여기서 설명하는 것은 감지하고 유세포 짐승 조직으로부터 분리 및 분석 미토콘드리아 immunolabeling 의해 미토콘드리아 외막 단백질을 정량하는 방법이다. 이 방법은 미토콘드리아 개체군의 기능적 측면을 평가하기 위해 확장 될 수있다.
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이 논문에서
요약
초록
방법은 검색과 동물의 조직은 미토콘드리아 생리학 및 병태 생리를 연구하는 필수적인 미토콘드리아 외막 단백질 구성 요소를 모니터링 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 쥐의 조직에서 분리 된 미토콘드리아가 immunolabeled 및 유동 세포 계측법에 의해 분석하는 기술에 대해 설명합니다. 미토콘드리아는 설치류 척수로부터 단리 미엘린, 신경 조직으로부터 제조 미토콘드리아 분획의 주요 오염 물질을 제거하기 위하여 빠른 농축 공정을 실시한다. 고립 된 미토콘드리아는 다음 선택의 항체와 형광 접합 된 이차 항체로 표시되어 있습니다. 유동 세포 계측법에 의한 분석은 검출 및 immunolabeled 단백질의 정량 하였다 미토콘드리아 특정 염료로 염색하여 미토콘드리아 제제의 상대적 순도를 검증한다. 이러한 기술은 샘플 당 미토콘드리아 수십만의 분석을 허용 급속한 정량화 및 높은 처리량이다. 이 소설의 페이지를 평가에 적용 할 수있다정상적인 생리적 조건하에 미토콘드리아 표면 roteins뿐 아니라 병리 과정이 소기관에 mislocalized 될 수 단백질. 중요한 것은,이 방법은 미토콘드리아 개체군의 특정 활동에 대한보고를 형광 표시 염료에 결합 및 중추 신경계 (뇌와 척수)뿐만 아니라 간에서 미토콘드리아에 대한 가능하다 할 수있다.
서론
미토콘드리아는 높은 에너지 수요의 사이트로 이송 및 생리 학적 자극 하나에 빠르게 반응하는 핵분열 및 융합의 여러 라운드를 거쳐 매우 동적 인 세포 소기관이다. 그것이 점점 다른 조직에서 미토콘드리아를 인식하고 있기 때문에, 심지어 다른 세포 구획, 새로운 방법은 이러한 고유 한 미토콘드리아의 하위 집합을 식별하는 데 필요한 별개의 기능 프로파일을 가지고있다.
현미경 개별 미토콘드리아가 가시화 될 수있다 수단 및이 면역에 의해 결정될 수있다이나 미토콘드리아에서 단백질의 존재를 제공한다. 그러나,이 방법에 의해 정량 분석은 노동 집약적이고, 일차 또는 무한 증식 세포주를 이용한 실험에 더 적합하다. 조직에서 파생 된 개별 미토콘드리아의 연구는 훨씬 더 어렵고 대부분의 방법은 evalu과 동시에 미토콘드리아 부분 집합을 쉽게 식별 할 수 있도록하지 않습니다미토콘드리아 기능 3의 ation.
이 장애물, 유동 세포 계측법에 의해 짐승 조직으로부터 분리 및 후속 분석 미토콘드리아 immunolabel하는 신규 한 방법을 해결하기 위해 개발되었다. 이는 신속한 검출 및 현미경으로 분석하여 비교 미토콘드리아 외막으로 지역화 단백질의 정량....
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프로토콜
본 연구에 사용 된 동물은 캐나다에 의해 설명 된대로 국가 표준을 다음과 동물의 보호를위한 센터 드 공들인 뒤 센터 Hospitalier 드 난 4 대학 몬트리올 (CRCHUM) 기관위원회의 승인 프로토콜 (N08001CVsr)에 따라 엄격하게 처리하여, 동물 관리 협의회 (CCAC).
이 프로토콜 (표 1)을 수행하는 데 필요한 모든 시약을 준비합니다. 장비, 소모품 및 공급 업체에 대한 다른 모든 세부 사항은 재료의 목록에서 찾을 수 있습니다.
표 1 버퍼 조성물은.
쥐 척수의 1 컬렉션
- 깊이 4 % isoflorane와 쥐 (스프 라그)를 마취시키다. 일의 곤란에 반사의 부족에 의해 진통제를 확인전자 앞발. 단두대를 통해 잘린 쥐를 안락사.....
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결과
래트 척수 유래의 미토콘드리아는 Mitofusin2 (Mfn2), (8)의 미토콘드리아 외막의 융합에 관여 단백질에 표적 항체 immunolabeled 수있다. Mfn2 특정 항체와 형광 접합 된 이차 항체 분리 및 라벨에 따라, 미토콘드리아는 유동 세포 계측법 (그림 1)에 의해 처리된다. 데이터 수집 후, 샘플은 제 도트 플롯 (도 2A)에 수집 된 모든 이벤트를 가시화하여 분석 소프트웨어를 이용하여 유세포 분석된다. 이벤트가 FSC, 폭 (W) 대 영역 (A) (그림 2B)에서 플롯 할 때 이중선과 단봉는 차별화된다. 단일체가 FSC / SSC (그림 2C)을 통해 게이트에게 미토콘드리아 인구 선택에 의해 미토콘드리아 특정 염료에 대한 긍정적 인 염색 이벤트의 수 확인되면 미토콘드리아-SPE 물들 샘플 흠 샘플의 히스토그램을 공동 - 플로팅cific 염료. 미토콘드리아 이벤트를 확인.......
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토론
이는 미토콘드리아가 정상적인 생리와 질병 모두에서 핵심 선수임을 점점 더 분명하다. 면역 블로는 특정 조건에서 미토콘드리아 내에서 또는 미토콘드리아 표면에 전체 인구의 평균이 방법 보고서를 발견되는 단백질을 확인할 수있다. 이 방법은 미토콘드리아 개체군 또는 부분 집합의 상대적 농도에 대한 정보를 얻을 수 없습니다. 이 왔지만 이전에 모든 미토콘드리아가 동등하게 필드가 점점 세포 내 미토콘드리아 인식되어 만든 형태 및 / 또는 기능 (10)의 측면에서 광범위한 변화를하고 있다고 가정.
형광 현미경의 접근 방식이 계정에 미토콘드리아의 이질성을 않습니다. 그러나, 이러한 유형의 데이터의 정량화는 노동 집약적이다. 또한,이 접근법은 / 반응계에서 기인 exces하기 어려운 생체 내 미토콘드리아의 표지로서, 배양 된 세포를 사용하는 연구에 더 적합현재 미토콘드리아의 시브 수, 개별 세포 기관의 분화가 본질적으로 어렵게 만든다. 대부.......
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공개 사항
저자가 공개하는 게 없다.
감사의 글
우리는 흐름 cytometer에 액세스 로리 Destroismaisons과 뛰어난 기술 지원을 사라 Peyrard 및 Dr.Alexandre 프라 감사합니다. 우리는 또한 준비에서 수초의 제거에 대한 그의 기여에 대한 박사 티모시 밀러를 인정하고 싶습니다. 이 작품은 건강 연구 (CIHR) 신경 근육 학 연구 파트너십, 혁신에 대한 캐나다 재단, 캐나다의 ALS 협회, ALS 연구를위한 프릭 재단, 미끼 재단과 퐁 드 라 공들인 엉 상테 퀘벡 (CVV)의 캐나다 연구소에 의해 지원되었다. 두 CVV 및 NA는 연구 학자 퐁 드 라 공들인 엉 상테 퀘벡 및 CIHR 새로운 수사. SP 캐나다의 ALS 협회에서 팀 노엘 재학 지원됩니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 쥐 | Charles River | Strain code 400 | 성체(9주에서 18주) 수컷 또는 암컷 쥐를 격리 프로토콜에 사용할 수 있습니다. 쥐의 체중은 성별과 연령에 따라 다르며 일반적으로 (수컷은 300-500g, 암컷은 200-350g)이 사용됩니다. |
| Dounce 균질화 업체 | Kontes Glass Co. | 885450-0022 | Duall 22 |
| 마이크로 원심분리기 | Thermo Scientific | Sorvall Legend Micro 17 R | |
| Ultra-Clear 초원심분리기 튜브 | Beckman Coulter | 344057 | 투명하고 얇은 벽 |
| Sorvall 초원심분리기 | Thermo Scientific | Sorvall WX UltraSeries | |
| AH-650 로터 및 버킷 | Thermo Scientific | ||
| Opti-prep | Axis-Shield | 1114542 | Iodixanol, 밀도 그라데이션 매체 |
| 지방산 무료 소 세럼 알부민 | 시그마 | A8806 | 미토콘드리아를 위해 지방산이 없어야 함 |
| 나트륨 숙신산 이염기성 육수화물 | Sigma | S9637 | |
| Rabbit anti-Mitofusin2 항체 | Sigma | M6319 | |
| Rabbit IgG | Jackson Immuno Research | 011-000-003 | |
| Anti-Rabbit IgG PE | eBioscience | 12-4739-81 | |
| 마이크로 역가 튜브 | Bio-Rad | 223-9391 | 유세포 분석에 의한 샘플 수집용 |
| MitoTrackerGreen (MTG) | Invitrogen | M7514 | 100 nM: Ex 490 nm/Em 516 nm |
| TMRM | Invitrogen | T668 | 100 nM: Ex 548 nm/Em 574 nm |
| CCCP | Sigma | C2759 | |
| MitoSOX Red | Invitrogen | M36008 | 5 µ M: Ex 540 nm/Em 600 nm |
| 안티마이신 A | 시그마 | A8874 | |
| LSR II 유세포 분석기 | BD | ||
| BD FACSDiva 소프트웨어 | BD | ||
| FlowJo | TreeStar Inc. | 를 분석하는 데 사용되는 소프트웨어 | |
| Pierce/Thermo Scientific | 23225 | Bradford 분석은 고농도의 SDS와 호환되지 않으므로 권장하지 않습니다. |
참고문헌
- Itoh, K., Nakamura, K., Iijima, M., Sesaki, H. Mitochondrial dynamics in neurodegeneration. Trends Cell Biol. 23, 64-71 (2013).
- Narendra, D., Tanaka, A., Suen, D. F., Youle, R. J. Parkin is recruited selectively to impaired mitochondria and promotes their autophagy. J Cell Biol....
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재인쇄 및 허가
