이 논문은 자동 및 수동 액체 처리기를 사용하여 다양한 RNA 및 DNA 바이러스를 적정하는 고처리량 루시페라제 발현 기반 방법을 제시합니다.
이 논문에서
요약
초록
감염성 바이러스 역가를 결정하기 위한
표준 플라크 분석은 시간이 많이 걸리고, 많은 양의 샘플을 수용할 수 없으며, 플라크를 형성하지 않는 바이러스로 수행할 수 없습니다. 플라크 분석의 대안으로, 당사는 하루에 많은 양의 샘플을 동시에 적정할 수 있는 고처리량 적정 방법을 개발했습니다. 이 접근법에는 Firefly 루시페라아제 태그가 붙은 바이러스에 샘플을 감염시키고, 감염된 샘플을 적절한 허용 세포주로 옮기고, 이후에 루시페린을 추가하고, 발광 판독값을 얻기 위해 플레이트를 판독하고, 마지막으로 발광에서 바이러스 역가로 전환하는 것이 포함됩니다. 대사 생존도 염료를 사용한 세포 독성 평가는 병렬로 워크플로우에 쉽게 통합될 수 있으며 약물 스크리닝의 맥락에서 귀중한 정보를 제공할 수 있습니다. 이 기법은 표준 플라크 분석의 대안으로 바이러스 역가를 측정할 수 있는 신뢰할 수 있는 고처리량 분석법을 제공합니다.
서론
고전적인 바이러스 플라크 분석법은 시간이 많이 소요되고 실험 결과를 얻는 데 상당한 병목 현상을 일으킬 수 있음에도 불구하고 바이러스 연구의 주류로 계속 사용되고 있습니다. 정량적 중합효소연쇄반응(qPCR), ELISA 및 유세포분석1-4를 포함한 보다 신속한 간접 바이러스 정량화 방법이 등장했습니다. 바이로사이트(Virocyt) 바이러스 계수기와 같은 최근의 혁신은 첨단 유동 선별 기술을 사용하여 단백질과 DNA/RNA 염료의 조합을 통해 바이러스를 직접 계수할 수 있습니다5. 이러한 모든 방법이 바이러스 연구의 속도를 높인 것은 의심의 여지가 없지만 각 방법에는 장단점이 있습니다. 예를 들어, qPCR은 특정 바이러스 게놈 염기서열의 정량화를 가능하게 할 수 있지만 감염성 바이러스와 결함이 있는 바이러스를 효과적으로 구별할 수는 없습니다6. ELISA는 매우 특이적일 수 있지만 원하는 표적 바이러스 단백질에 대한 적절한 항체가 필요하며 매우 비쌀 수 있습니다. 유세포 분석 기술은 많은 이점을 제공하고 크게 개선되었지만, 그럼에도 불구하고 고도로 전문화된 장비에 대한 처리량과 접근성은 여전히 장애물로 남아 있습니다. 중요한 것은 이러한 모든 기술이 바이러스 정량화 단계의 용이성과 시간 요구 사항이 매우 중요한 고처리량 스크리닝에 이상적으로 적합하지 않다는 것입니다.
여기에서는 Firefly luciferase(Fluc) 전이유전자를 발현하는 바이러스를 역가화하는 고처리량 및 쉽게 자동화할 수 있는 기술에 대해 설명합니다. 이 방법은 알려진 바이러스 양의 표준 곡선을 병렬로 사용하여 발광 신호 판독을 기반으로 테스트 샘플에서 대략적인 바이러스 역가를 생성합니다. 알 수 없는 양의 루시페라아제 발현 바이러스를 포함하는 샘플은 표준 바이러스 희석 곡선과 병렬로 허용적인 "플라킹(plaquing)" 세포주로 전달되고 몇 시간의 배양 시간 후에 바이러스 관련 발광을 판독합니다. 이를 통해 눈에 보이는 플라크7-9를 수동으로 계수하기 위해 일반적으로 며칠의 배양이 필요한 기존 플라크 분석 프로토콜과 달리 빠르고 정량적이며 종종 당일 결과를 생성할 수 있습니다.
이 프로토콜은 Fluc 전이유전자(VSV∆51-Fluc)를 인코딩하는 종양 용해성 수포성 구내염 바이러스를 예로 사용하여 적정 방법의 단계를 간략하게 설명하고 1에 대한 개요를 제공합니다. 샘플 준비 2. 자동 디스펜서를 사용한 바이러스 적정을 위한 허용 세포주 도금 3. 바이러스 표준 곡선의 준비 4. 96웰 수동 피펫터를 사용하여 시료 상층액을 허용 세포주로 이동5. 세포 생존도 시약을 사용한 시료 세포 독성 평가 6. 루시페린 기질의 제조 7. 생물 발광에 대한 독서 및 8. 데이터 분석.
프로토콜
1 샘플 준비
- 96 - 웰 플레이트에 적정 및 전송을위한 루시 페라 제 발현 바이러스 (예를 들어 본원 VSVΔ51-Fluc)를 포함하는 샘플을 얻습니다. 대안 적으로, 직접적으로 96 웰 조직 배양 플레이트를 사용 상청액에서 감염을 수행한다.
- 표준 곡선의 포함에 대한 처리되지 않은 두 개의 열을 둡니다. 나중에 -80 ° C 및 역가의 실험 (40 시간 게시물 감염) 또는 저장소의 말에 96 - 웰 플레이트, 역가에서 직접 수행 실험하십시오.
바이러스 적정 허용 세포의 2 준비
- 24 시간 전에 titering하여, 10 % 소 태아 혈청을 함유하는 둘 베코 변형 된 이글 배지에서 2.5 × 105 세포 / ml (DMEM) (FBS), 30 mM의 HEPES의 농도 베로 세포의 현탁액을 제조하고, 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신. NOTE :이 프로토콜은 베로 세포를 사용하지만, VSV 감염 임의의 적절한 허용 세포주 ㄴ 수전자를 사용합니다.
- 마이크로 디스펜서를 사용하여 96 - 웰 백색 고체 평면 바닥 플레이트에 2.5 × 104 세포 (100 μL)을 시드.
- 접시 당 세포 현탁액의 12 ML 플러스 프라이밍 5 ML을 준비합니다.
- 멸균 물 50 ㎖로 튜브를 세척함으로써 클린 마이크로 디스펜서 카세트.
- 세포 현탁액을 가진 마이크로 디스펜서 라인을 작성하고 세포 현탁액의 5 ㎖를 통해 흐름을 보자.
- 흰색 벽으로 둘러싸인 96 웰 플레이트의 각 웰에 100 μl를 분배하는 프로그램을 선택합니다. 분배 및 추가 판에 필요한 반복합니다. 불투명 바닥 흰색 벽 플레이트 세포 건강과 밀도의 확인을 위해 사용되는 경우 또한 96 웰 분명 바닥이 평평한 접시에 몇 우물을 시드.
- 다시 원래의 용기에 완료, 세척 세포. 튜브를 통해 멸균 따뜻한 물 50 ㎖ 다음에 70 % 에탄올 50 ㎖를 실행하여 카세트를 청소한다.
- 확인 카세트와 튜브가 AP 해적절히 설계된 사용 사이의 청소.
- 가습 된 5 % CO 2 배양기에서 37 ° C에서 24 시간 동안 세포를 품어.
바이러스 성 표준 곡선의 3 준비
- 108 PFU / ㎖, 107 PFU / ㎖를 : 무 혈청 DMEM에서 VSVΔ51-Fluc의 표준 곡선을 준비 예컨대 다음과 같이 베로 세포 상 전사 후의 ML 당 플라크 형성 단위 (PFU)의 최종 농도가 있음 10 6 PFU / ㎖, 10 5 PFU / ㎖, 104 PFU / ㎖, 103 PFU / ㎖, 10 2 PFU / ㎖, 및 10 일 PFU / ㎖. 베로 세포의 플레이트 플러스 추가 10 % 당 각 농도의 50 μl를 준비합니다.
NOTE : 루시퍼 라제 스톡 바이러스 역가의 절대 정량 있도록 표준 곡선을 생성하기 위해 고전적인 방법 (10)에서 평가 될 필요가있다. 그렇지 않으면 상대 정량 임의로 설정하여 바이러스 역가를 역가 정확한 정보없이 달성 될 수있는 기초희석 단계에. 예를 들어 표준 곡선의 처음의 희석은 10 8 바이러스 단위 및 10 7 등으로 희석 10.1 이하로 설정 될 수있다. 이러한 맥락에서, 하나는 정확하지 않을 절대적인 정량화로서 미리 결정된 샘플과 비교하여 배의 변화와 같은 값을 표현한다.
허용 세포 상에 샘플 상층 액의 4 전송
- 단일 층은 적어도 95 % 합류임을 확인 광학 현미경 클리어 바닥 96 - 웰 플레이트에 도금 베로 세포를 확인한다.
- 흰색 벽 플레이트 시드 베로 세포에 샘플 상층 액의 25 μl를 전송합니다. 표준 곡선에 대해 지정된 2 열로 상층 액을 전송하지 마십시오. NOTE :이 96 - 채널 액체 핸들러를 사용하여 단일 플레이트의 모든 웰에 대해 동시에 수행 될 수있다.
- 8 또는 12 채널 멀티 채널 피펫을 사용하여,의 베로 세포를 3 단계에서 제조 된 표준 곡선의 각 희석액 25 μL를 추가이 지정된 열.
- RT에서 430 XG에 5 분 동안 원심 분리 판.
- 가습 된 5 % CO 2 배양기에서 37 ° C에서 5 시간 동안 품어.
세포 생존 능력의 평가 (5)
- NOTE : 맑은 96 웰 플레이트에서 수행 감염 실험에서 얻은 상청액으로부터 시작하는 경우, 샘플은 생존 레사 주린으로 세포 생존의 지시 염료와 정량화하기 전에 평가 될 수있다.
- 바이러스와 세포를 함유하는 샘플의 96 - 웰 플레이트의 각 웰의 체적의 10 %에 상당하는 양으로 레사 주린 추가. 셀 전용 각각 100 %와 0 %의 생존율에 대한 값을 결정하기 위해 미디어 전용 제어뿐만 아니라 제어 포함한다.
- 2-4 시간 (세포 유형과 염료의 시판 또는 재구성 된 파우더의 농도에 따라 달라질 것이다 배양 시간) 후, 판독 및 형광 플레이트 리더 (530-560 여기, 590 방출)을 이용하여 신호를 기록한다. 보고서 셀 viabiliX 100 % 상대 화학식 대사 활동 = - (- 네거티브 제어 신호) / (셀에만 신호를 제어 네거티브 제어 신호) (시험 샘플 신호)에 따른 샘플 TY
루시페린 기판의 6 준비
- 30 분, 5 시간의 배양이 종료되기 전에, 멸균 인산 완충 식염수 (PBS)에 2 ㎎ / ㎖ 용액을 얻었다 루시페린을 준비. 접시 당 2.5 ㎖의 플러스 여분이 ML을 준비합니다. 빛으로부터 솔루션을 보호합니다. 참고 : 루시페린는 이전 일에서 준비하고 사용할 때까지 4 ° C에서 저장 될 수있다.
7 독서 생물 발광
- 5 시간의 잠복기 후, 백색 고체 플레이트 베로 세포의 각 웰에 루시페린의 25 μl를 추가합니다. 수동으로 또는 루미에 통합 자동 디스펜서와 루시페린을 추가합니다. NOTE : 단지 하나의 단부 지점과 함께 기기의 사용은 루시페라아제 호환 용해 버피의 첨가가 필요할 수 읽FER 일관성을 개선하기 루시페린 기질을 첨가하기 전에.
- 다음 매개 변수를 사용하여 번호판을 읽기 :
- 5 초 동안 흔들어.
- 30 초를 기다립니다.
- 적절한 고정 감도 / 노출 값에서 발광을 읽어보십시오. 옵션이 기기에 사용할 수있는 경우, 멀티 포인트의 정확성을 개선하기 위해 (예를 들면, 3 × 3 행렬을) 읽고 사용하십시오.
- 기록 및 정량 생물 발광 강도를 저장합니다.
- 자동 디스펜서를 추가하는 데 사용 된 경우 루시페린은 루시페린 프라임 따뜻한 멸균 물 라인을 제거.
제 데이터 분석
- 정확한 결과를 위해, 표준 곡선으로부터 힐 방정식을 생성하기 위해 비선형 회귀를 해결한다. 바이러스 성 표현 단위를 계산하는 titered 샘플이 방정식을 적용합니다. 일부 바이러스 나 상황이 선형 관계로 표준 곡선을 생성 할 수있다; 이러한 경우에 선형 방정식 해결.
결과
높은 처리량 방법을 설명하는 흐름의 개요는도 1에 도시되어있다. 2 전형적인 표준 곡선 ofVSVΔ51-Fluc의 결과를 보여준다. 비선형 회귀 분석을 네 매개 변수는 알 수없는 입력 PFU (바이러스 역가 추정치)를 삽입 할 수있는 힐 플롯을 생성합니다. 이러한 추정 역가는 불린다 바이러스 발현 단위 (VEU). 그림 3a는 VEUs 및 역가가 동일한 샘플 (10)와 표준 플라크 분석을 수행하여 얻은 보여줍니다. 샘플은 다양한 화학 물질이 복제를 향상시키는 데 사용 및 786-0 세포에서 VSVΔ51-Fluc의 확산되었다 실험에서 유래. 표준 곡선으로부터 내삽 VEUs이 샘플 상청액의 희석에 기초한 계수를 곱한해야는 베로 세포에 전송되고 (이 경우, 희석 배수 5이다). 역가와 VEU 사이의 선형 상관 관계는 그림 3b에 도시된다 R 0.8083의 2와 0.899 (P <0.0001)의 피어슨의 연구 점수와 함께. 그림 4에서, 대사 분석에서 얻은 일반적인 세포 독성 데이터는 이전 VSVΔ51-Fluc 감염에 화학 물질로 처리 786-0 세포에 대해 표시됩니다. 마지막으로, 그림 5는 다양한 바이러스를 얻을 일반적인 표준 곡선 (단순 포진 바이러스 (HSV), 백시 니아 바이러스 및 아데노 - 관련 바이러스 (AAV), 모든 표현 반딧불 루시 페라 제)를 표시하고 필요에 따라, 배양 시간 및 동결 융해에 대해 설명합니다.
VSV Δ 51-Fluc를 사용하여 높은 처리량 바이러스 titering 및 세포 독성 분석의 그림 1 워크 플로우. 37 ° C에서 (A) 씨도 (100 μL) 당 2.5 × 10 4 베로 세포를 배양한다. (B) (24)시간 후 전송 베로 세포에 대한 표준 곡선의 25 μL (접시 당 2 열). (C) 전송은 샘플의 25 μL은 나머지 베로 세포에 titered합니다. 원심 분리기 판과는 잘 37 ° C. (D)에 볼륨의 10 %에 상당하는 금액에서 부화 원래의 샘플을 포함하는 판에 레사 주린 시약을 추가합니다. , 5 시간 후 (F). 세포 독성을 읽고 기록 형광 및 평가, 3 시간 후 37 ° C. (E)에서 번호판을 품어 베로 세포의 각 웰에 루시페린의 2 ㎎ / ㎖ 용액 25 μl를 추가합니다. 발광을 읽고 바이러스 성 표현 단위를 계산합니다.
그림 2는 VSV Δ 51-Fluc의 표준 곡선을 예상. 루시 페라 제 발현 나였잘 루미를 사용하여 생물 발광이 평균 상대 라이트 유닛 (RLU)로 표현 된 내 다섯 가지 지점에서 5 시간 후 상등액 전송을 asured. RLU 의미하는 것은 공지의 입력에 대해 플롯 하였다 PFU / ㎖ 비선형 회귀를 해결하고 힐 방정식을 생성한다. 이 복제 곡선과 표준 오차 막대의 평균 (R = 0.9993이에게) 표시됩니다.
도 높은 처리량 방법에 의해 수득 된 것과 표준 플라크 분석 역가 비교 3. (A) VEU / ㎖ 사이의 PFU / ㎖ 높은 처리량 루시페라아제 분석법을 이용 titered 동일 샘플로부터 계산 된 바이러스 역가 (VEU / ㎖)과 비교 하였다 베로 세포에 대한 표준 플라크 분석에 의해 얻어진. (B) 선형 관계에 바이러스 역가 및 역가 표준 페이지를 통해 획득laque 분석. 선형 회귀 곡선과 결정 (R 2)의 계수를 나타낸다.
그림 4 샘플 생존. 베로 세포 상에 뜨는 전송이 시판 레사 주린 용액을 이용하여 세포의 신진 대사 활동을 평가하여 결정 하였다 샘플 생존 이전에. 원시 형광 값은 치료, 감염되지 않은 우물의 정규화 하였다.
그림 5는 HSV, 우두 및 AAV 바이러스 표준 곡선을 예상. 루시 페라 제 표현이 잘 루미를 사용하여 내 다섯 다른 지점에서 측정 한 생물 발광이 평균 침착 하 발현되었다TIVE 광 단위 (RLU). (A) HSV 표준 곡선은 베로 세포에 첨가하고 17 시간 후 supernantant 전송 (R이되었다 :도 (100 μL) 및 루시페라아제 측정 당 2.5 × 104 세포의 밀도로 24 시간 이전 도금 = 0.9489, N = 1). 힐 방정식은 비선형 회귀를 해결함으로써 생성 하였다. (B) 백시 표준 곡선은 베로 세포에 첨가하고 잘 (100 μL) 당 2.5 × 104 세포에 24 시간 이전 밀도 도금 및 37 ℃에서 2.5 시간 동안 인큐베이션 C, 후 루시 페라 측정 찍은 (R 2 = 0.9892). 선형 방정식은 선형 회귀에 대해 해결함으로써 생성 하였다. (C) AAV 표준 곡선은 인간의 폐암 세포 (A549) 상에 첨가하고 잘 (100 μL) 및 루시페라아제 측정 당 2.5 × 104 세포의 밀도로 24 시간 이전 도금 24 시간 후 감염되었다. 힐 방정식은 비선형 회귀를 해결함으로써 생성 하였다. 평균오 복제 곡선과 표준 오차 막대가 표시됩니다의 (R 2 = 0.9926).
토론
여기에 설명 된 루시퍼 라제 기반 접근 용이성, 신속, 최소 장비 필요성, 및 비교적 낮은 비용을 포함하는 다른 기존의 방법에 비해 많은 장점을 제공한다. 이 키에 기여 시리얼 희석 단계의 회피이다. 그럼에도 불구하고,이 용액을 희석 프로토콜 기반 유도체 확실히 가능하며, 최근 높은 처리량 바이러스 화면 (11)에 루시 페라 제 발현 에볼라 역가를 평가하는데 사용 하였다. 본질적으로 더 많은 시간이 소요되고 비용이 더 필요한 경우이지만, 이러한 적응 바이러스 정량 큰 동적 범위를 제공 할 수있다. 높은 처리량 스크린의 문맥에서의 바이러스 역가를 평가하기에 특히 적합 할뿐만 아니라, 우리 원스텝 루시페라아제 기반 바이러스 정량화 방법은 바이러스 복제의 경우의 감염성 비리 온의 정확한 추정치를 생성한다. 또한, 동일한 실험에서 세포 독성 데이터와 함께 발광의 판독은 더 줄표적 세포에 대한 실험 조건의 효과의 완전한 그림은, 온 콜리 틱 바이러스 및 약물 스크린의 맥락에서 특히 유용하다.
여기에 도시 된 예는 하나의 복제 네거티브 가닥 RNA 바이러스를 사용한다; 그러나이 프로토콜은 프로토콜 약간 작은 조정과 바이러스를 복제 및 비 복제 수에 적응 될 수있다. 이는 우두, HSV와 AAV (그림 5 참조)와 같은 DNA 바이러스를 포함한다. 예컨대 백시 니아 바이러스와 같은 세포 내 바이러스 감염 샘플, 종래 정량 (예를 들면, 적어도 하나의 동결 - 해동주기)에 바이러스 분리 단계를 필요로한다. 다른 바이러스에이 기술을 적용하면, 루미 의해 번호판의 판독에 바이러스 상등액 또는 파쇄물의 전송에서 배양 시간을 최적화 할 필요가있다. 이 파라미터는 허용 세포주에서 바이러스의 복제주기 및 P의 강도에 주로 의존 할 것이다romoter 루시 페라 제 발현을 운전. 이것은 가장 최적화 단계에서 완전한 표준 곡선을 사용하여 수행된다. 이를 위해, 하나의 제조 표준 곡선의 여러 복제물을 가진 적절한 허용 세포주를 감염 후의 전사 포인트 각각은 서로 다른 시간에 복제 읽어야한다. 이상적으로, 배양 시간 점은 예상되는 시료 역가 범위에 걸친 LOG (RLU) 및 LOG (역가) 사이의 선형 관계로 연결이 선택된다. VSVΔ51-Fluc의 경우,이는 전형적으로 10 4 PFU / ㎖ -10 7 PFU / ㎖ 5 시간의 배양 시간에 대한. 낮거나 높은 역가가 샘플로부터 예상되는 경우, 하나는 단순히 증가 또는 각각 배양 시간을 줄일 수있다. 대안 적으로, 샘플을 ELISA에 대해 통상적으로 수행되는 많은 범위로 희석 될 수있다.
전술 한 바와 같이,이 방법은 물론 대부분의 단계가 자동화 될 수있는 약물 라이브러리를 이용하여 높은 처리량 약물 스크린을 수행하기에 적합하다. 세포는 전자 도금 할 수 있습니다fficiently 자동화 마이크로 디스펜서를 사용하여, 약물 라이브러리는 96 - 채널 액체 핸들러를 사용하여 첨가 할 수 있으며,이 바이러스는 마이크로 디스펜서를 사용하여 추가 될 수 있고, 플레이트는 자동화 루미로 읽을. 이론적으로,이도 384도 이하의 포맷으로 구성 될 수있다; 그러나이 마지막에 제한은 도금 될 수있는 셀의 수, 주어진 적은 세포 (역가) 관계를 로그에 LOG (RLU)의 선형성에 좁은 범위에 이르게됩니다. 마지막으로, 또는 다른 레사 주린 염료를 사용하여 대사 세포 생존 능력의 평가를 쉽게 바이러스 12과 함께 상승적 바이러스 사멸로 이어질 스크린 또는 화합물의 식별에서 세포 독성 화합물의 차별을 허용 흐름에 혼입 될 수있다. 그럼에도 불구하고, 이러한 방법의 한계는 항상 가능한 것은 아니다 루시퍼 라제 유전자 발현하는 바이러스의 요구 사항, 및 충분히 허용 세포주의 이용을 포함한다. 그러나, 적응 가능한 가능성다른 리포터 유전자와 함께 사용하기위한 방법 (예를 들면, GFP)는 리포터 정량화 방법 잡음비 적당한 선형성 및 신호가 제공. 전반적으로 기재된 하이 스루풋 방법은 다양한 바이러스에 맞도록 수정 및 다양한 애플리케이션에 맞추어 질 수있다.
공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
Vanessa Garcia는 엘리자베스 2세 여왕 온타리오 과학 및 기술 대학원 장학금을, Cory Batenchuk은 자연 과학 및 공학 연구 위원회 펠로우십의 지원을 받습니다.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Dulbeccos' Modified Eagle's Medium (DMEM) | Corning | SH30243.01 | |
| 소태아혈청 | NorthBio Inc. | NBSF-701 | |
| 인산염 완충 식염수 | Corning | 21-040-CV | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-1 | 1 mM 용액, pH 7.3 |
| alamarBlue를 | AbD, Serotec | BUF012B | |
| D-Luciferin, 칼륨염 | Biotium | 10101-2 | |
| 96웰 솔리드 화이트, 플랫 바텀 폴리스티렌, TC 처리 마이크로플레이트 | Corning | 3917 | 384웰 플레이트, 더 높은 처리량을 위해 사용할 수도 있습니다 |
| Synergy Mx | BioTek | SMTBL | 모노크로메이터 마이크로플레이트 리더 |
| Liquidator96 | Mettler Toledo | LIQ-96-200 | 96 팁 수동 피펫팅 시스템 |
| Liquidator96 LTS 필터로 멸균된 팁 | Mettler Toledo | LQR-200F | 선택한 피펫터와 호환되는 모든 멸균 여과 팁이 적절합니다. |
| Microflo | BioTek | 111-206-21 | 96웰 플레이트의 세포 플레이트에 사용 |
| Fluoroskan Ascent FL | Thermo Scientific | 5210450 | 마이크로플레이트 형광측정기 |
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재인쇄 및 허가
