이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.

방법 논문

병아리 배아에서 분리 및 해리 감각 뉴런의 문화

14.3K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/51991

⸱

2014년 9월 24일

 ,  , 
1Department of Natural Sciences, Assumption College

이 논문에서

요약

세포 배양 모델은 환경 조건 위에 상세한 제어를 제공하고, 따라서 신경 세포 생물학의 다양한 양상을 명료하게 강력한 플랫폼을 제공한다. 우리는 병아리 배아에서 감각 신경을 분리 해리, 문화 할 수있는 신속하고 저렴하고 신뢰할 수있는 방법을 설명합니다. 하층 준비 및 면역 세포의 세부 사항도 제공됩니다.

초록

뉴런은 감각, 운동 모터, 학습 및 메모리를 포함하는 다양한 기능을위한 필수적인 정보를 전달 다각적 세포이다. 생체 내에서 뉴런을 공부하는 것은 그들의 복잡성, 그들의 다양하고 역동적 인 환경 및 기술적 한계에 도전 할 수 있습니다. 이러한 이유로, 시험 관내에서 신경 세포를 연구하는 신경 세포의 복잡한 신비를 푸는 유익한 증명할 수 있습니다. 세포 배양 모델의 잘 정의 된 자연 환경 조건과 변수를 통해보다 정밀하게 제어 할 수 있습니다. 여기에서 우리는, 분리 해리, 그리고 병아리 배아에서 배양 주 뉴런하는 방법에 대해 설명합니다. 이 기술은 급속 저렴하고 견고 감각 신경 성장 생성한다. 절차는 지속적으로 높은 신경 세포에 충실 문화를 생산하고 거의 비 신경 세포 (5 % 미만)이 있습니다. 차 뉴런 따라서 자세한 절차는이 디스탱을 만들, 치료 유리 또는 조직 배양 플라스틱에 잘 고착되지 않습니다CT, 신경 도금 잘 정의 된 라미닌 함유 하층 설명한다. 배양 된 신경 세포 공동 면역 침전, 라이브 셀 상상, RNAi를하고, 면역 세포 등 다양한 세포 및 분자 기술에 매우 의무가 있습니다. 이 배양 된 신경 세포를 두 번 면역 세포 화학에 대한 절차 최적화 여기에 설명되어있다.

서론

뉴런은 감각, 비전, 모터 운동, 학습 및 메모리를 포함하는 다양한 기능에 필수적인 정보를 전달 복잡한 세포입니다. 다른 세포 유형에서 독특한는 뉴런 통신에 필수적인 신경 도로를 형성하도록, 아암 형상 프로세스라는 축삭을 연장. 성장 축삭의 끝에있는 개발 전문 구획 동안의 적절한 대상으로 축삭을 이끌 세포 외 신호의 콘서트를 탐색, 성장 콘을했다. 성장 콘 탐색의 기초가 복잡한 분자 메커니즘은 완전히 이해되지 않습니다. 더 나은 이러한 메커니즘을 이해하기 위해, 연구자들은 정의의 단순화 된 체외 환경에서 뉴런을 연구하기 위해 세포 배양 모델을 사용하고 있습니다. 신경 세포의 분화 2, 세포 골격 역학, 엔도 시토 시스와 인신 매매, 덴 드라이트 (dendrite) : 문화 1에서 공부 뉴런을 포함, 신경 세포 생물학에 대한 우리의 이해에 상당한 발전을 주도하고있다규제 3,4, 축삭 재생 5, 및 신경 병증 6 임상 조건. 또한, 배양 된 신경 세포는 면역 세포, 세포 표면 공동 - 면역 침전, 웨스턴 블롯, 형질 감염, RNAi에, 이러한 성장 콘 운동성 인터벌 분석과 같은 라이브 영상을 포함한 연구 기법의 넓은 범위에 높은 의무이다. 따라서, 차 뉴런을 배양하여 신경 세포 생물학의 다양한 양상을 규명 할 수있는 강력한 방법이다.

세포 배양 모델은 환경 조건 및 변수를 세부적으로 제어 수사관을 제공합니다. 예를 들어, 신경 도금 (시 및 성장)이되는 하층이 쉽게 조작 할 수있다. 여기서 우리는 두 가지 하층 낮은 라미닌-1 농도가 하나 라미닌-1의 농도를 포화와 다른 생성에 대한 자세한 지침을 제공합니다. 놀랍게도, 동일한 분자의 다른 농도 극적인 효과를 가질 수있다뉴런의 내부 상태뿐만 아니라 세포 표면에 조성물. 예를 들어, 인테그린의 캠프 및 표면 수준의 세포 내 수준이 두 하층 7,8에 도금 뉴런에서 크게 다르다. 추가 연구는 피브로넥틴 및 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸, 충격 세포 표면 분자의 발현 및 신경 운동성 7-11을 포함하는 다른 분자를 보여 주었다. 또한, 예컨대도 세포막 조성물 및 신경 운동성 12-16 영향 용이하고 정확하게 세포 배양 모델에서 조작 할 수 neurotrophins 및 neurotropins 수용성 분자.

여기에, 우리는 방법을 분리 및 문화 병아리 배아에서 감각 신경 해리에 대해 설명합니다. 이 절차는 축삭의 파생물 5,7,8,10,11,16-21을 포함하여 신경 생물학에서 중요한 돌파구를 만들기 위해 사용되었으며, 신경절 세포 (22)을 분리하도록 설계 절차에서 수정되었습니다. 이 있습니다이 방법의 몇 가지 이점. 먼저, 병아리 후근 신경절 (DRG) 개발 많은 기능도 탄생 축삭 연장을위한 시간 프레임을 포함한 것을 특징으로하며, 단백질 발현, 따라서 관내 실험에서 유익한 구축 할시에 유익한 기초를 제공 2,23-28 프로필. 둘째, 연결을 문화가 조사가보다 직접적으로 해리 신경 세포와 비 신경 세포를 모두 포함 (신경 세포와 비 신경 세포를 포함) 그대로 DRG 외식 및 / 또는 혼합 문화를 사용하는 다른 방법에 비해 신경 세포를 연구 할 수 있도록 해리. 셋째, 여기에 설명 된 절차는 간단 저렴하고 학부생 의무가 있습니다. 따라서,이 기술은 연구뿐만 아니라 교육 목적으로 사용될 수있다. 또한,이 프로토콜의 사소한 변화는 DRGs 이외의 소스에서 신경 세포의 빠르고 높은 수율 정화를 허용해야합니다. 예를 들어,이 과정은 ENR neuronally 제공하도록 변형 될 수있다전뇌 배아 또는 척수 등의 다른 조직으로부터 배양 iched.

면역 세포 화학 프로토콜이 해리 신경 배양을 위해 최적화되어 있고 여기에 상세하게 설명된다. 신경 세포 부착 분자 (NCAM) 및 β1 인테그린 대한 이중 면역 세포 화학을위한 절차가 제공된다. 이러한 면역 조직 화학적 방법에서 생성 된 데이터는 배양 된 신경 세포에서 8,16 공간적 패터닝 여러 분자의 강도를 검사하는데 사용되어왔다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

프로토콜

1 커버 슬립 준비 : 산 세척 및 구워

  1. 최소 2 일 전에 해부 (2 단계)로 된 커버를 준비하려면 다음 단계를 시작합니다. 오일과 철저하게 청소 된 커버를 제거 할 수있는 산 세척 단계를 수행합니다.
  2. 수직으로 된 커버를 배치하고 서로 닿지에서 그들을 방지 도자기 홀더에로드 된 커버. 2 M 염산 (HCL)로 채워진 유리 조직 학적 용기에 홀더와 커버 슬립을 담근다. 도자기 홀더를 사용할 수없는 경우 또는, 100mm 유리 페트리 접시의 바닥을 커버하고 2 M 염산에 커버 슬립 잠수함 20 커버 슬립 수평 ~ 퍼졌다.
  3. 흄 후드에서 로커 테이블 (산에 침수 된 커버와 함께) 유리 용기를 놓고 실온에서 적어도 5 시간 동안 락을 부드러운 수 있습니다. 또한, 산 세척 하룻밤 동일한 조건으로 된 커버.
  4. 도자기 홀더로드 전송하여 증류수 H 2 O DH (2 O)로 된 커버를 세척dH보다 2 O. 가득 깨끗한 유리 조직학 컨테이너에 2 M 염산에서 커버 슬립과 함께 또한, 커버 슬립 유리 페트리 접시에서 2 M 염산을 가만히 따르다 및 dH보다 2 O.로 리필
  5. 다시 dH보다 2 O 경사 분리와 신선한 dH보다 2 O. 유리 용기를 리필하여 세척 3 빠른 세척 총 반복합니다.
  6. 로커에 (커버 슬립와 dH보다 2 O) 유리 용기를 반환하여 더 이상 세척 요법을 시작합니다. 실온에서 10 ~ 30 분 동안 교반과에 대한 허용합니다. 그런 다음, dH보다 2 O를 가만히 따르다 신선한 dH보다 2 O. 추가 적어도 10 세척 총 반복합니다. 또한, 하룻밤 세척을 계속합니다.
  7. 350 °의 C로 예열로에 세척 된 커버를 놓습니다. 도자기 홀더를 사용하는 경우, dH보다에서 2 O 채워진 유리 용기를 홀더를 제거하고 직접 용광로로 된 커버와 홀더를 배치합니다. 유리 페트리 접시를 사용하는 경우, dH보다 2 O를 가만히 따르다 및 furnac로 된 커버와 유리 접시를 배치전자.
  8. 적어도 다섯 시간 밤새 350 ° C에 대한 커버 슬립 굽는다.
  9. 굽​​기가 완료되면, 미세 집게로 도자기 홀더에서 커버 슬립을 제거하고 멸균 100mm 유리 페트리 접시에 놓습니다. 원래 유리 페트리 접시에서 도자기 홀더에 배치되지 않은 커버 슬립을 둡니다.

2 병아리 해부 및 DRGs의 분리

  1. 비옥 제거 (부드러운 락으로 37-38.5 ° C에서 개최) 인큐베이터에서 화이트 레그혼 종 병아리 달걀을 벌였다.
    참고 : 이전의 연구는 DRGs 2,8,11-13,16의 분리를 위해 배아 일 7-10 사용했다.
  2. 층류 후드에서 선택한 계란을 넣습니다. 멸균 솔루션과 악기 층류 후드에서 무균 조건 아래 모든 절차를 실시한다. 37 ° C의 물을 욕조에 미리 따뜻한 모든 솔루션을 제공합니다.
  3. 플라스틱 100mm 페트리 접시에 계란과 장소 내용을 균열. 또 다른 100mm 페트리 접시에 배아를 전송하는 표준 집게를 사용합니다.
    4. 파스퇴르 피펫을 사용하여, 젖은 조직을 유지하기 위해 페트리 접시에 1X PBS를 따뜻하게 추가합니다. 미세 집게로 목을 집어 배아 목을 벨. 또 다른 깨끗한 100mm 페트리 접시에 몸을 전송합니다.
  4. 따뜻한 F12HS10 추가 (햄 F12, 10 mM의 HEPES, 100 유닛 / ㎖ 페니실린 / ㎖ 스트렙토 마이신, 10 % 소 태아 혈청 0.1 mg)을 웨트 티슈를 유지 파스퇴르 피펫 가진 접시한다. 그 몸 윗면 (그림 1A)에 배아를 위치 집게를 사용합니다.
  5. 층류 후드에서 양안 입체의 해부 현미경에 배아 조직을 포함 100mm 플라스틱 페트리 접시를 놓습니다. 심장, 폐 등의 장기를 노출하는 현상 진피를 집어 목 꼬리에서 수직 중간 선 절개를하여 미세 집게를 사용합니다. 대안 적으로, 내부 기관을 노출 작은 눈물 일련의 확인.
  6. 부드럽게 멸균 미세 집게 2 세트 사용) 목을 잡고 b)는 꼬리를 향해 심장에 바로 위에있는 대동맥 또는 기타 조직을 잡고 끌어가,동물 eviscerating.
  7. 조직에 파스퇴르 피펫 따뜻한 F12HS10을 적용합니다. 개발 갈비뼈, 척추 및 DRGs (그림 1B-1D)를 노출 남아있는 심장 혈관, 호흡기 나 소화 기관을 제거하는 집게를 사용하십시오.
  8. 해부 현미경, 상기 리브 열등 요추 척추의 양쪽을 따라 DRGs를 장기를 제거하고 수집하는 미세 집게를 사용합니다. 배아에서 그대로 DRGs를 따 버릴에 의해 DRGs를 수집합니다. 핀치와 척수를 향해 DRG에서 도달하고 주변 또는 그 반대 방향으로 DRG에서 도달 개발 신경을 잡고 뿌리를 절단.
  9. 따뜻한 F12HS10 가득 35mm 배양 접시에 그대로 DRGs를 놓습니다. 미세 집게로 집어 35mm 접시에 그대로 DRGs에서, 같은 DRGs에 부착했을 수 지느러미 또는 복부 뿌리로, 초과 조직을 제거합니다.
  10. 요추 우수 DRGs를 얻으려면, 흉부 및 cervi의 복부의 절반을 제거칼 척추. 이것은 상부 경추 영역에서 척수 축과 상부 요추의 다른 절단 직교 현상 척주에서 절단함으로써 행해진 다. 그 후, 상처가 오른쪽 및 척주의 왼쪽 측면을 따라 척수 축에 평행하게. 드러내는에게 척수 (그림 1E-1 층) 노출 배아에서 척추의 복부 절반을 올립니다.
  11. DRGs에 쉽게 액세스 할 수 있도록하려면, 미세 집게로 척수를 잡고 흉추 및 경추 척수를 제거합니다. 척추에서 척수를 들어 올릴 집게를 사용합니다. 근사화로서, 흉추 척수 리브의 수준이며 치경부는 리브 우수하다.
  12. 미세 집게로 그대로 흉부와 경부 DRGs를 수집하고 다른 DRGs 따뜻한 F12HS10에 배치합니다. DRGs을 준수 할 수 초과 조직을 제거합니다.
  13. 도움 F12HS10와 새로운 유리 파스퇴르 피펫의 내부를 씻어피펫의 벽에 달라 붙는 것을 DRGs를 방지 할 수 있습니다. 멸균 15 ML 원뿔 관에 작은 배양 접시에서 모든 DRGs 및 F12HS10를 전송하고 바로 3 단계로 진행하기 위해 세척 피펫을 사용합니다.
    NOTE : 추가 배아 DRGs의 수를 증가시키기 위해 해부된다. DRGs는 3 단계에 대한 준비가 될 때까지 37 ° C에서 F12HS10에 보관해야합니다.

3 해리, 풍성하게하고, 배양 DRG 뉴런 - 1 부

  1. 그대로 DRGs 원심 분리기에 부드럽게와 장소 원뿔 관은 2 ~ 3 분 (200 XG)를 회전. DRGs 튜브의 바닥에 침몰 한 것을 확인합니다. 그렇지 않다면, 다시 스핀.
  2. 피펫을 사용하여 부드럽게 방해받지 DRG 펠렛을 떠나 F12HS10를 제거합니다. DRGs의 펠렛을 빠지 1 배 칼슘과 마그네슘 무료 (CMF) PBS의 2 ML을 추가합니다. 다시 스핀 그대로 DRG 펠렛을 유지하면서 CMF PBS를 제거합니다. 다음 단계에서 트립신 소화 방해하는 F12HS10의 소 태아 혈청을 제거하기 위해 세척 세의 총이 세척 과정을 반복.
  3. 2 ml의 CMF PBS와 DRGs를 포함하는 15 ML 튜브로 가온 트립신 2 ㎖를 추가합니다. 10 ~ 15 분 해리 세포로 DRGs를 소화하는 37 ° C의 물을 욕조에 넣어 튜브.
  4. 배양하는 동안, F12H + 보충 함유 미디어를 만들 (햄의 F12, 10 mM의 HEPES 100 단위 / ml의 페니실린, 0.1 ㎎ / ㎖ 스트렙토 마이신, 10 NG / ㎖ NT3, 10 NG / ML NGF, 200 MM의 L-글루타민 및 N2)와 따뜻한 37 ° C의 물을 욕조에. 일반적으로, 전체 미디어의 10 ml의 기본 감각 뉴런의 4-5 35mm 요리에 충분하다. 또한 해동 라미닌 한 코팅 된 커버 (4 단계)에 대한을 시작합니다.
  5. 시각적으로 부드럽게 씹다 P1000 피펫 트립신 용액 DRGs하고 그대로 DRGs의 부재에 대한 검사. 그대로 DRGs가 더 이상 눈으로 볼 때까지 분쇄를 계속 및 / 또는 그대로 DRGs가 해리 될 때까지 37 ° C의 물을 욕조에 이상 트립신 배양을 위해 할 수 있습니다. , 손상 DRG 신경 세포를 보호 분쇄하는 동안 공기 방울을 방지하고 <30 분에 트립신 소화를 제한합니다.
  6. Centrifug해리 DRGs를 함유 펠렛을 형성하기 위해 3 ~ 5 분 동안 200 XG에서 트립신 E 튜브. 펠릿이 형성 될 때까지 필요한 경우 더 이상 봐.
  7. 조심스럽게 펠렛을 방해하지 않고 트립신을 대기음. 펠렛 F12HS10 2 ㎖를 추가합니다. 부드럽게 P1000 피펫 팁 DRGs를 씹다.
  8. 100mm 배양 접시에 15 ML 원뿔 관에서 모든 내용을 전송합니다. 10 ㎖의 총 시간에, 2 ml의 8 ML의 F12HS10 함께 튜브를 세척하여 배양 접시에 옮긴다. 이러한 세정 단계는 튜브의 벽에 부착 남아있는 세포를 수집 할 수 있습니다.
  9. 100mm 배양 접시에 놓습니다 (10 ml의 F12HS10와 및 DRG 세포를 해리) 3 시간 동안 가습 37 ° C 배양기에.
    NOTE : HEPES는 CO 2의 부재 매체의 pH를 완충하기 때문에 CO 2 인큐베이터에 필요한 것은 아니다. 배양 중에 신경 교세포 느슨하게 폐해 침대에 부착하는 경향이 조직 배양 플라스틱 및 신경 세포의 표면에 결합한다.

4 코팅 산 세척라미닌-1와 구운 Coverslips는

  1. 얼음에 냉동 라미닌-1의 멸균 분주 해동.
  2. 멸균 조건 하에서, 라미닌 (1)의 50 μL 분취를 멸균 1X PBS 1 ㎖를 추가한다.
  3. 280 nm에서 라미닌 1의 흡광도 값을 획득하는 분광 광도계를 사용한다. 라미닌 (1)의 농도를 결정하기 위해 다음의 수학 식에이 값을 사용한다.

ABS 280 = (농도 ㎎ / ㎖) * (단백질의 흡광 계수)
라미닌 1의 흡광 계수는 0.86이다.

  1. 멸균 조건 하에서, 1 ㎎ / ㎖, 20 ㎎ / ㎖의 농도를 얻었다 1X PBS로 라미닌 1 희석. 라미닌-1 배양 7,8,10 후 커버 슬립 (30 NG / cm 2 및 300 NG / 각각 cm 2)에 결합의 10 배의 차이를 달성하기 위해 라미닌-1이 두 적용 농도를 사용합니다.
  2. 층류 후드에서, 하나의 산 세정하고, 구운 C를 배치 미세 겸자를 사용한 35mm 배양 접시의 바닥에 overslip. 필요한 접시의 수를 얻기 위해 필요한만큼 반복한다.
  3. 추가 살균을 위해 20-30 분 동안 UV 광에 커버 슬립 대상. 이 단계에서 접시 뚜껑을 유지합니다.
  4. 각각의 유리 커버 슬립을 준비 라미닌-1의 400 μl를 추가합니다. 커버 슬립의 전체 범위를 보장하기 위해 라미닌-1을 확산 피펫 팁을 사용합니다. 표면 장력은 라미닌-1은 커버 슬립에 남아 필요 배양 접시의 바닥에 전염되지 수 있습니다.
  5. 접시에 뚜껑을 놓고 라미닌-1은 실온에서 2 ~ 3 시간 동안 배양 할 수 있도록 (3 시간 최적입니다).
  6. 라미닌 인큐베이션 한 후, 층류 후드에서 멸균 PBS로 무균 기술을 이용하여 커버 슬립을 헹군다. 커버 슬립에 솔루션을 제거하고 PBS 400 μl를 추가합니다. 5 ~ 10 분을 기다립니다. 세 린스의 총 반복합니다.
  7. 마지막 헹굼 후 커버 슬립에 PBS를 남겨주세요. 세척시 표면 장력을 아프게하지 마십시오 된 커버가 건조 할 수 없습니다. 르준비가 될 때까지의 집결지 뚜껑 coverlip에 신경을 해리 판에.

5 해리, 풍성하게하고, 배양 DRG 뉴런 - 2 부

  1. 배양 후, 부드럽게 해리 DRG 세포를 함유 100mm 접시의 바닥 린스 10 ㎖의 멸균 피펫을 사용한다. 부드럽게 약 3 분의 접시에 7 ㎖의 추방 ~ 피펫 도움으로 F12HS10의 7 ML을 당겨, 45 ° 각도 ~에서 요리를 잡습니다. 부드럽게 신경을 빠지, 배를 반복합니다.
  2. 접시를 돌려 요리의 또 다른 3 분에, 또 다른 여섯 린스를 들어, 절차를 세척 반복합니다. 접시의 3 분의 나머지에 대해 다시 절차를 반복. 이러한 방식으로, 신경 세포를 부드럽게 제거 F12HS10로 접시의 전체 바닥을 헹군다.
  3. 같은 피펫을 사용하여 15 원뿔 튜브에 100mm 접시에서 F12HS10 포함하는 신경 세포를 전송합니다. 세포 펠렛 200g에 5 ~ 10 분 동안 원심 분리기.
  4. 방해받지 펠렛을 떠나 F12HS10를 제거합니다. 따뜻하게 F12H + 보충 2 ㎖로 재현 탁 펠렛.
    5. 세포 밀도를 결정하는데 사용 혈구.
  5. 원하는 도금 농도 (20 μg / ml의 라미닌 1 8,16으로 코팅 된 커버 1 μg / ml의 라미닌 1 40,000 세포 / ml로 코팅 된 커버 120,000 세포 / ml)를 수득 F12H + 보조제와 같은 필요한 세포를 희석.
  6. 라미닌 - 코팅 된 커버에서 PBS를 제거하고 즉시 커버 슬립에 세포를 400 μl를 배치합니다. 조심스럽게 가습, 37 ° C에서 세포 배양 인큐베이터에 접시를 전송합니다. 뉴런은 라미닌-1을 준수 할 수 있도록 3 시간에 적어도 1 시간까지 배양 할 수 있습니다.
  7. 무균 조건에서 부드럽게 F12H + 보충 1.6 ml의 신경 세포를 포함하는 35mm 요리를 홍수.
    참고 :이 때, 커버 슬립에 장력이 나눌 수 있습니다 표면. 신경 세포는 적절하게 커버 슬립에 라미닌-1에 부착했다.
  8. 보육 밤새 배양 세포를 돌려줍니다. 다음과 같은 일 면역 세포와 같은 실험을 수행합니다.

(6) Immunocytochemistry

  1. 면역 세포에 앞서, 37 ° C의 물을 욕조에 따뜻한 정착 용액 (4 % 파라 포름 알데히드, 30 % 자당 2 배 PBS).
    참고 : 세포를 고정하기 전에, 같은 netrin-1, 미네소타 2 +, 소닉 고슴도치, semaphorin 및 ephrin 16,29-31 등 다양한 시약으로 처리합니다.
  2. 천천히 배양 접시에서 F12H + 보충의 2 ML 1 ㎖를 제거합니다. 부드럽게 따뜻하게 정착 용액 1 ㎖를 추가합니다. 10 ~ 15 분 동안 실온에서 배양 할 수 있습니다.
  3. 조심스럽게 정착 솔루션을 제거하고 2 ㎖의 PBS를 추가합니다. PBS의 응용 프로그램으로 인해 고정 된 세포의 수 빠지을 피하고, 접시의 가장자리를 향해 솔루션을 적용합니다. 5 분 동안 실온에서 배양한다.
  4. 5 세척 총 PBS 세척을 반복합니다. 세포가 면역 세포의 단계에서 건조 할 수 없습니다.
  5. PBS를 제거합니다. 솔루션 차단 1 ㎖ 적용 (0.1 % 트리톤-X를, 1X PBS, 5 % 정상 염소 혈청). 실온에서 1 시간 동안 배양한다. 다르게는, 표면 분자 얼룩이용액 팔을 차단 트리톤-X를 사용하지 마십시오.
  6. 제조의 추천되고 차단 솔루션에 기본 항체를 희석. NCAM에 대한 항체 (500)와 β1 인테그린 (16)을 활성화 : 1 사용합니다. 차단 솔루션을 제거 차 항체 용액 1 ㎖를 추가하고 실온에서 또는 하룻​​밤 4 ℃에서 1 시간 동안 배양한다.
  7. 차 항체 용액을 제거하고 1X PBS 2 ㎖를 추가합니다. 실온에서 5 ~ 10 분 동안 품어. 4 PBS 세척의 총 반복합니다. 필요한 경우 세척은 확장 할 수 있습니다.
  8. 1 차 항체를 희석 : 1000을 차단 솔루션에. , PBS를 1 ㎖의 제거보기 차 항체 용액을 추가하고, 실온에서 1 시간 동안 배양한다.
    참고 : 2 차 항체 광 감응성. 이 시점에서 최대한 어두운 용액과 세포를 유지.
  9. 차 항체 용액을 제거하고 이전에 수행으로, 1X PBS로 5 배를 씻어.
  10. Fluoromount의 ~ 60 ~ 80 μl를 적용현미경 슬라이드 위에 G. 미세 집게를 사용하여 부드럽게 현미경 슬라이드에 Fluoromount G에 접시와 하부 커버 슬립에서 커버 슬립을 들어 올립니다. 공기 방울을 피하십시오.
  11. 스토어는 어둠 속에서 4 ° C에서 수평으로 슬라이드. 12 ~ 24 시간 후, Fluormount G는 중합하고 coverslip에 단단히 현미경 슬라이드에 첨부됩니다. 이 중합 단계 이후에 이미지의 세포가 완료됩니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

결과

여기에 설명 된 프로토콜은 문화에 거의 (예를 들어, <5 %) 비 신경 세포 7,8,10,16와 해리 배아 감각 뉴런의 풍부한 인구를 수사 할 수 있습니다. 수많은 DRGs는 요천 추부, 흉부 및 경부 지역에서 얻을 수 있습니다. 연구자의 필요에 따라 이러한 독특한 해부학 적 영역에서 DRGs를 쉽게 분리 할 수​​있다. 예를 들어, 그림 1은도 1C 및 1D 및도 1E와 1 층에서 흉부 DRGs 강조 요추 DRGs와 절개의 다양한 단계를 통해 병아리 배아의 이미지를 보여줍니다.

배양 된 세포는 쉽게 면역 세포에 의해 표시된다. 여기에서, 배양 된 세포는 β1 인테그린 및 NCAM (그림 2)에 대한 항체와 면역 염색된다. 놀랍게도, 우리는이 후 최대 일년에 형광 염색을 시각화 할 수있었습니다ICC 절차, 슬라이드는 4 ° C에서와 어둠 속에서...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

토론

여기에서 우리는 분리에 대한 자세한 프로토콜을 제시하고 배양은 병아리 배아에서 감각 신경 해리. 이 절차는 시험 관내 7,8,10,16의 고성장 신경 세포의 풍부한 인구를 생성합니다. 다수의 세포 및 분자 기술들은 여기에 설명 된 면역 세포를 포함하여 이들 배양 된 신경에 적용 할 수있다. 이 프로토콜은 최근 정량적 감각 성장 콘 8,16에서 immunolabeled 인테그린 활성화의 강도를 평가하기 위해 사용되었다. 이러한 선행 연구에서, 소프트웨어 프로그램이 정확하게 성장 원추의 원위 단부 20 미크론의 윤곽을 생성하기 위해 사용되었다. 개요는 NCAM 염색을 기반으로 만들어졌다. 뉴런의 NCAM 유비쿼터스 표현은 전체 성장 원추보다는 성장 원추의 제한된 부분을 식별하기 위해 소프트웨어 프로그램을 사용 가능. 이러한 성장 원뿔 윤곽이어서 관심 영역과 그 REGI 내 인테그린 염색 강도로 확인되었다관심에 소프트웨어에 의해 평가되었다. 이러한 방식으로, 목적 단백질의 강도...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

공개 사항

저자가 공개하는 게 없다.

감사의 글

우리는이 논문에 대한 통찰력있는 의견을 앨리슨 Philbrook, 벨린다 Barbagallo 마이클 프랜시스에게 감사의 말씀을 전합니다. 이 책에서보고 된 연구는 MLL에게 수여 R15 AREA 상 1R15NS070172-01A1에 의해 지원되었다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
멸균 소형 배양 접시 (35mm)Corning430165
멸균 대형 배양 접시 (100mm)Falcon353003
멸균 대형 페트리 접시 (100mm)VWR89000-302
유리 페트리 접시 (100mm)VWRD108962
파인 파이치파인 사이언스 도구11251-10
표준 집게Fine Science Tools1100-12
커버슬립(22 x 22mm)Fisher12 518 105K0.13-0.17mm 두께는 현미경 검사에 최적
포셀린 커버슬립 홀더Thomas Scientific8542E40
Fetal Bovine serumGibco17502-048500ml당 50ml 분취액 사용
2M에서 사용,
NaClSigmaS9888Laminin-1 재고 용액
Laminin-1Invitrogen23017-015사용하십시오. 72 µ를 추가하십시오. 멸균 5 M NaCl의 l과 50 µ로 분취량; l
15ml 원뿔형 튜브세포 치료229411
PBS CMF 10xGibco142001x에서 사용, 멸균 Millipore 여과수
PBS 10xGibco14080, 멸균 Millipore 여과수로 희석
Ham's F12Lonza12-615F
태아 소 혈청 알부민(BSA)Gibco1043810 %
HEPES시그마H3375F12HS20 사용하여 증류수에 멸균 1M 용액을 만들고 F12 매체에 희석하여 10 mM
페니실린 / 스트렙토 마이오신시그마P0781500 ml의 F12 매체
NT3MilliporeGF031에 5ml를 사용합니다.멸균 Millipore 물 1ml를 추가하고, 멸균 조건에서 분취액을 넣고 -20°C에서 보관하십시오. C, F12H 매체에서 10 ng / ml의 최종 농도에서 사용, -20 °C로 유지; C 비제상 냉동고
NGFRnD 시스템256-GF0.1% BSA가 함유된 멸균 1x PBS 1ml를 추가하고 멸균 조건에서 분취액을 넣고 -20°C에서 보관합니다. 멸균 조건에서 F12H 배지
L-글루타민시그마G7513는 -20°C에서 보관합니다. C, 멸균 조건 하에서 F12H 매체
TrypsinSigmaT4049, -20 °C에서 보관; C
소 혈청 알부민 (BSA)Gibco15260
기타 필요한 품목: 유리 파스퇴르 피펫, 비옥한 흰 다리뿔 닭 달걀, 체크 알 부화기(가습, 37 ° C), 세포 배양 챔버 (가습, 37 ° C), 층류 후드, 양안 입체 비전 해부 범위
Immunocytochemistry 시약 표
SucroseSigmaS9378(4% 파라포름알데hye, 30% 자당, 2x PBS)
Triton-X 100SigmaT-8787
파라포름알데히드SigmaP6148고정액에 사용 (4% 파라포름알데히, 30% 자당, 2x PBS)
Fluoromount GSouthern Biotech0100-01
Normal goat serumLife technologiesPCN500
Microscope slidesVWR16004-430
Primary 항체 Table
항체 against NCAMMilliporeAB5032polyclonal
항체 활성화됨 & 베타; 1 ingegrinMilliporeMAB19294monoclonal
Secondary 항체 Table
Goat anti-mouse IgG Alexa 488Life technologiesA11001
염소 anti-rabbit IgG Alexa 548Life technologiesA11036
Ham's F12 매체 HCl VW3204-1 을 버리기 전에 두 번 사용할 수 있습니다 에 5M NaCl 용액을 으로 희석에서 의 최종 농도를 얻기 위해 부분 표본에서 최종 농도 10ng/ml로 사용되는 C 부분 표본에서 200 mM의 최종 농도에서 사용

참고문헌

  1. Millet, L. J., Gillette, M. U. Over a century of neuron culture: from the hanging drop to microfluidic devices. The Yale journal of biology and medicine. 85, 501-521 (2012).
  2. Guan, W., Puthenveedu, M. A., Condic, M. L. Sensory neuron subtypes have unique substratum preference and receptor expression before target innervation. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 23, 1781-1791 (2003).
  3. Kapitein, L. C., Hoogenraad, C. C. Which way to go? Cytoskeletal organization and polarized transport in neurons. Molecular and cellular neurosciences. 46, 9-20 (2011).
  4. Kapitein, L. C., Yau, K. W., Hoogenraad, C. C. Microtubule dynamics in dendritic spines. Methods in cell biology. 97, 111-132 (2010).
  5. Snow, D. M. Pioneering studies on the mechanisms of axonal regeneration. Developmental neurobiology. 71, 785-789 (2011).
  6. Melli, G., Hoke, A. Dorsal Root Ganglia Sensory Neuronal Cultures: a tool for drug discovery for peripheral neuropathies. Expert opinion on drug discovery. 4, 1035-1045 (2009).
  7. Condic, M. L., Letourneau, P. C. Ligand-induced changes in integrin expression regulate neuronal adhesion and neurite outgrowth. Nature. 389, 852-856 (1997).
  8. Lemons, M. L., Condic, M. L. Combined integrin activation and intracellular cAMP cause Rho GTPase dependent growth cone collapse on laminin-1. Experimental neurology. 202, 324-335 (2006).
  9. Beller, J. A., et al. Comparison of sensory neuron growth cone and filopodial responses to structurally diverse aggrecan variants, in vitro. Experimental neurology. 247, 143-157 (2013).
  10. Condic, M. L., Snow, D. M., Letourneau, P. C. Embryonic neurons adapt to the inhibitory proteoglycan aggrecan by increasing integrin expression. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 19, 10036-10043 (1999).
  11. Lemons, M. L., Barua, S., Abanto, M. L., Halfter, W., Condic, M. L. Adaptation of sensory neurons to hyalectin and decorin proteoglycans. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 25, 4964-4973 (2005).
  12. Guan, W., Condic, M. L. Characterization of Netrin-1, Neogenin and cUNC-5H3 expression during chick dorsal root ganglia development. Gene Expr Patterns. 3, 369-373 (2003).
  13. Guan, W., Wang, G., Scott, S. A., Condic, M. L. Shh influences cell number and the distribution of neuronal subtypes in dorsal root ganglia. Developmental biology. 314, 317-328 (2008).
  14. Kolpak, A., Zhang, J., Bao, Z. Z. Sonic hedgehog has a dual effect on the growth of retinal ganglion axons depending on its concentration. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 25, 3432-3441 (2005).
  15. Kolpak, A. L., et al. Negative guidance factor-induced macropinocytosis in the growth cone plays a critical role in repulsive axon turning. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 29, 10488-10498 (2009).
  16. Lemons, M. L., et al. Integrins and cAMP mediate netrin-induced growth cone collapse. Brain research. 1537, 46-58 (2013).
  17. Snow, D. M., Atkinson, P. B., Hassinger, T. D., Letourneau, P. C., Kater, S. B. Chondroitin sulfate proteoglycan elevates cytoplasmic calcium in DRG neurons. Developmental biology. 166, 87-100 (1994).
  18. Snow, D. M., Brown, E. M., Letourneau, P. C. Growth cone behavior in the presence of soluble chondroitin sulfate proteoglycan (CSPG), compared to behavior on CSPG bound to laminin or fibronectin. Int J Dev Neurosci. 14, 331-349 (1996).
  19. Snow, D. M., Lemmon, V., Carrino, D. A., Caplan, A. I., Silver, J. Sulfated proteoglycans in astroglial barriers inhibit neurite outgrowth in vitro. Experimental neurology. 109, 111-130 (1990).
  20. Snow, D. M., Letourneau, P. C. Neurite outgrowth on a step gradient of chondroitin sulfate proteoglycan (CS-PG). Journal of neurobiology. 23, 322-336 (1992).
  21. Snow, D. M., Mullins, N., Hynds, D. L. Nervous system-derived chondroitin sulfate proteoglycans regulate growth cone morphology and inhibit neurite outgrowth: A light, epifluorescence, and electron microscopy study. Microsc Res Tech. 54, 273-286 (2001).
  22. Barres, B. A., Silverstein, B. E., Corey, D. P., Chun, L. L. Immunological, morphological, and electrophysiological variation among retinal ganglion cells purified by panning. Neuron. 1, 791-803 (1988).
  23. Firnhaber, C., Hammarlund, M. Neuron-specific feeding RNAi in C. elegans and its use in a screen for essential genes required for GABA neuron function. PLoS genetics. 9, e1003921(2013).
  24. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 195, 231-272 (1992).
  25. Hollyday, M. Chick wing innervation. I. Time course of innervation and early differentiation of the peripheral nerve pattern. The Journal of comparative neurology. 357, 242-253 (1995).
  26. Hollyday, M., Morgan-Carr, M. Chick wing innervation. II. Morphology of motor and sensory axons and their growth cones during early development. The Journal of comparative neurology. 357, 254-271 (1995).
  27. Honig, M. G., Kueter, J. The expression of cell adhesion molecules on the growth cones of chick cutaneous and muscle sensory neurons. Developmental biology. 167, 563-583 (1995).
  28. Tosney, K. W., Landmesser, L. T. Development of the major pathways for neurite outgrowth in the chick hindlimb. Developmental biology. 109, 193-214 (1985).
  29. Dontchev, V. D., Letourneau, P. C. Nerve growth factor and semaphorin 3A signaling pathways interact in regulating sensory neuronal growth cone motility. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 22, 6659-6669 (2002).
  30. Munoz, L. M., et al. Ephrin-A5 inhibits growth of embryonic sensory neurons. Developmental biology. 283, 397-408 (2005).
  31. Roche, F. K., Marsick, B. M., Letourneau, P. C. Protein synthesis in distal axons is not required for growth cone responses to guidance cues. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 29, 638-652 (2009).
  32. Condic, M. Adult neuronal regeneration induced by transgenic integrin expression. Journal of Neuroscience. 21, 4782-4788 (2001).
  33. Hory-Lee, F., Russell, M., Lindsay, R. M., Frank, E. Neurotrophin 3 supports the survival of developing muscle sensory neurons in culture. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, 2613-2617 (1993).
  34. Toyofuku, T., et al. FARP2 triggers signals for Sema3A-mediated axonal repulsion. Nature neuroscience. 8, 1712-1719 (2005).
  35. Steinmetz, M. P., et al. Chronic enhancement of the intrinsic growth capacity of sensory neurons combined with the degradation of inhibitory proteoglycans allows functional regeneration of sensory axons through the dorsal root entry zone in the mammalian spinal cord. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 25, 8066-8076 (2005).

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재인쇄 및 허가

태그

병아리 배아에서 분리 및 해리 감각 뉴런의 문화
문의하기
도서관에 추천하기

개인정보 처리방침

이용 약관

정책

저작권 © 2026 MyJoVE Corporation. 모든 권리 보유.