키나제 억제제 치료에 대한 저항성 유전자의 출현은 효과적인 암 치료를위한 중요한 도전을 포즈. 새로 개발 된 약물에 대한 식별 및 내성 돌연변이의 특성은 더 나은 임상 관리 및 차세대 약물 설계에 도움이됩니다. 여기서 우리는 체외 검사 및 내성 돌연변이의 검증하기위한 우리의 프로토콜을 설명합니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
이 논문에서
요약
초록
만성 골수성 백혈병 (CML)의 구동 암에서 BCR / ABL의 발견 사실 효과적으로 CML 환자의 치료에 의해 암에서 키나제를 표적의 가능성을 보여, 글리벡의 개발 결과. 이러한 결과는 EGFR, B-RAF, KIT 및 PDGFRs 같은 다양한 다른 악성 종양에 연루 종양 키나제를 표적으로하는 약물 개발에 혁명을. 그러나, 항 - 키나아제 요법 하나의 주요 단점은 타겟 렌더링 약제 내성 돌연변이의 출현을 감소 또는 약물에 대한 친 화성을 잃어버린 것이다. 차세대 억제제를 개발하는 데 도움이뿐만 아니라 개인화 된 약을 사용 임상 관리에 자극을 제공뿐만 아니라 내성 변종에 의해 사용되는 메커니즘을 이해. 우리는 차세대 BCR / ABL 억제제 개발 도왔다 BCR / ABL에 저항을 부여하는 돌연변이의 스펙트럼을 확인하는 레트로 바이러스 벡터 기반 스크리닝 전략을보고했다. Ruxoli 사용약물 표적 쌍으로 tinib과 JAK2, 우리가 JAK2 키나제의 무작위 돌연변이 라이브러리를 발현하는 마우스 BAF3 세포를 이용하여 체외 검사 방법에 대해 설명합니다.
서론
단백질 키나제 겉보기 모든 세포 기능을 조절하는 세포 내 신호 전달 경로의 중요한 조절 효소이다. 키나제 매개 신호의 적절한 제어는 대부분 UPS에 의해 인산화 효소, 포스 및 성능 저하의 적절한 규제 (유비퀴틴 프로 테아 좀 시스템)에 의존 항상성 및 개발에 매우 중요하다. 탈 조절 키나아제는 다양한 암의 중심 단계에있는 인간 숙주 질환 (1)의 연루. 인간 게놈은 직접 또는 간접적으로 결합 된 500 개 이상의 단백질 키나제, ~ 400에 인간이 질병을 인코딩한다. 이러한 관찰은 작은 분자 억제제 3-5로 키나아제의 치료 표적에 대한 개념을 지원했다.
만성 골수성 백혈병 (CML)의 치료에 이러한 글리벡과 같은 ABL 키나제 억제제의 데모는,이 방법 6,7에 대한 개념의 증거를 제공했다. 이러한 관찰뿐만 아니라 개미 혁명I-키나제 치료하지만 또한 골수 증식 성 신 생물 (MPN)과 진성 적혈구 베라 (PV) 환자에서 JAK2에서 발암 돌연변이의 발견으로 이어질 치료 타겟팅 다른 양성 질환의 유전 적 병변을 확인하기 위해 아이디어를 적용. 이 발견은 작은 분자 키나제 억제제 JAK2을 대상으로 MPNs 치료에 큰 관심을 생성합니다. 이제, JAK2 억제제 ....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
참고 :이 프로토콜의 모든 절차는 동물의 윤리적 인 치료 및 관리를위한 건강 지침 국립 연구소에 따라 수행하고, 승인 된 IACUC 동물 사용 프로토콜에 따라되었다.
1. 세포주 유지 보수
- RPMI-1640 배지에서 배양 BAF3 세포는 10 % 소 태아 혈청 및 페니실린 / 스트렙토 마이신 (100 단위 / ㎖ 및 100 ㎍ / ml) 및 WEHI 세포의 소비 배지를 보충. 10 % 소 태아 혈청 및 페니실린 / 스트렙토 마이신이 보충 된 DMEM에서 HEK293T 세포 성장 (100 단위 / ㎖ 및 100 ㎍ / ㎖). 5 % CO2를 함유하는 가습 분위기하에 37 ℃에서 세포를 유지한다.
2. 플라스미드 건설
- 마우스 JAK2과 LR에 의해 pMSCV - 퓨로-GW에서의 발암 성 이성체 JAK2-V617F 표준 재조합 복제 절차를 사용하여 clonase을 복제.
- 루시 페라 제 발현 벡터 (pMSCV 뤽 - 체리-GW)의 건설에-VI를에 사용VO 이미징, 사용 pENTR 뤽를 생성 pENTR-SD-TOPO의 복제와 다음 프라이머 (FP-CACCATGGAAGACGCCAAAAAC가 LUC-SD / RP TT....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
유전 적 돌연변이의 출현 대상 방지 키나제 치료에 큰 도전을 포즈. 돌연변이 연구는 선택과 차세대 신약 개발의 디자인에서 쓸모있는 기계적인 기능적인 통찰력을 제공하는 외에, 또한 더 나은 임상 관리를 할 수 있으며 미래에 맞춤 치료에 더 도움이 될 수 있습니다. 이 실험에서, 우리는 JAK2-V617F 키나제에 ruxolitinib 저항 돌연변이 (그림 1)에 대한 검사를 표시합니다. 우리는 pMSCV - 체리-GW로 전체 길이 마우스 JAK2-V617FcDNA을 도입하여 pMSCV-JAK2-V617F-cherry.gateway 벡터를 구축 하였다. 그것은 인해 시퀀스 바이어스 큰 유전자 조각과 관련된 제한 증폭하기 어려운로, PCR 인 방법의 가장 인기있는 선택을 통해 무작위 돌연변이를 개발하는 박테리아 숙주 (대장균 XL-1 빨간색 변형)을 사용하는 것이 좋습니다 . 무작위 돌연변이 DNA 라이브러리는 레트로 바이러스 생산 HEK293T 세포에 형질 감염시켰다. 이러한 돌연변이.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
임상 적 재발과 표적 유전자의 약제 내성 돌연변이의 출현 : CML 치료에 글리벡의 임상 성공은 작은 분자 억제제에 의해 루즈 키나제를 표적으로의 가능성 만 대상으로 치료도 발견 제한뿐만 아니라 보여 주었다. 저항 돌연변이의 식별 더 나은 임상 관리 및 차세대 억제제의 개발에 도움이됩니다. 이 프로토콜은 표적 유전자에 약제 내성 돌연변이를 확인하는 방법을 설명한다. 이 방법은 E. 내장 무작위 돌연변이 플라스미드 라이브러리를 사용하여 대장균, 돌연변이 단백질을 표현. 이어서 BAF3 라이브러리 세포 (종양 유전자에 의해 변환에 민감)에 도입되어, 화학 요법 제의 존재하에 세포 클론의 선택에 따라. 내성 클론에서 대상 유전자의 염기 서열은 저항을 부여하는 돌연변이를 식별합니다. 마지막으로, 사이트에서 재현 확인 된 돌연변이에 대한 유효성을 검증하는 돌연변이 지시약물 내성.
이 전략을 사용하여 우리는 각각 Ruxolitinib과 글리벡에 대한 내성.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
이해 상충이 선언되지 않았습니다.
감사의 글
이 연구는 NCI (1RO1CA155091), NHLBI (1R21HL114074) 및 백혈병 연구 재단의 석사 장학금으로 지원되었습니다. 석사는 V-재단으로부터 V-Scholar 상을 수상했습니다. 저자들은 편집을 해준 Sara Rohrabaugh 박사에게 감사하고 있습니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 세포 및 조직 배양 | |||
| BaF3 세포 | ATCC | ||
| HEK293T 세포 | ATCC | ||
| pMSCV-JAK2-V617F-puro.GW | Ross Levine | ||
| pMSCV-JAK2-V617F/Y931C의 선물. GW | 사내 | ||
| pMSCV-JAK2-V617F/L983F. GW | 사내 | ||
| pMSCV-JAK2-V617F/P58A. GW | 메이드 인 하우스 | ||
| pMSCV-V617F-Cherry.GW | 메이드 인 하우스 | ||
| pMSCV-JAK2-V617F/Y931C-cherry.GW | 메이드 | ||
| 인 하우스 pMSCV-JAK2-V617F/L983F-cherry.GW | 메이드 | ||
| pMSCV-Luciferase-puro.GW | 메이드 | ||
| RPMI | Cellgro (corning) | 15-040-CV | |
| DMEM | Cellgro (corning) | 15-013-CV | |
| Penn/Strep | Cellgro (corning) | 30-002-CI | |
| FBS | Atlanta biological | S11150 | |
| Trypsin EDTA 1X | Cellgro (corning) | 25-052-CI | |
| 1x PBS | Cellgro (corning) | 21-040-CV | |
| L-글루타민 | Cellgro (corning) | 25-005-CL | |
| Puromycin | Gibco (life technologies) | A11138-03 | |
| 프로타민 설페이트 | Sigma | P3369 | 5 mg/ml 스톡 |
| in water Trypan Blue 용액 (0.4%) | Sigma | T8154 | |
| DMSO | Cellgro (corning) | 25-950-CQC | |
| INCB018424 (Ruxolitinib) | ChemieTeK | 941678-49-5 | |
| WST-1 | Roche | 11644807001 | |
| 0.45 미크론 디스크 필터 | PALL | 2016-10 | |
| 70 미크론 나일론 세포 여과기 | Becton Dickinson | 352350 | |
| 박테리아 배양 | |||
| XL-1 빨간색 E. coli 세포 | Agilent Tech | 200129 | |
| SOC | New England Biolabs | B90920s | |
| 암피실린 | 시그마 | A0166 | 100 mg/ml 스톡 솔루션 |
| Bacto 한천 | Difco | 214050 | |
| 대단한 국물 | Becton Dickinson | 243820 | |
| Agarose | Genemate | E-3119-500 | |
| 키트 | |||
| Dneasy 혈액 및 조직 키트 | Qiagen | 69506 | |
| 긴 템플릿 PCR 시스템 확장 | Roche | 1168134001 | |
| Wizard SV 겔 및 PCR 세척 시스템 | Promega | A9282 | |
| 순수 수율 플라스미드 미니 준비 시스템 | Promega | A1222 | |
| PCR 클로닝 시스템 pDONR 221 및 게이트웨이 기술을 사용한 시스템 OmniMAX 2 컴피턴트 셀 | Invitrogen | 12535029 | |
| Gateway LR 클로나제 효소 믹스 | Invitrogen | 11791019 | |
| 마우스 시약 | |||
| Vivo-Glo Luciferin 생체 내 등급 | Promega | P1043 | |
| 1/2 cc Lo-Dose u-100 인슐린 주사기 28 G1/2 | Becton Dickinson | 329461 | |
| Mortor pestle | Coor tek | 60316 및 60317 | |
| Isoflorane (Isothesia TM) | Butler Schien | 29405 | |
| 기기 | |||
| , NAPCO 시리즈 8000 WJ CO2 인큐베이터 | , Thermo scientific | ||
| , 스윙 버킷, 로터, 원심분리기, 5810R | Eppendorf | ||
| TC-10, 자동 세포 카운터 | Bio-RAD | 이것은 필요하지 않으며 세포 계수를 위해 표준 혈구 유도체를 사용할 수 있습니다 |
참고문헌
- Huse, M., Kuriyan, J. The conformational plasticity of protein kinases. Cell. 109, 275-282 (2002).
- Melnikova, I., Golden, J. Targeting protein kinases. Nat Rev Drug Discov. 3, 993-994 (2004).
- Cohen, P.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
