단백질 기능에 2DE - 젤 지점에서 만성 림프 구성 백혈병에 HS1에서 배운 레슨

요약

여기에서 우리는 커플이 프로테오믹스 기술, 즉 전기 영동 (2DE)와 질량 분석기 (MS) 2 차원, 차동 차 샘플 두 개 이상의 그룹 중 / 번역 후 변형 된 단백질을 발현 식별 할 수있는 프로토콜을 설명합니다. 이 방법은, 실험과 함께 기능성, 예후 마커 / 치료 대상의 식별 및 특성을 허용한다.

초록

종양의 개시 및 진행에 관여하는 분자의 확인은 환자의 임상 적 관리를 위해, 그 결과로서, 질병의 이해를위한 기초 생물학이고. 본 연구에서 우리는 만성 림프 구성 백혈병 (CLL)의 진행에 관여하는 분자의 식별을위한 최적화 프로테오믹스 방법을 설명한다. 구체적으로, 백혈병 세포 용 해물은 2 차원 전기 영동 (2DE)에 의해 해결되고 2DE 젤의 "명소"로 시각화. 단백질체지도의 비교 분석은 질량 분석 (MS)에 의해 격리 포착하고 식별 (풍부하고 번역 후 변형의 관점에서) 서로 다르게 발현 된 단백질의 식별을 할 수 있습니다. 확인 된 후보의 생물학적 기능은 우리가 주 백혈병 세포에 최적화 된 것으로, 다른 분석 (즉, 마이그레이션, 접착력과 F-액틴의 중합)에 의해 테스트 할 수 있습니다.

서론

만성 림프 구성 백혈병 (CLL), 서양 국가에서 가장 일반적인 성인 백혈병, 단일 클론 양성 CD5 ⁺ B 림프구의 축적에서 파생 임상 적으로 매우 이질적이다. 그것은 단일 클론 B 세포 림프구 (MBL) ^1,2,3 정의 사전 백혈병 형태로서 존재할 수있다. 질병 중 하나 나태한 임상 경과와 함께 나타날 수있는 다른 경우에, 그 치료를 필요로하기 전에 년 동안 안정적으로 유지하거나 실력을 예후 진보적 chemorefractory 질환 등의 치료에도 불구하고. 마지막으로, 자주 치명적인 고 등급 림프종 ​​(리히터 증후군-RS) ^2,3,4로 진행 할 수 있습니다. 좋고 나쁜 예후, 질병의 결과 및 생존 예측 인자에 대한 보완적인 정보를 제공 예후 인자의 집합을 기반으로 : 환자는 일반적으로 두 가지 주요 부분 집합으로 분류된다. 임상 적 이질성 가능성이 생물학적 이질성을 반영한다. 유전, 미세 환경 및 CE의 수llular 요인은 더 통합 메커니즘 ^{5 발견되고} 있지만 질병의 발병 기전에 동의하는 것으로 나타났다. 상세하게는, 몇몇 연구는 질병의 임상 경과의 차이가 부분적으로 예후 값 ^6,7,8있는 일부 생물학적 마커의 존재 (또는 부재)에 의해 설명 될 수 있음을 증명하고있다. 이러한 데이터는 질병의 생물학을 더 잘 이해가 예후 표지자 및 치료 대상 모두의 식별 정보를 이용하여, 임상 병리학의 관리를 위해 추가적인 힌트를 제공 할 수 있다는 것을 보여 주었다.

본 연구의 목표는 다른 단백체 기법의 조합은 CLL의 발병과 진행에 관여하는 단백질의 동정에 사용할 수있는 방법을 보여주기위한 것이다. 우리의 접근은 함께 기본적인 단백질체 및 임상 데이터 ^{(5)에 가입} 할 수 있음을 보여준다.

선택된 환자에서 본 워크 플로우에서, 주 백혈병 세포(나쁜 예후가 좋은 VS) 격리하고 세포 용 해물이어서 단백체 맵을 얻기 위해 사용된다. 2DE 따라서 각 단백질의 생물학적 활성에 대한 간접적 인 정보를주는 번역 후 변형을 포함하는 세포 집단의 프로테옴 프로파일의 특성화를 허용한다. 전체 세포 용 해물은 그들의 분자량에 기초하여 단백질을 해결 폴리 아크릴 아미드 겔상에서 실행 번째 차원이어서, 등전점에 기초하여 제 적합 실행에 의해 해결된다. 프로테오믹스 맵의 비교 분석은 차등 발현 된 단백질의 동정을 허용 (모두 풍부하고 번역 후 변형의 관점에서) 절단 및 질량 분광법에 의해 분석 될 수 겔 반점. 각 후보의 역할은 다음 서로 다른 분석에 의해 악용 될 수 있습니다.

현재 원고 CLL에 제한이 방식은, 쉽게 따라서 proteomi에 대한 정보를 제공하는 다른 질병 / 샘플로 확장 될 수있다(최저 대 비자극, 야생형 대 자극 정상 대 병리 즉,) 두 군 사이에 C / 생물학적 차이.

프로토콜

참고 : 모든 조직 샘플이 산 라파엘 병원 (밀라노, 이탈리아)의 기관 심사위원회의 승인을 얻을 수 있었다.

1 인간의 조직 샘플 및 세포 정제 (그림 1)

참고 : 백혈병 림프구 멀리건 등에 따라, CLL 환자의 말초 혈액 (PB)에서 얻은 진단을받은 ^9.

PB 1.1) 백혈병 세포 분리

1. 나트륨 헤파린과 vacutainer 혈액 수집 튜브에 PB를 수집합니다.
2. 15 ML 튜브에 혈액을 전송하고 전체 혈액의 50 μL / mL로에서 인간 B 세포 농축 칵테일을 추가합니다. 잘 혼합하고, 실온에서 20 분 배양한다.
3. , PBS + 2 % FBS 같은 부피로 샘플을 희석 있는지 인터페이스를 중단하지 않도록하고, 피콜 위에 부드럽게 조심스럽게 오버레이 피를 섞는다. 15 ML의 t에서 희석 된 시료의이 부분에 피콜의 적어도 한 부분을 사용하여 (즉, 4 ㎖의 피콜는 + 10 ml의 혈액우베).
4. 없이 브레이크와 20 분 동안 실내 온도 (20 ° C에서)에서 400 XG에 원심 분리기. 단핵 세포는 계면 것이다.
5. 조심스럽게 세포를 복구하고 새로운 튜브에 배치 할 수있는 인터페이스를 대기음. 5 분 동안 어둠 속에서, 300 XG에 PBS 원심 분리기 회 4 ° C를 세포를 씻으십시오. 펠렛은 아래에 있습니다.
6. 상층 액을 버린다. 앞뒤로 손가락 튜브를 가볍게 치면 남은 상등액 펠렛을 재현 탁. (10 % 태아 송아지 혈청 및 15 ㎎ / ㎖ 젠타 마이신으로 보충 된 RPMI 1640) 10 ml의 완전한 RPMI 배지로 희석하고 펠렛을 트리 판 블루 배제 방법을 사용하여 세포를 카운트.

1.2) 순도 평가

참고 : 모든 준비의 순도는 99 % 이상으로 항상 있어야합니다.

1. 다음과 같은 항체 정제 된 세포 현탁액 100 ㎕를 품어 (시판, 재료의 표 참조) CD3 _FITC를 (5 μL / TESt), CD14 _PE (5 μL / 테스트), CD19 _ECD (6 μL / 테스트), CD16-CD56 _PC5 (2 μL / 테스트), CD5 _PC7에서 4 ° C에서 20 분 동안 (4 μL / 테스트) FACS 튜브.
2. (300 XG에 5 분 동안 원심 분리기) PBS의 4 ㎖의 시료를 세척하고 음모에 그들의 표면에 CD19와 CD5-Express를 공동 CLL 세포 (> 99 %)의 %를 흐름 cytometry.Check하여 순도를 확인 도 1에 나타내는 (6). 준비가 거의 0이어야한다 플롯에 CD3, CD14 및 CD16-56의 %를 확인하여 NK, T 림프구 및 단핵구의 거의없는 지 확인합니다.

1.3) 샘플 저장

1. 프로테오믹스 연구를 들어, 10 분 동안 300 XG에 25 × 10 ⁶ 1.5 ML 튜브에 세포, 원심 분리기 세포를 수집 4 시간 동안 뜨는 및 동결 건조 펠릿을 폐기합니다. -80 ° C에서 사용할 때까지 유지합니다.
2. 전체 RPMI에서 검증 분석, 재현 탁 세포 (수량이 더 분석에 따라 들어선택) 및 4 단계를 진행합니다.

2 이차원 전기 영동 (2-DE) (그림 2)

2.1) Isoelectrofocusing (IEF)

1. 380 ㎕의 2-DE 버퍼 (RBthio 용액 344 μL의 최종 볼륨 CLL 세포 펠렛을 용해 (구 M 우레아, 10 mM 트리스, 4 % CHAPS), 65MM DTT의 30 ㎕의 2 % IPG 버퍼 ampholine의 6 μL 산도 4-7).
2. 18 IPG 스트립 (산도 4-7)에 단백질 시료 (1 mg)을 적용하고 콘티 외 의해 설명 된대로 표준 프로토콜 다음 IEF를 수행합니다. ⁽¹⁰⁾
3. RT에서 15 분 동안 신선한 DTT의 2 %로 보충, (6 M 우레아, 30 % 글리세롤, 2 % SDS를 함유하는 50 mM의 pH를 8.8 트리스 - 염산 완충액 EB) 평형 완충액 2 ㎖에 스트립을 평형화. 취소 EB + DTT 및 EB 2 ㎖를 추가 2.5 % 요오도 아세트 아미드로 보충. 락 플랫폼에서 실온에서 15 분 동안 품어.

2.2) SDS-PAGE

1. 제거 젤을 건드리지 않고 종이에 스트립을 건조EB의 과잉. 9~16% 그라데이션 SDS-PAGE 겔의 상단에 각 스트립을로드합니다. SDS-전기 영동 버퍼 (25 mM의 트리스, 글리신 192 밀리미터, V / w SDS 0.1 %) 겔의 상단에이 스트립의 로딩을 용이하게하기의 작은 볼륨을 추가합니다.
2. 스트립의 부유를 방지 한천 용액 (0.8 %)의 ~ 5 ㎖를 첨가하여 겔을 봉쇄 한 다음, 전기 영동 장치를 조립하고 SDS-전기 영동 완충액으로 채운다. 4 ° C에서 4 시간 동안 60mA / 젤에서 실행을 수행합니다.
3. 전기 영동 장치에서 젤을 제거하고 적절한 염색 상자에 넣습니다.

제조 젤 2.3) 실버 스테인

해결사	50 % 메탄올 12 % 아세트산 0.05 % 포르말린	2 시간 (또는 야간) *
WASH BUFFER	35 % Ehanol	20 분 (단계를 세 번 반복)
과민성	0.02 % 티오 황산나트륨	2 분
WASH	H 2 O	5 분 (단계를 세 번 반복)
질산은	0.2 % 질산은 0,076퍼센트 포르말린	20 분
WASH	H 2 O	1 분 (두 번 단계를 반복)
개발자	6 % 탄산나트륨 0,0004 % 티오 황산나트륨 0.05 % 포르말린	염색은 충분까지
STOP	50 % 메탄올	30 분
	* 둘의 시간은 최소 시간은 단백질 고정이 필요합니다

표 1.

참고 : 단백질 반점은 MS 호환 실버 스테인 ^(11)와 젤을 염색하여 시각화 할 수 있습니다. 모든 솔루션은 필요실버 염색은 표 1에 나열되어 있습니다.

1. 각 솔루션 / 겔의 약 200 ML을 준비하고 표 1과 같이 처리 할 것. 조심스럽게 겔을 포함하는 염색 상자에 각 솔루션을 추가합니다. 락 플랫폼에서 모든 인큐베이션을 수행합니다.
2. 염색 후 정지 용액을 제거 및 수집 될 때까지 1 % 아세트산 용액에 겔을 떠난다.

2.4) 젤 수집 및 분석

1. 염색 3 일 이내에 농도계를 사용하여 높은 해상도의 이미지를 획득.
2. 2-DE 젤 용 소프트웨어를 이용하여 2-D 단백질의 패턴을 분석한다.
   참고 :이 소프트웨어는 빠르고 신뢰할 수있는 이미지 비교를 할 수 있습니다.
   1. 상황에 맞는 메뉴에서 "새 프로젝트를 만듭니다"를 선택하여 프로젝트를 만듭니다. 폴더를 생성하고,이 .tif와 "수입 젤 이미지"를 선택 .png를하여 젤을 가져옵니다. 또는 .gel 확장.
   2. 젤은 수입 w​​orksp에 추가하면에이스, 메뉴에서 "검색 편집> 자리를>"자리 감지 젤을 선택하고 선택하여 자동 자리 감지를 수행합니다.
   3. 다음으로, 메뉴 "빼기 배경"에서 선택하여 배경 빼기를 수행합니다. 주 : 여러 겔과 비교하고, 정량적 및 / 또는 정 성적 분석에 의한 차이 또는 유사성을 검출하는 것이 가능하다 후있다.

MALDI-TOF MS 분석에 의해 3 단백질 식별 (그림 3)

3.1) 단백질 소화

1. 중 (깨끗한 메스로 절단) 수동 또는 자동 절제하여 젤 관심의 물과 소비세 관광 명소와 젤을 씻어.
2. , 물 (100 ~ 150 μL)와 젤 입자를 세척 스핀 다운 (400 XG에 30 초)와 액체를 제거합니다.
3. 겔 조각 CH ₃ CN의 (겔 볼륨에 따라 다름) 동일한 볼륨을 추가하고 젤 조각이 줄어들 때까지 10 ~ 15 분 동안 기다립니다. 겔 입자를 건조 전NA 진공 원심 분리기.
4. 50 mM의 NH ₄ HCO _3에 희석 된 10 mM Dithioerythritol의 75 ~ 100 μl를 추가하고 56 ° C (감소 단계)에서 30 분 동안 배양한다. 단계 3.1.3에서 설명 된 바와 같이 다시 CH ₃ CN으로 겔 부분을 수축.
5. mM의 요오도 아세트 아미드가 50 mM의 NH ₄ HCO _3에 희석과 어둠 속에서 실온에서 20 분 동안 배양 용액 (55)의 75 ~ 100 μl를 추가하여 알킬화를 진행합니다.
6. 단계 3.1.3에서 설명 된 바와 같이 겔 조각을 커버하기에 충분한 양을 사용 CH ₃ CN으로 한번 겔 조각 수축. 진공 원심 분리기에서 건조.
7. 20 분 동안 4 ° C에서 ₄ HCO ₃ 25 mM의 _NH, 5 mM의 염화칼슘 _{2, 12,5 NG} 트립신 _/ μl를 포함하는 버퍼에 입자를 재수. 겔 조각을 충당하기 위해 버퍼의 충분한 볼륨을 사용합니다. 겔 조각에서 해제 흡수 상층 액을 제거하고 25 mM의 NH ₄ HCO _3, 5 mM의 _{염화칼슘이} 트립신없이 외부 전문가위원회를 추가젤을 어.
8. 하룻밤 37 ° C에서 적어도 3 시간 (펩타이드 소화에 필요한 최소 시간)에에서 샘플을 둡니다.

3.2) 질량 분광법 분석 (말린 방울 기법)

1. 스테인리스 MALDI 플레이트 상에 스팟의 각 샘플 1 ㎕를 분취하고 50 % CH ₃ CN, 0.1 % TFA에서 제조 α-시아 노 -4 - 히드 록 시신 행렬로서 산의 1 μL와 혼합한다.
2. MALDI-TOF 질량 분석기에 질량 스펙트럼을 얻습니다. 레이저 강도 신호의 포화를 방지하기 위해 또는 신호를 증가시키기 위해 조정, 스폿 당 약 200 스펙트럼을 축적. 데이터 탐색기 소프트웨어를 통해 프로세스의 스펙트럼은 아래에 설명 된대로
   1. .DAT 파일을 가져와 "과정> 기준 수정"을 선택하여베이스 라인 보정을 수행합니다. "프로세스> 질량 보정> 수동 보정을 선택하여 트립신 자기 분해 제품 및 매트릭스 피크를 사용하여 질량을 보정; m / z 855.1와 2163.1 B에 가까운 피크를 선택y를 누른 후, "음모"를 클릭하고 수동 교정 창에 "교정을 적용", 드래그와 해당 참조 질량을 선택 떠났다.
   2. ( "활성 추적을 중복> 디스플레이") 활성 추적을 복제, 피크 검출에 대한 임계 값 ( "피크> 피크 검출")을 조정 새 추적을 선택하고 deisotoping ( "피크> deisotoping")을 수행합니다. 매크로 "getpeaklist"를 사용하여, 식별을 위해 사용되는 대중의리스트를 생성한다. 필요한 경우 수동으로 목록을 정리하고 더 나은 식별을 얻을 수있는 봉우리로 고른 잡음 신호를 제거합니다.
3. 검색 엔진 ^(12)으로 심오하고 마스코트를 사용하여 포괄적 인 비 중복 단백질 데이터베이스를 검색하여 단백질을 식별합니다.
   1. 모든 검색에 다음 매개 변수를 사용하여 하나는 고정 수정 및 initi 펩티드 당 분열, 변수 수정과 같은 메티오닌 산화, 시스테인 carbamidomethylation를 놓쳤다50 ppm으로 알 질량 공차.

(4) 세포 골격 활동 분석 실험 (그림 4)

참고 : 재현 탁 세포는 완전한 RPMI (10 ⁶ 세포 / 200 μL)에서 1 단계에서 정제.

4.1) 마이그레이션 분석. 이 테스트는 분석 세포 (림프구)의 철새 용량의 정량화 할 수 있습니다. 6.5 mm 직경과 5.0 μm의 세공 크기의 트랜스 웰 챔버를 사용 중으로 분석을 수행한다. 상이한 세포 유형의 경우 기공의 크기와 이동 시간 (단계 4.1.3)를 최적화한다.

1. 각각 유발과 자발적인 이동을 측정하기 위해 또는 특정 자극 (즉, SDF-1)없이 완전한 RPMI 600 μl를 첨가하여 하부 챔버를 준비한다.
2. 그 위에 상부 챔버를 넣고 시스템이 배양기에서 37 ° C에서 30 분 동안 평형 수 있습니다.
3. 종자 10 ⁶ 세포 / 다락방에서 200 μL (총 세포 수)와 배양인큐베이터에서 37 ° C에서 4 시간 동안 접시입니다.
4. , 상부 챔버를 제거하고 하부 챔버에서 미디어를 수집하고 1 ml의 PBS로 한번 하부 챔버를 씻으십시오. 튜브에 PBS를 수집합니다.
5. 오분 300 XG에 원심 분리기, 500 ㎕의 PBS에서 뜨는에 resuspend 폐기합니다.
6. 유세포, 인수 1 분 후에 마이그레이션 셀의 개수를 카운트. 절연 세포군 경우에는 어떠한 표면 항체를 추가 할 필요가 없다. 셀 사이드 산란 및 계산에 사용하는 번호는 1 분, 시각화 이벤트의 수를 고려하여 BI 차원 도트 플롯에 셀의 수를 확인한다.
7. 마이그레이션 지수 (MI)을로 계산 :
   

4.2) 접착 분석. 이 분석은 세포의 부착 능력을 측정한다. 회 반복 분석을 수행합니다.

1. 사전 코트 96-아LS의 50 μL 플레이트 (바닥이 평평한) / 웰 중 하나 밤새 4 ° C에서, PBS에 희석 2 % BSA-PBS (배경) 또는 1 μg ICAM-1.
2. PBS로 두 번 접시를 세척하고 37 ℃에서 1 시간 동안 2 % BSA-PBS (100 μL / 웰)에 추가하여 비 특정 사이트를 차단합니다.
3. 전체 RPMI에서 5 × 10 ⁶ / ㎖에서 그 동안의 재현 탁 세포에서 1 ㎜ CMFDA 녹색 세포 추적기로 레이블을 37 ° C에서 30 분을 품어.
4. 차단 솔루션 (스텝 4.2.2) 폐기 후 1 × 10 ⁶ 세포 / 웰 사전 코팅 된 웰에 추가하고 37 ° C에서 1 시간 배양.
5. ELISA 리더를 사용하여 접착 성을 정량화 (인가 전압 필터 : 485 nm의 방출 필터 : 535 nm의). 총 입력 (INPUT)에 첫 번째 측정을 수행합니다.
6. 2 % BSA-PBS 부드럽게 접시를 씻으 (200 μL / 웰)의 4 배 (배). 각 세척 단계 (접착 _배) 후 판의 읽기를 수행합니다.
7. 각 측정에 대한 배경 공제 한 후, 특정 ADHES을 계산이온 (접착력) :
   

4.3) 중합 분석. 이 F-액틴의 중합을 정량화 비색 분석이다. 회 반복 분석을 수행합니다.

1. 재현 탁 1 × ^ 10 분 6 미리 예열 완료 RPMI 100 ㎕의 세포와 특정 자극을 추가 (즉, α-IgM 항체 20 μg / mL)에서 세척 하였다.
2. 4 % 파라 포름 알데히드의 400 μL로 반응을 중지하고 실온에서 10 분 동안 세포를 고정한다.
3. (5 분, 4 ° C에 300 XG에 원심 분리기) PBS로 3 회 반복한다.
4. 2 분 동안 얼음에 PBS-saponine 0.2 % (200 μL)와 함께 뜨는 Permeabilize 하시려면 세포를 폐기하십시오.
5. (5 분, 4 ° C 100 XG에 원심 분리기) PBS-saponine 0.1 %로 3 회 세척 100 ㎕의 PBS-saponine 0.1 %에서 뜨는에 resuspend 폐기합니다.
6. t 방에서 30 분 동안 Phalloidin Alexafluor-488 (3 μg / ml)으로 염색어둠 속에서 온도.
7. PBS-0.1 % saponine로 3 회 반복한다. 300 ㎕의 PBS에서 뜨는에 resuspend 폐기하십시오.
8. Phalloidin의 평균 형광 강도 (MFI)를 계산, 유동 세포 계측법에 의해 F-액틴의 양을 정량화. 형광 강도에 기초하여 히스토그램을 생성하기 위해 단일 ​​차원 플롯에서 생성 된 데이터를 분석하여, MFI 값 그래프 리포트에 나타낸다.
9. F-액틴의 중합 (Δ F-액틴) 등을 측정한다 :
   

결과

우리는 차 백혈병 B 세포 만성 림프 구성 백혈병 환자의 PB를 형성 고립 된 우리는 프로테옴지도를 분석 하였다. 샘플 (N = 104)는 각 환자 (좋은 예후 대 나쁜 예후)과 2DE 젤의 비교 분석이 수행 된 임상 기능에 따라 두 가지 주요 부분 집합으로 그룹화 하였다.

분석을 허용 차등이 부분 집합 사이에 표현 명소의 식별 (번역 후 변형의 변화를 암시하는 존재 / 부재 또는 겔에 변화의 관점에서, n은 ≈ 16). 우리는 MALDI 판에 발견 된 2DE 젤에서 감소 및 알킬화되고, 단백질은 트립신 상층 액에서 펩타이드로 분해 된 후 선택한 지점을 절제. 스펙트럼은 MALDI-TOF 보이저 DE에서 획득 하였다. 그 결과 피크 목록은 마스코트와 심오한에 제출했다. 특정 질량 공차 내의 대중 간주 단백질로 데이터베이스의 펩티드 서열을 할당하고 조립이 특정 확률 점수 (그림 3)을 통과하면 확인했다. 이 분석함으로써 우리는 주로...

토론

이 원고의 목적은이 방법은 다른 질병 및 / 또는 다른 종류의 시료 ^{16 ~ 18로} 확장 될 수있다하더라도, CLL의 병인에 관여하는 분자의 식별을 위해 최적화 된 프로토콜을 설명하는 것이다. 나쁜 예후 ¹⁹ 대 좋은 CLL 환자의 두 부분 집합의 프로테옴 프로파일을 비교함으로써, 우리는 그들이 HS1의 인산화 상태에 차이가 있고 정품 인증은 백혈병 세포의 부착 및 이동 용량 영향을 미친다는 것을 보여 주었다.

다른 방법에 대해서는, 원고, 2DE 젤, MS에서 제시 단백체 기술의 주요 장점은, 그들이 셀 프로테옴의 전체 지문을 제공하며, 가장 중요한 그들이 단백질의 번역 후 변형에 대한 정보를 제공한다는 것이다. 차등 적 인산화 또는 당화 아르 단백질은 젤에서 자신의 위치를​​ 변경하고, 가능성이 세포에 자신의 활동을 변경합니다.

"ove_content는> 또한, 우리는 세포 골격 기능을...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
아세토니트릴	머크	61830025001730
암모늄 바이카보네이	SIGMA	A6141-500G
1,4-디티오에리스리톨	SIGMA	D9680-5G
요오도아세트아미드	SIGMA	I6125-25G
염화칼슘 이수화물	SIGMA	223506-25G
트립신, 시퀀싱 등급	ROCHE	11418475001
α- 시아노-4-하이드록시신남산	SIGMA	C2020-10G
트리플루오로아세트산	SIGMA	T6580
ZipTipµ-C18	MILLIPORE	ZTC18M096
RosetteSep 인간 B 세포 농축 칵테일	STEMCELL	15064
PBS	EUROCLONE	ECB4004L
FBS	DOMINIQUE DUTSCHER	S1810
림포렙	SENTINEL DIAGNOSTICS	1114547
Trypan 블루	SIGMA	T8154
CD19	BECKMAN COULTER	082A07770	ECD
CD5	BECKMAN COULTER	082A07754	PC5
CD3	BECKMAN COULTER	082A07746	FITC
CD14	BD	345785	PE
CD16	BECKMAN COULTER	082A07767	PC5
CD56	BECKMAN COULTER	082A07789	PC5
Ettan IPGphor 3 등전 초점 장치	GE-Healthcare	11-0033-64
Urea	SIGMA	U6504
Tris-Hcl 버퍼	BIO-RAD	161-0799
CHAPS	SIGMA	C2020-10G
DTT	SIGMA	D9163-5G
IPGstrips	GE-Healthcare	17-1233-01	선형 pH 4-7 18cm
IPGbuffer	GE-Healthcare	17-6000-86	pH 4-7
글리세롤	SIGMA	G6279
PROTEAN II XL 세포	BIO-RAD	165-3188
SDS	INVITROGEN	NP0001
Acrilamide	BIO-RAD	161-0156
Agarosio	INVITROGEN	16500
메탄올	SIGMA	32213
아세트산	VWR	631000
포르말린	BIO-OPTICAL	05-K01009
에탄올	VWR	9832500
티오황산나트륨	FLUKA	72049
질산은	FLUKA	85228
분자 역학 개인 SI 레이저 농도계	Amersham Biosciences
ImageMaster 2D Platinum 5.0	Amersham Biosciences
탄산나트륨	MERCK	A0250292
MALDI-TOF Voyager-DE STR	Applied Biosystems
Data Explorer 소프트웨어(버전 3.2)	Applied Biosystems
트랜스웰 챔버 6.6mm 직경	CORNING	3421
RPMI	유로클론	ECB2000L	L-글루타
민 겐타마이신	SIGMA	G1397
SDF-1	PREPROTECH	300-28A
평면 바닥 96웰 플레이트	BECTON DICKINSON	353072
BSA	산타 크루즈	9048-46-8
ICAM-1	R & D Systems	720-IC
CMFDA	Life Thechnology	C7025	Green
IgM	SOUTHERNBIOTECH	2020-02
Paraformaldehyde	SIGMA	P6148
Saponine	SIGMA	S-7900
Phalloidin	생명 Thechnology	A12379	알렉사 플루어 488