측정 공간적 칼슘 2 + 신호

요약

^칼슘 신호는 식물에서 다양한 생물학적 과정을 조절한다. 여기에 우리가 공간과 시간 칼슘에 의한 비 생물 적 스트레스를 모니터링하기위한 방법을 제시 애기 세포와 유전자 인코딩 ^칼슘 지표 애큐 오린 또는 Case12를 사용하여 조직에 ^{2 +} 신호.

초록

발육 및 환경 단서 칼슘보기 식물 세포에서 ²⁺ 변동을 유도한다. 자극 특정 시공간 ^칼슘 패턴이 ^칼슘 신호 폭포를 시작 세포의 ^칼슘 결합 단백질에 의해 감지된다. 그러나, 우리는 여전히 특정 ^칼슘 신호가 생성되는 자극 방법에 대한 약간 알고있다. ^칼슘 신호의 특이성은 주어진 자극에 응답하여 ^칼슘 이온 채널들 및 / 또는 전송기의 활동 정교한 조절에 기인 할 수있다. 이들 세포 성분을 식별하고 그들의 기능을 이해하기 위해서는 조직 및 세포 수준에서 모두 ^칼슘 신호를 구분하고 강력한 기록을 허용 시스템을 사용하는 것이 중요하다. 서로 다른 세포 구획을 대상으로 유전자 인코딩 ^칼슘 지표 세포 ^칼슘 신호의 라이브 세포 공 촛점 이미징을위한 플랫폼을 제공하고 있습니다. 여기에서 우리는 명령을 설명이 ^칼슘 감지 시스템의 용도들 : FAS (필름 점착 모종), 발광 ^칼슘 이미징 기반 case12 생균 공 초점 형광 ^칼슘 이미징 기반의 애큐 오린. Case12를 이용한 생균 공 촛점 이미지는 높은 해상도 세포질과 핵 ^칼슘 신호의 동시 검출을 제공하면서 FAS 시스템을 사용하여 발광 이미징은 조직 수준에서 시공간적 ^칼슘 신호의 단순 견고하고 민감한 검출을 제공한다.

서론

식물 세포는 세포의 행동을 통해 시그널링 좌표 환경에 응답한다. 환경 자극에 대한 응답으로 이벤트를 신호 초기 셀은 일시적인 ^칼슘 증가이다. 자유 ^칼슘 농도의 패턴, 또는 일시적인 증가의 서명은 그 진폭, 주파수 및 시간에 의해 특징된다. 고유 시공간 ^칼슘 서명은 다른 세포 활동 ^한을 조절한다. 열, 냉기, 소금, 가뭄, 빛, 또는 식물 호르몬과 같은 특정 자극, 미세 조정할 수 막 화 된 ^칼슘 채널 및 / 또는 수송의 시공간적 활동을, 특정 ^칼슘 서명 결과. ^칼슘 수송이 잘 특징으로되어 있지만, 작은 식물 ^{하나의 칼슘} 채널의 분자 정체성과 기능에 대한 알려져있다. 자극을 강조하는 변경 ^칼슘 반응과 돌연변이에 대한 유전 스크린은 효과적인 APPR 수 있습니다^칼슘 서명을 구성하는 구성 요소를 식별하기위한 oach. 최근 몇 애큐 오린 기반 ^칼슘 탐지 시스템은 병원균의 공격과 비 생물 적 스트레스 ^2-4에 대한 응답으로 구성 요소를 신호 칼슘 ^2에 대한 유전 화면을 용이하게 개발되었다.

애큐....

프로토콜

FAS 시스템을 사용하여 1 애큐 오린 기반 ^칼슘 이미징

1. 발광 이미징을위한 모종을 준비합니다. 0.01 % 트리톤-100를 포함하는 10 % 표백제 용액으로 애큐 오린을 표현 애기 장대 식물의 종자를 소독. 전체 강도 MS (무라 시게와 스쿡 기초 소금의 혼합물), 1 %의 자당, 1.2 % 한천을 포함하는 사각형 접시 (격자 10 × 10cm 사각형 페트리 접시)에 멸균 씨앗을 뿌리고. 수직으로 이일 4 ° C (그림 1A)에서 층화 후 성장 챔버에 넣어 판.
2. 필름에 묘목을 전송합니다. 접시에 성장 7-10일 된 모종의 상단에 접착 필름 (그림 1B)를 놓습니다. 조심스럽게 모종 필름 (그림 1C)을 준수하는지 확인하기 위해 손으로 필름을 밀어 넣습니다. 모종이 필름에 부착 된 상태로 유지되도록 조심스럽게 필름을 벗겨 (그림 1D 및 1E)
3. 보조 인자 (cofactor)로 모종을 품어. 배치포함 된 각 접시 (10 × 10cm) 상에 dhered 모종 2 μg의 15 ㎖ / ML의 H-CTZ 물 (coelenterazine). 하룻밤 (그림 1 층)에....

결과

만니톨, 염화나트륨 및 H ₂ O _2는 각각, 탈수, 소금 및 산화 스트레스 자극에 대한 프록시로서 사용 하였다. 중금속 이온의 Cu ^{2 +이} 세 스트레스 자극 중 어느 synergizes 여부를 확인하기 위해, 우리는 ^{2 +의} Cu의 존재 또는 부재의 각 자극에 ^칼슘 응답을 비교 하였다. 그림 2에 나타낸 바와 같이, FAS 발광 이미징 Arabidoposis 모종 탈수, 소금, 산화 스트레스에 다르게 반응 것으로 나타났습니다. 1 ㎜ H ₂ O _2가 유도하는 동안 우리는이 연구에서 조사 자극의 농도를 들어, 75 mM의 염화나트륨은, 노출 (그림 2A 가운데 패널 및도 2b)의 처음 40 초 동안 잎과 뿌리에서 가장 강력한 ^칼슘 반응을 유도 제 1 및 제 2 40 초

토론

우리는 애기 장대 모종의 공간 - 시간 ^칼슘 응답을 기록하는 FAS 시스템을 증명하고있다. 이 FAS ^칼슘 기록 시스템은 칼슘 여기되게됩니다 비 생물 적 스트레스 자극뿐만 아니라 다양한 자극에 의해 발생 ^{2 +} 역 동성을 측정하기 위해 적용 할 수있는, 간단한 민감하고 강력한 접근 방식을 제공합니다. 이 시스템을 사용하여, 우리는 쉽게 전체 플랜트 레벨에서 조직 - 또는 자극 특정 시공간 ^칼슘 역학을 비교할 수있다. FAS의 고감도 고강도 응력을 사용할 때 셀에 물리적 손상으로 인한 아티팩트를 방지하는 것이 중요하다 ^칼슘 응답을 조사하기위한 저 강도의 자극을 사용할 수있다. 다른 생리 학적 단계에서 모종은 주어진 자극에 대한 응답으로 다른 민감도와 특이도를 가질 수 있지만 십일 애기 모종 세븐, 조직 또는 자극 특정 ^칼슘 반응을 보였다. 따라서이다약 100 모종 필름의 한 조각에 부착 될 수있는 FAS 측정의 .......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
10 cm x 10 cm 사각형 페트리 접시	VWR	60872-310
접착 필름	VWR	60941-062
폴리에틸렌 튜빙	PerkinElmer	9908265
1 ml 주사기	VWR	53548-000
실리콘 그리스	Beckman	335148
2-웰 챔버 커버 유리	Nalge Nunc international	155379
8-well 챔버 커버 유리	Nalge Nunc international	155409
발광 이미징 시스템	Princeton Instruments	N/A
도립 공초점 레이저 스캐닝 현미경	Nikon Instruments Inc.	N/A	니콘 A1R
이미징 소프트웨어	Nikon Instruments Inc.	N/A	니콘 엘리먼트
DataGraph	Visual Data Tools Inc	N/A	DataGraph 3.1.1은 최신 버전입니다.
Coelenterazine	NanoLight Technolgies	#301B NF-BCTZ-FB
다목적 표백제	Any local store N	/A
Triton X-100	Fisher	BP151500
MS salt	Phytotechnology Labs	M524-50L
Sucrose	VWR	BDH8029-12KG
한천	시그마	A1296-5KG
피타젤	시그마	P8169-1KG