로테옴 1,3-8의 번역 후 변형 프로파일에 대한 새로운 방법의 발전을 가져왔다. 단백질 마이크로 어레이는 항체 (10, 11)를 포함하는 4-6,8,9 전체 길이 기능성 단백질을 사용하여 기능성 단백질 마이크로 어레이, 또는 분석 단백질 마이크로 어레이로 제조된다. 이들은 12 광범위한 분석을 생화학 실험 실시에 필요한 다양한 조건을 용이하게하기 위해, 표면의 화학 다양한 현미경 슬라이드 상에 배열 된 단백질의 고밀도를 포함하도록 설계된다. 같은 다른 사람 (13) 사이의 친 화성이 부착 그의 - 태그 단백질과 글루타티온를 연결하는 니켈 킬레이트 슬라이드로 라이신 또는 선호도 부착 방법을 통해 화학 부착 니트로 셀룰로오스와 알데히드 표면 화학.

단백질 - 단백질 상호 작용을 검출하는 기능성 단백질 마이크로 어레이를 사용하면 고품질의 기능성 단백질 라이브러리 (14)에 대한 액세스를 필요로한다. S.을 cerevisiae의 높은 처리량 크로마토 그래피 정제 기술과 단백질 구조를 태그 높은 복사 친 화성의 페어링을 통해 이러한 라이브러리를 생산하는 의무가있다. 효모 게놈의 대부분은 서열화되어 거의 전체 프로테옴 정화용 높은 카피 플라스미드로부터 발현 될 수 있으며, 생화학 (12)를 분석한다. 단백질을 수득 및 384- 웰 포맷으로 배열되면, 이들은 빠른 병렬 다중 파라 생화학 및 생물 정보학적인 분석을 가능하게 심문 8,14-16 현미경 슬라이드 상에 인쇄된다. 단백질 마이크로 어레이는 다른 많은 응용들 중 단백질, 지질, 소분자, 핵산과 효소 분석법과의 상호 작용을 위해 사용되어왔다. 프로테옴의 표면에 단백질의 접근성배열은 다음과 같은 분석 검출 다른 유형의 면역 친 화성에 그들이 순종 할 플라즈몬 공명, 형광 및 다른 많은 기술을 표면. 또한,이 생체 내에서 수행하기 어려울 수있는 실험 조건의 미세 조정을 허용한다.

이 프로토콜의 목적은 단백질 - 단백질 상호 작용을 검출하는 기능성 단백질 마이크로 어레이의 적절한 사용을 설명한다. 이 애플리케이션은 관심 고순도 검체 (단백질)를 사용하여 단백질 결합 활동 높은 처리량 병렬 생화학 분석을 가능하게한다. C 말단 (말단 카복시) 관심 V5 미끼 융합 단백질 단백질 정제를 위해 최적화 된 효모 균주에서 높은 카피 플라스미드로부터 생성되는 태그. C 말단 태깅 전장 단백질 번역 한 것을 보장한다. 본 연구에 사용 된 단백질은 His6X 태그를 통해 니켈 친 화성 수지를 사용하여 정제한다 Tda1-V5 융합 단백질 키나아제이다. Tda1-V5 융합 CONSTRUCt는 분석법에 사용하기에 가장 고농축 분획을 용리 이미 다졸 구배를 사용하여 용출을 통해 직렬 정제한다.

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프로토콜

1. 프로브 준비

  1. 문화 다음과 다른 단백질과의 상호 작용을 조사하기 위해 사용 V5 융합 키나제 프로브를 정제 :
    1. 갓 줄무늬 효모 균주 Y258을 사용 (마타 pep4-3, his4-580, ura3-53, leu2-3,112) (게이트웨이 벡터 pYES-DEST52에서 표현) V5 융합 단백질을 포함. 마이크로 어레이에 프로브로 분리 된 단백질을 사용합니다. 합성 완료 - 우라실 (SC-URA) / 2 % 덱 스트로스 / 한천의 효모 플레이트 및 냉동 문화 (-80 ° C 글리세롤 주)에서 3 일간 30 ℃에서 성장한다.
    2. 하나의 식민지에서 스타터 문화 (5 ~ 20 ㎖)에 접종하고 30 ℃에서 플랫폼 (220-250 RPM) 또는 휠을 흔들어에 사우스 캐롤라이나 우라 / 2 % 포도당에서 하룻밤 성장.
    3. 다음 날 아침, 최종 OD 0.1 600에 충분한 스타터 문화와 사우스 캐롤라이나 우라 / 2 %의 라 피노 오스 문화의 400 ml에 접종.
    4. 0.6 (600)는 V5 키나아제 쿵푸의 갈락토스 유도 다음 OD하기 위해 접종 성장시온 그래서 갈락토스의 최종 농도가 2 % 인 (3)의 인자에 의해 유도 배지를 희석하기에 충분히 첨가하여, 6 % 갈락토스로 보충 3X 효모 추출물 / 펩톤 (YEP)의 용액을 첨가함으로써 발현을 구성.
    5. 흔들리는 플랫폼에서 6 시간 동안 30 ° C에서 세포를 유도한다. 적절한 통풍을 보장하기 위해 2 L 삼각 플라스크를 사용합니다.
    6. 4 ° C에서 5 분 동안 1,000 XG에 세포 현탁액 400ml를 회전하여 JA-10 (또는 유사한) 로터를 사용하여 세포를 수확.
    7. 얼음 50 ml의 차가운 PBS는 버퍼와 50 ML 원뿔 튜브로 전송 한 번 세포를 씻으십시오. 용해를위한 튜브 캡 스냅 ㎖로 2 용해 및 전송에 사용 (세제 또는 기타 첨가제없이) 얼음 차가운 PBS 버퍼에 다시 펠렛을 씻으십시오.
    8. 펠릿을 피펫 거리 버퍼 4 ° C에서 1 분간 20,000 XG에서 세포를 스핀.
    9. 얼음에 튜브를 넣고 용해 단계를 진행합니다.
    10. 를 Lyse 세포 (250-350 μL 펠렛) 0과1 : 1에서 0.5 mm의 지르코니아 비드를 세포 펠렛, 비드, 인산염 완충 식염수 (PBS)를 1 볼륨을 4 ℃에서 2 분 간격으로 버퍼와 소용돌이를 교반 플랫폼을 3 회 사용하여 혼합물을 용해.
    11. 4 ℃에서 10 분 동안 탁상의 microfuge에 20,000 XG에 해물을 원심 분리기.
    12. 피펫 폴리 카보네이트 고속 원심 분리기 튜브에 뜨는 4 ° C에서 15 만 XG에 30 분 동안 ulracentrufugation에 의해 명확하게.
    13. 히스티딘을 캡처 4 ℃에서 2 시간 동안 nutator에 미리 세척 니켈 2 + 친 화성 수지 (~ 100 μL)를 포함하는 튜브에 명확히 해물을 전송하고 부화 (그의) 6X는 V5-융합 단백질 태그.
    14. 세척 버퍼와 4 ℃에서 10 분 동안 수지 세 번 씻으십시오. 4 ° C에서 1,000 XG에서 5 분을위한 테이블 탑 원심 분리기를 사용하여 수지 펠렛과 뜨는을 대기음. 각 세척 신선한 세척 버퍼를 추가하고 세척하는 동안 튜브를 교반에 대한 nutator을 반환합니다.
    15. 세척 인트 후PS이 완료, 용출에 대한 신선한 G-25 컬럼 세척 수지를 적용합니다.
    16. 9 분획의 총 50 밀리미터 단위 500 mM의 이미 다졸을 100 mM의 이미 다졸로 시작 단계적인 방식으로 용출 완충액 25 μl를 적용한다.
    17. 소듐 도데 실 설페이트 폴리 아크릴 아미드 겔을 사용하여 수집 된 분획을 분석 (SDS-PAGE) 및 분석에서의 사용을 위해 가장 고농축 분획 (들)을 식별하고 -80 ° C에서 30 %와 저장소에 글리세롤을 추가 쿠마시 염색에 사용까지 분석.

2. 배열 프로브

참고 : 분석을 시작하기 전에 항체 용액을 제조하는이 섹션의 단계 2.6을 참조하십시오.

  1. 상호 작용을 검출하는 프로브 버퍼에 260 ng를 / ㎖로 V5-형광 물질 항체 (예 : AlexaFluor 647)를 희석 흔들어 잘 섞는다.
    참고 : 사용하고 nutat에 튜브를 배치 30 분 이전에이 항체 솔루션을 준비또는 또는 휠 완전한 혼합 및 항체의 균질 한 현탁액을 보장합니다.
  2. 5-500 μg의 / ml의 농도 범위 V5 융합 단백질 프로브를 희석.
    주 : 프로브 버퍼를 사용하여 각각의 단백질 - 단백질 상호 작용 분석을 위해 최적화. 최적화 버퍼를 조사하기 위해 더 많은 프로브를 추가 포함한다. 일반적으로 10 μg의 / ml의 시작점으로 이용되고, 신호 강도에 기초하여 적절하게 조정.
  3. 냉동 (-20 ℃)​​에서 단백질 마이크로 어레이를 제거하고 사용하기 직전에 냉장고에 4 ℃에 가져다.
  4. 누출을 방지하기 위해 파라 필름으로 위쪽 micorarrays 단백질을 함유하는 슬라이드 홀더에 직접 블로킹 완충액 추가 커버. 4 ° C에서 무대에서 50 rpm으로 흔들어 1 시간 동안 버퍼를 차단하는 배열을 차단합니다.
  5. 차단 한 후, 4 ℃로 냉각 가습 실에 배열을 전송, 직접 배열 표면에 희석 프로브의 90 μl를 추가합니다. 도착 오버레이1.5 시간 동안 4 ℃에서 가습 실에서 제기 리프터 슬립 AYS 및 정적 배양 (NO 떨고).
  6. 세 50 ML 원뿔 튜브 프로브 버퍼에 1 분마다 배열하는 과정을 3 회 반복한다. 완전히 슬라이드를 봉투에 충분한 사전 냉장 프로브 버퍼를 포함하는 원뿔 튜브 슬라이드를 추가합니다. 리프터 슬립 부드럽게 단백질 마이크로 어레이 (이 어레이의 표면에 손상을 줄 수 있기를 강제로 해제하지 않음)의 미끄러하도록 허용합니다.
  7. 바로 이전 제기 리프터 슬립 세척 (단계 2.5) 및 오버레이를 완료 한 후 배열에 직접 항체 용액을 적용합니다. 습윤 챔버에서 4 ° C에서 30 분 동안 인큐베이션 배열.
  8. 실온에서 5 분 동안 원심 탁상 800 XG에 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 동일한 워시 (프로브 버퍼에서 1 분 3 회) 전 단계로서, 스핀을 수행한다. 647 nm에서 배열을 스캔하기 전에 30 분 동안 어둠 속에서 슬라이드 홀더에 배열을 공기 - 건조.

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결과

단백질 - 단백질 상호 작용 활성 Tda1-V5 단백질 키나제 융합 약 4,200 고유 S. 함유 효모 기능성 단백질 마이크로 어레이에 대해 미끼 단백질로서 구성 평가하는 표준 칩 판독기를 사용하여 관찰 cerevisiae의 GST 융합 단백질. 제품, GenePix 소프트웨어 또한 심문은 다양한 강도의 이벤트를 바인딩의 다수를 한 것으로 밝혀졌습니다. 친화도는 목표 (V5 키나아제)에 결합 모노클 V5 항체 - 형광 물질로부터 유도 된 신호의 강도 등급에서 계측 하였다. ProCat 스코어링 알고리즘 2 (각 단백질 어레이에 두 번 발견되는) 이중으로 분석 단백질 각각에 대한 두 개의 별도의 단백질 마이크로 어레이에 걸쳐 단백질 - 단백질 상호 작용을 확인하는 데 사용 된 후 임계 컷오프가 관찰 상호 작용을 처치 구 하였다.

하나 4 기술은 복제 (N = 4) INT를 결정하기 위해 사용할 수있는 두 개의 배열을 취득 비교...

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토론

프로토콜은 원래 생체 한 새로운 키나제 상호 작용 네트워크의 식별 결과 효모 단백질 키나제의 구별과 관련 제품군 간의 결합 활성을 비교하는 (85) 고유의 효모 단백질 키나제 V5 융합 단백질을 사용하여 수행 하였다 선보였다. 신흥 프로테옴 프로파일 링 기술로, 높은 처리량 (HTP) 펩타이드 라이브러리, 진핵 생물과 원핵 생물의 모델 생물 8,17에 의존 단백질 마이크로 어레이를 이용하여 프로테옴의 선별 검사의 개발; 이후, 이러한 분석 플랫폼은 식물과 인간의 5,7- 등의 고급 진핵 세포에 적용 하였다. 현재 어떤 상업적으로 이용 가능한 효모 단백질 어레이는 없다. 그러나 순서는 cDNA를 수집 여러 자원에서 사용할 수있는 검증

기술이 강력 할 수 있지만, 염두에 두어야 하나주의해야 할 점은, 따라서 결과는 오탐 (false positive)이있을 것이다, 분석은 <...

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공개 사항

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

감사의 글

이 작업은 NIH의 보조금으로 지원되었습니다. 그림 1에 표시된 분석은 Joseph Fasolo 박사가 수행했습니다. 도움이 되는 의견을 주신 Rui Chen 박사님께 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
페트리 접시: VWRNC-10747또는 이와 유사한
박 토 효모 추출물: Difco0217-17
Bacto 펩톤Difco0118-17
Bacto 한천Difco0140-01
포도당시그마D9434
라피 노스시그마R0514
갈락토스SigmaG0750
Sc-Ura 드롭아웃 미디어MP Bio114410622
소형 배양 튜브VWR/Fisher
대형 삼각 플라스크VWR/Fisher
원심분리기 JA-10 로터
원심분리기 튜브(500ml)
Falcon 튜브(50ml)VWR/Fisher21008-951
PBS 정제시그마P4417
FastPrep 튜브 (2 ml 스크류 캡 튜브)
FastPrep 기계MP Biomedicals116004500
지르콘 비즈BioSpec11079105
Triton X100시그마P4417
DTT시그마D9779
MgCl2SigmaM8266 
NaCl시그마S3014 
이미다졸 (pH = 7.4)시그마I5513 
PMSFSigma93482
완전한 억제제 칵테일 (EDTA 무료)Roche11873580001
Phosphatase 억제제 칵테일 1시그마P2850
BSA시그마A2153 
트윈-20시그마P1379 
ATP시그마A1852 
쉐이킹 인큐베이터 (30 ° C)
니켈 친화력 수지Life TechnologiesR901-01
G25 열GE 생명과학27-5325-01 
NutatorVWR/Fisher
SDS-PAGE 젤 (NuPage)Life Technologies
Coomassie Blue StainLife Technologies
단클론 V5 항체Life TechnologiesR960-25
Alexa647 태그 단클론 V5 항체Life Technologies451098
단백질 마이크로어레이 KitLife TechnologiesPAH0525013
Genepix 스캐너분자 장치
리프터 슬립토마스 사이언티픽http://www.thomassci.com/Supplies/Microscope-Cover-Glass/_/LIFTER-SLIPS/
용해 버퍼: 0.1% Triton X-100, 0.5 mM DTT,
2 mM MgCl2, 500 mM NaCl, 50 mM 이미다졸 (pH 7.4), 완전한 프로테아제 억제제 칵테일 – EDTA-free, Phosphatase 억제제 칵테일 1, 1 mM PMSF  (사용 직전에 추가)		1x PBS(0.01M 인산염 완충액, 0.0027M 염화칼륨, 0.137M 염화나트륨, pH 7.4)에 시약을 추가하여 원하는 부피의 용해 용액을 얻습니다.
차단 완충액: 1% 소 혈청 알부민(BSA), 0.1% Tween-201x PBS에 시약을 추가하여 원하는 부피의 차단 완충액
을 얻습니다.프로브 버퍼 : 2 mM MgCl2, 0.5 mM DTT, 0.05% 트리톤 X-100, 50 mM NaCl, 500 μ M ATP(키나아제용), 1% BSA원하는 부피의 프로브 완충액을 얻기 위해 1x PBS에 시약을 추가합니다
완충액: 0.1% Triton X-100, 500 mM NaCl, 0.5 mM DTT, 50 mM imidazole (pH 7.4),2 mM MgCl21x PBS에 시약을 추가하여 원하는 부피의 프로브 완충액
을 얻습니다.용리 완충액 : 0.1 % 트리톤 X-100, 0.5 mM DTT, 2 mM MgCl2< / sub>, 500 mM NaCl, 50 – 500 mM 이미다졸 (pH 7.4), 완전한 프로테아제 억제제 칵테일 – EDTA 프리, 인산가수분해효소 억제제 칵테일 1, 1 mM PMSF (사용 직전 추가)시작하기 전에 이미다졸의 농도 구배(50 – 500 mM)를 기록하고 각 농도에 대해 별도의 튜브를 만드는 것이 중요합니다(50 mM 단위를 사용하여 간격을 만드는 것이 좋습니다). 원하는 양의 프로브 버퍼를 얻기 위해 시약을 1x PBS에 추가합니다
3x YEP +6% 갈락토스: 효모 추출물 30g과 펩톤 60g을 H2O 700ml에 용해하고 오토클레이브합니다. 멸균 처리된 20% 갈락토오스 (wt/vol)  Galactose는 고압멸균해서는 안 됩니다.
, , , , , . 세척 . 필터 300ml 추가

참고문헌

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  11. Kopf, E., Zharhary, D. Antibody arrays--an emerging tool in cancer proteomics. The international journal of biochemistry & cell biology. 39, 1305-1317 (2007).
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  16. Im, H., Snyder, M., et al. Preparation of recombinant protein spotted arrays for proteome-wide identification of kinase targets. Current protocols in protein science. Coligan, J. E. 27, Unit 27 24(2013).
  17. MacBeath, G., Schreiber, S. L. Printing proteins as microarrays for high-throughput function determination. Science. 289, 1760-1763 (2000).

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