컬렉션, 격리, 인간 자궁 경부 샘플의 유세포 분석

요약

자궁경부에서 림프구와 단핵구를 채취하기 위해 사이토브러시 샘플링을 사용하는 것은 여성 생식기 면역 분석을 위한 샘플을 제공하는 최소 침습 기술입니다. 이 프로토콜에서는 유세포 분석 분석을 위한 cytobrush 샘플 수집 및 면역 세포 분리에 대해 설명합니다.

초록

점막 병원체(HIV 포함)의 공중 보건 중요성에도 불구하고, 특히 여성 생식기(FGT)의 점막 면역에 대해서는 상대적으로 알려진 바가 거의 없습니다. 이성애 전염이 현재 HIV 전염의 지배적인 기전을 나타내고 있고 성병(STI)의 지속적인 확산을 감안할 때 생식기 점막에서 숙주와 병원체 사이의 상호 작용을 이해하는 것이 중요합니다. FGT 면역에 대한 지식의 상당한 격차는 부분적으로 점막 샘플을 성공적으로 수집하고 처리하는 데 어려움이 있기 때문입니다. 충분한 표본 크기로 연구를 용이하게 하기 위해서는 채취 기법이 최소 침습적이고 효율적이어야 합니다. 이를 위해 경추 사이토브러시 샘플 수집 및 후속 자궁경부 단핵 세포(CMC) 분리를 위한 프로토콜이 최적화되었습니다. 체외 유세포 분석 기반 면역 표현형 분석을 사용하면 CMC 림프구/단핵구 집단 빈도 및 표현형을 정확하고 신뢰할 수 있게 정량화할 수 있습니다. 이 기술은 사이토카인, 케모카인 및 항프로테아제를 포함한 용해성 면역 매개체를 포함하는 자궁경부-질 세척제(CVL) 수집과 결합할 수 있으며, 이 모든 것은 질의 항염증 또는 전염증 환경을 결정하는 데 사용할 수 있습니다.

서론

새로운 HIV 감염의 대부분은 전 세계적으로 여성은 2011 년 (UNAIDS ¹⁾ 새로운 감염의 47 %를 대표로, 이성애 전송을 통해 발생한다. 여성의 생식기 (FGT), HIV 및 기타 성병 병원체의 주 진입 포털 중 하나를 이해, 감염을 방지하기 위해 효과적인 전략을 찾는 경로에 높은 중요하다. 생식기 점막의 면역 반응은 분명히 독특하고 말초 혈액 ^2에서 측정 다릅니다. 그러나, FGT에서 면역 역학의 현재의 지식은 기껏해야 제한됩니다. 현재까지, 점막 면역 환경의 연구는 대부분이 감염 다음과 같은 점막 조직에서 초기 이벤트 이후 질병의 진행 ^3,4에 큰 영향을 미칠 것이 분명되고있다 창자 관련 림프 조직 (GALT)에 초점을 맞추고있다. 생식기 점막에서 샘플을 수집하는 것은 큰 도전을 나타내고 락 적어도 부분적으로 책임이있다FGT의 면역학의 이해 K. FGT이 로케일에서 샘플을 수집하고 분석하기위한 효율적인 방법을 필요로 한 독특한 환경의 맥락에서 호스트와 병원체의 면역 동적으로 퍼즐을 해결.

FGT는 두 개의 섹션으로 나누어 져 나팔관, 자궁 내막과 자궁 경부, 그리고 ectocervix을 포함하는 낮은 요로와 질을 포함하는 상부 생식기 (Kaushic 검토를 등....

프로토콜

윤리 문 : 매니토바 대학교 및 나이로비의 케냐 타 국립 병원 / 대학 모두의 연구 윤리 보드는이 연구를 승인하고 서면 동의서는 모든 연구 참가자로부터 얻은 것입니다.

1. 매체의 제조 및 CMC 수집 관

1. 인산염 완충 생리 식염수 (PBS) 용액 (137.93 mM의 염화나트륨, 2.67 밀리미터의 KCl, 8.1 mM의 나 ₂ HPO _4, 1.47 mM의 KH ₂ PO _4)를 준비합니다. 불임에 대한 압력솥. 이것은 몇 달 동안 4 º C에 저장할 수 있습니다.
2. 미리 나누어지는 5 ㎖의 PBS로 50 ML 팔콘 튜브 (수집 할 샘플 당 하나)와 4 º C에서 저장 샘플 수집 시간까지.
3. 저장을위한 세척을 수집하는 샘플 당 2 ~ 4 cryovials 또는 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브 레이블을 지정합니다.
4. 세포 배양 매체를 준비 RPMI 1640 + 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 / 암포 테리 신 B (최종 농도 100 단위 / ㎖, 100 ㎍ / ㎖ 및 250 겨 / ㎖, respectiv더 FCS / FBS와 엘리는 덧붙였다.

결과

다 항목 유동 세포 계측법은 이전에 uncharacterized 조직에서 세포 부분 집합의 표현형과 기능을 해부 할 수있는 강력한 도구입니다. CMC의 샘플 분석은 적절한 게이팅 전략 림프구 및 단핵구 집단 모두에 대한 정보를 얻을 수있다.

대표적인 CMC 게이팅 전략, 일치 PBMC 프로파일에 비해, 그림 2와 같다. FSC-H 플롯 대 FSC-A도 여과 한 후, PBMC에 비해 CMC 샘플에서 매우 널리 퍼진 세포 이중선, 배제 가능 (그림 2A). 품질 관리로 인해 샘플 덩어리로 유량이나 유물의 변화는 쉽게 (그림 2B)를 식별 할 수있는 시간에 게이팅에 의해 흐름 문제의 제거를 포함합니다. 림프구 / 단핵 세포 인구의 식별 PBMC 및 CMC 샘플 (그림 2B) 모두에서 상대적으로 유사합니다. 생존의 염료에 의해 죽은 세포의 제외는 포함을 방지비특이.......

토론

여성의 생식기 (FGT)에서 내성에 대한 지식의 큰 격차를 감안할 때, CMC를의 표현형 분석은 자궁 경부에있는 다수의 림프구 집단에 대한 통찰력의 다양한 배열을 제공 할 수 있습니다. 프로테옴 분석 및 자궁 세척에서 바이러스 부하 측정과 함께, 성병 감염 (STI)의 다른 병원균에 대한 면역은 다양한 인구에서 해부 할 수 있습니다.

기술적 고려 사항 - CMC를가 : 분리 및 CMC 샘플을 성공적으로 염색 도전이 될 수 있습니다. CMC 수집 프로토콜의 최적화는 마지막으로 다음 자궁 스크레이퍼 다음에 먼저 CVL 수집의 효율성 및 cytobrush을 강조했다. 이는 후술 다양한 이유로 샘플 배제 가능성 증가로 인해 말초 혈액 연구, 계산에 비해 계획된 샘플 크기를 증가시키는 것이 중요하다.

욕망의 테스트CMC 샘플에 D 흐름 패널 개시를 공부하기 전에 중요합니다. 그것은 특히 단핵구 게이트에,.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
100 &뮤; 50ml 팔콘 튜브	BD	352360	CMC 처리
RPMI 1640	Hyclone	SH30027.01	CMC 처리
태아 혈청	생명 기술	16000044	CMC 처리
Fungizone	생명 기술	15290-018	CMC 처리
페니실린/스트렙토마이신	시그마	P4333-20ml	CMC 처리
50ml 팔콘 튜브	피셔	14-959-49A	CMC 처리
혈액 은행 일회용 전송 피펫	피셔	13-711-6M	CMC 처리
Cytobrush plus	Cooper 외과	C0121	CMC 샘플링
일회용 자궁 경부 스크레이퍼	빠른 의료	2183	CMC 샘플링
15ml 팔콘 튜브	피셔	14-959-70c	CVL processsing
1.5 ml tube Eppendorf	Fisher	05-402-18	CVL storage
LIVE/DEAD Fixable Cell Stain Kit	Invitrogen	Various	Flow cytometry 시약
Fixation buffer (4% PFA)	BD	554655	Flow cytometry regeant
IgG mouse	Sigma	I8765	유세포 분석 regeant