여기에서 우리는 커플이 프로테오믹스 기술, 즉 전기 영동 (2DE)와 질량 분석기 (MS) 2 차원, 차동 차 샘플 두 개 이상의 그룹 중 / 번역 후 변형 된 단백질을 발현 식별 할 수있는 프로토콜을 설명합니다. 이 방법은, 실험과 함께 기능성, 예후 마커 / 치료 대상의 식별 및 특성을 허용한다.
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이 논문에서
요약
초록
종양의 개시 및 진행에 관여하는 분자의 확인은 환자의 임상 적 관리를 위해, 그 결과로서, 질병의 이해를위한 기초 생물학이고. 본 연구에서 우리는 만성 림프 구성 백혈병 (CLL)의 진행에 관여하는 분자의 식별을위한 최적화 프로테오믹스 방법을 설명한다. 구체적으로, 백혈병 세포 용 해물은 2 차원 전기 영동 (2DE)에 의해 해결되고 2DE 젤의 "명소"로 시각화. 단백질체지도의 비교 분석은 질량 분석 (MS)에 의해 격리 포착하고 식별 (풍부하고 번역 후 변형의 관점에서) 서로 다르게 발현 된 단백질의 식별을 할 수 있습니다. 확인 된 후보의 생물학적 기능은 우리가 주 백혈병 세포에 최적화 된 것으로, 다른 분석 (즉, 마이그레이션, 접착력과 F-액틴의 중합)에 의해 테스트 할 수 있습니다.
서론
만성 림프 구성 백혈병 (CLL), 서양 국가에서 가장 일반적인 성인 백혈병, 단일 클론 양성 CD5 + B 림프구의 축적에서 파생 임상 적으로 매우 이질적이다. 그것은 단일 클론 B 세포 림프구 (MBL) 1,2,3 정의 사전 백혈병 형태로서 존재할 수있다. 질병 중 하나 나태한 임상 경과와 함께 나타날 수있는 다른 경우에, 그 치료를 필요로하기 전에 년 동안 안정적으로 유지하거나 실력을 예후 진보적 chemorefractory 질환 등의 치료에도 불구하고. 마지막으로, 자주 치명적인 고 등급 림프종 (리히터 증후군-RS) 2,3,4로 진행 할 수 있습니다. 좋고 나쁜 예후, 질병의 결과 및 생존 예측 인자에 대한 보완적인 정보를 제공 예후 인자의 집합을 기반으로 : 환자는 일반적으로 두 가지 주요 부분 집합으로 분류된다. 임상 적 이질성 가능성이 생물학적 이질성을 반영한다. 유전, 미세 환경 및 CE의 수llular 요인은 더 통합 메커니즘 5 발견되고 있지만 질병의 발병 기전에 동의하는 것으로 나타났다. 상세하게는, 몇몇 연구는 질병의 임상 경과의 차이가 부분적으로 예후 값 6,7,8있는 일부 생물학적 마커의 존재 (또는 부재)에 의해 설명 될 수 있음을 증명하고있다. 이러한 데이터는....
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프로토콜
참고 : 모든 조직 샘플이 산 라파엘 병원 (밀라노, 이탈리아)의 기관 심사위원회의 승인을 얻을 수 있었다.
1 인간의 조직 샘플 및 세포 정제 (그림 1)
참고 : 백혈병 림프구 멀리건 등에 따라, CLL 환자의 말초 혈액 (PB)에서 얻은 진단을받은 9.
PB 1.1) 백혈병 세포 분리
- 나트륨 헤파린과 vacutainer 혈액 수집 튜브에 PB를 수집합니다.
- 15 ML 튜브에 혈액을 전송하고 전체 혈액의 50 μL / mL로에서 인간 B 세포 농축 칵테일을 추가합니다. 잘 혼합하고, 실온에서 20 분 배양한다.
- , PBS + 2 % FBS 같은 부피로 샘플을 희석 있는지 인터페이스를 중단하지 않도록하고, 피콜 위에 부드럽게 조심스럽게 오버레이 피를 섞는다. 15 ML의 t에서 희석 된 시료의이 부분에 피콜의 적어도 한 부분을 사용하여 (즉, 4 ㎖의 피콜는 + 10 ml의 혈액우베).
- 없이 브레이크와 20 분 동안 실내 온도 (20 ° C에서)에서 400 XG에 원심 분리기. 단핵 세포는 계면 것이다.
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결과
우리는 차 백혈병 B 세포 만성 림프 구성 백혈병 환자의 PB를 형성 고립 된 우리는 프로테옴지도를 분석 하였다. 샘플 (N = 104)는 각 환자 (좋은 예후 대 나쁜 예후)과 2DE 젤의 비교 분석이 수행 된 임상 기능에 따라 두 가지 주요 부분 집합으로 그룹화 하였다.
분석을 허용 차등이 부분 집합 사이에 표현 명소의 식별 (번역 후 변형의 변화를 암시하는 존재 / 부재 또는 겔에 변화의 관점에서, n은 ≈ 16). 우리는 MALDI 판에 발견 된 2DE 젤에서 감소 및 알킬화되고, 단백질은 트립신 상층 액에서 펩타이드로 분해 된 후 선택한 지점을 절제. 스펙트럼은 MALDI-TOF 보이저 DE에서 획득 하였다. 그 결과 피크 목록은 마스코트와 심오한에 제출했다. 특정 질량 공차 내의 대중 간주 단백질로 데이터베이스의 펩티드 서열을 할당하고 조립이 특정 확률 점수 (그림 3)을 통과하면 확인했다. 이 분석함으로써 우리는 주로.......
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토론
이 원고의 목적은이 방법은 다른 질병 및 / 또는 다른 종류의 시료 16 ~ 18로 확장 될 수있다하더라도, CLL의 병인에 관여하는 분자의 식별을 위해 최적화 된 프로토콜을 설명하는 것이다. 나쁜 예후 19 대 좋은 CLL 환자의 두 부분 집합의 프로테옴 프로파일을 비교함으로써, 우리는 그들이 HS1의 인산화 상태에 차이가 있고 정품 인증은 백혈병 세포의 부착 및 이동 용량 영향을 미친다는 것을 보여 주었다.
다른 방법에 대해서는, 원고, 2DE 젤, MS에서 제시 단백체 기술의 주요 장점은, 그들이 셀 프로테옴의 전체 지문을 제공하며, 가장 중요한 그들이 단백질의 번역 후 변형에 대한 정보를 제공한다는 것이다. 차등 적 인산화 또는 당화 아르 단백질은 젤에서 자신의 위치를 변경하고, 가능성이 세포에 자신의 활동을 변경합니다.
"ove_content는> 또한, 우리는 세포 골격 기능을.......액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
우리는 림프 악성 종양 단위, 엘리사 열 하켄, 리디아 Scarfò, 마시모 알레, 안토니오 콘티, 안젤라 BACHI, 안젤라 카타 네오 감사합니다.
이 프로젝트에 의해 지원되었다 : Associazione Italiana의 당 라 Ricerca 술 Cancro AIRC (탐정 그랜트와 특별 프로그램 분자 임상 종양 - 5 밀레 번호 당 9,965)
CS 및 BA는 연구 설계 실험을 수행, 데이터를 분석하고 원고를 썼다. MTSB는 UR, FBPR 원고를 작성하는데 도움을. PG와 FCC는 연구 제공 환자의 샘플과 임상 데이터를 디자인했다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 아세토니트릴 | 머크 | 61830025001730 | |
| 암모늄 바이카보네이 | SIGMA | A6141-500G | |
| 1,4-디티오에리스리톨 | SIGMA | D9680-5G | |
| 요오도아세트아미드 | SIGMA | I6125-25G | |
| 염화칼슘 이수화물 | SIGMA | 223506-25G | |
| 트립신, 시퀀싱 등급 | ROCHE | 11418475001 | |
| α- 시아노-4-하이드록시신남산 | SIGMA | C2020-10G | |
| 트리플루오로아세트산 | SIGMA | T6580 | |
| ZipTipµ-C18 | MILLIPORE | ZTC18M096 | |
| RosetteSep 인간 B 세포 농축 칵테일 | STEMCELL | 15064 | |
| PBS | EUROCLONE | ECB4004L | |
| FBS | DOMINIQUE DUTSCHER | S1810 | |
| 림포렙 | SENTINEL DIAGNOSTICS | 1114547 | |
| Trypan 블루 | SIGMA | T8154 | |
| CD19 | BECKMAN COULTER | 082A07770 | ECD |
| CD5 | BECKMAN COULTER | 082A07754 | PC5 |
| CD3 | BECKMAN COULTER | 082A07746 | FITC |
| CD14 | BD | 345785 | PE |
| CD16 | BECKMAN COULTER | 082A07767 | PC5 |
| CD56 | BECKMAN COULTER | 082A07789 | PC5 |
| Ettan IPGphor 3 등전 초점 장치 | GE-Healthcare | 11-0033-64 | |
| Urea | SIGMA | U6504 | |
| Tris-Hcl 버퍼 | BIO-RAD | 161-0799 | |
| CHAPS | SIGMA | C2020-10G | |
| DTT | SIGMA | D9163-5G | |
| IPGstrips | GE-Healthcare | 17-1233-01 | 선형 pH 4-7 18cm |
| IPGbuffer | GE-Healthcare | 17-6000-86 | pH 4-7 |
| 글리세롤 | SIGMA | G6279 | |
| PROTEAN II XL 세포 | BIO-RAD | 165-3188 | |
| SDS | INVITROGEN | NP0001 | |
| Acrilamide | BIO-RAD | 161-0156 | |
| Agarosio | INVITROGEN | 16500 | |
| 메탄올 | SIGMA | 32213 | |
| 아세트산 | VWR | 631000 | |
| 포르말린 | BIO-OPTICAL | 05-K01009 | |
| 에탄올 | VWR | 9832500 | |
| 티오황산나트륨 | FLUKA | 72049 | |
| 질산은 | FLUKA | 85228 | |
| 분자 역학 개인 SI 레이저 농도계 | Amersham Biosciences | ||
| ImageMaster 2D Platinum 5.0 | Amersham Biosciences | ||
| 탄산나트륨 | MERCK | A0250292 | |
| MALDI-TOF Voyager-DE STR | Applied Biosystems | ||
| Data Explorer 소프트웨어(버전 3.2) | Applied Biosystems | ||
| 트랜스웰 챔버 6.6mm 직경 | CORNING | 3421 | |
| RPMI | 유로클론 | ECB2000L | L-글루타 |
| 민 겐타마이신 | SIGMA | G1397 | |
| SDF-1 | PREPROTECH | 300-28A | |
| 평면 바닥 96웰 플레이트 | BECTON DICKINSON | 353072 | |
| BSA | 산타 크루즈 | 9048-46-8 | |
| ICAM-1 | R & D Systems | 720-IC | |
| CMFDA | Life Thechnology | C7025 | Green |
| IgM | SOUTHERNBIOTECH | 2020-02 | |
| Paraformaldehyde | SIGMA | P6148 | |
| Saponine | SIGMA | S-7900 | |
| Phalloidin | 생명 Thechnology | A12379 | 알렉사 플루어 488 |
참고문헌
- Caligaris-Cappio, F., Ghia, P. Novel insights in chronic lymphocytic leukemia: are we getting closer to understanding the pathogenesis of the disease. J Clin Oncol. 26, 4497-4503 (2008).
- Rawstron, A. C., et al. Monoclonal B-....
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