단백질 아르기닌 메틸화, 즉 효소의 클래스에 의해 촉매. 단백질 아르기닌 메틸 트랜스퍼 (PRMTs)는 단백질 내의 아르기닌에 메틸기 (들)의 첨가의 효소 과정이다. 체외 메틸화 분석은 공지 또는 신규 PRMT 기판의 메틸화 상태를 평가하기위한 가장 신뢰할 도구이다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
이 논문에서
요약
초록
단백질 아르기닌 메틸화는 핵에서 가장 풍부하게 번역 후 변형 중 하나이다. 단백질 아르기닌 메틸화는 식별 및 / 또는 프로테오믹스 방법을 통해 결정, 및 / 또는 메틸 아르기닌 특이 항체 발현 수준으로 할 수있다. 그러나, 이러한 기술은 때때로 오해의 소지가 될 수 있으며 종종 거짓 긍정적 인 결과를 제공한다. 가장 중요한 것은, 이들 기술은 메틸화 분석법은, 반면에, 민감한 유용한 생화학 분석법이다 체외. PRMT의 기질 특이성을 지원하는 직접적인 증거를 제공 할 수 있고, 식별 된 단백질이 실제로 PRMT 기판 인 경우 일관 공개. 전형적인 관내 메틸화 분석은 정제 된 활성 PRMTs 정제 기판과 방사성 동위 원소 표지 된 메틸 공여체 (S-아데노 실-L-[메틸 3 H] 메티오닌)을 포함한다. 여기에서 우리는 촉매 활성 PRMT1, 재하 표현 PRMT의 가족을 분리하는 단계별 프로토콜을 설명합니다. 나정제 PRMT1의로 메틸 트랜스퍼 활동 이후 S-아데노 실-L-메틸 공여체로서 [메틸 3 H] 메티오닌의 존재하에, 단백질 1 (G3BP1)를 결합 라스-GTPase 활성화 단백질, 공지 PRMT 기판 상에 시험 하였다. 이 프로토콜은 새로운 생리 PRMT1 기판의 메틸화 상태를 설정하기위한,뿐만 아니라 단백질 아르기닌 메틸화의 기본 메커니즘을 이해하기 위해 단지 사용될 수있다.
서론
단백질의 메틸화는 첫째 1968 일에 설명했다. 그것은 연구자들이이이 번역 후 변형의 중요성을 인식하기 시작, 1996 년 PRMT1의 첫 번째 복제까지되지 않았습니다. 흥미롭게도, 핵 추출물의 단백질 아르기닌 잔기의 약 2 %는이 수정의 풍요 로움을 나타내는 3 메틸화된다. 아르기닌 될 수 아르기닌 측쇄 내의 염기성 측쇄와 질소 / s와 양전하를 띤 아미노산 포스트 병진 메틸기, 아르기닌 메틸화 4-6로 알려진 프로세스를 추가로 변경됨. 아르기닌 메틸화 효소 즉의 클래스에 의해 촉매된다. 단백질 아르기닌 메틸 트랜스퍼 (PRMTs). 아르기닌은 monomethylated 또는 dimethylated 후자는 공정 4-6 PRMTs 촉매의 종류에 따라 대칭 또는 비대칭이 될 수 될 수 있습니다.
arginin 표시 단백질전자 글리신이 풍부한 모티브 PRMT 매개 촉매에 대한 잠재적 인 대상이다. 기판 PRMT 매개 메틸화 정상 세포 항상성 7-9에 중요한 모두의 단백질 - 단백질 상호 작용, 단백질 - 핵산 상호 작용, 단백질 기능, 유전자 발현 및 / 또는 세포 신호 전달을 조절하는 것으로 ....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
식 구조의 1 준비
- 프로토콜을 시작하기 전에, N-말단 에피토프 태그 (Myc와 또는 HA), 및 박테리아 세포에서 높은 수준의 단백질 발현 및 정제를위한 기판에서 프레임 글루타치온-S-전이 효소 (GST)와 함께 포유 동물 발현 벡터에 클론 PRMTs 표준 분자 생물학적 기술을 이용하여 용 해물.
PRMTs의 2 정제
- 인간 기관지 상피 세포 (Beas2B)을 유지하기 위해 100mm 배양 접시를 사용합니다. 통로 세포를 3 일마다 그들을 합류로 성장할 수 있도록하지 않습니다.
- 형질 감염 전날에, 100mm 배양 접시에 10 ml의 배지에 7.5 × 105 세포를 시드. 소용돌이 균일하게 세포를 분산하고, 5 % 가습 CO 2 배양기에서 37 ° C에서 배양한다.
- 다음날, 미디어를 대기음 혈청과 항생제없이 배양 배지 5 ㎖를 추가합니다. 소용돌이와 매체를 대기음. 이 단계를 반복 한더 많은 시간, 최종적 혈청 / 항생 배지 5 ㎖를 추가로 진행 형질.
- 멸균 된 1.5 ㎖의 플라스틱 원심 분리기 튜브에서 무 혈청 배지 750 μL로 플라스미드 DNA 6 μg을 희석.
- 또 다른 1.5....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
GST-G3BP1 메틸화하는 HA-PRMT1의 능력은 체외 메틸화 분석에 의해 결정되었다. Beas2B 세포 용 해물로부터 정제 HA-태그 PRMT1는 GST-G3BP1를 포함하는 메틸화 반응에 고용되었다 메틸 공여체 S-아데노 실-L-[메틸 3 H] 메티오닌 1 μCi. PRMT1 효율적 GST-G3BP1 (그림 1, 상단 패널)의 메틸화를 촉진 할 수있다. 음성 대조군 (그림 1, 상판, 차선 1)을 역임 빈 벡터 형질 Beas2B 세포의 용 해물을 수행 풀다운을 사용하여 메틸화 반응. PRMT1의 발현이 항-HA 항체와 면역 블로 확인했다 (그림 1, 가운데 패널). Ponseau-S 염색 반응은 모두 GST-G3BP1 동등한 하중 (도 1, 하부 패널)을 입증하기 위해 사용되었다.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
본원에 기재된 프로토콜은 통상적으로 식별 PRMT 기판의 메틸화 상태를 설정하는 데 사용된다. 이 강력하고 일관성있는 분석은 또한 기판에 대한 PRMTs의 특이성에 대한 결정적인 증거를 제공 할 것입니다. 이 분석의 성공을위한 핵심 구성 요소는 다음과 같습니다 포유 동물 세포에서 PRMTs의 1 식, 정제 PRMTs의 2 활동, 3 식 및 기판의 정제 및 니트로 셀룰로오스 막에 단백질의 4 완료 서부 전송.
재조합 PRMTs 표현 및 세균으로부터 정제는 또한 시험관 10,11,13 메틸화 반응에서 사용될 수있다. 각 PRMT 다른 정제 전략, 저장 조건 및 저장 온도를 필요로하기 때문에, 재조합 PRMTs의 사용은 시험 관내 메틸화 반응은 적합하지 않을 수있다. 또한, 재조합 PRMTs는 단명 (11)이다. 이러한 문제를 고려하면, 우리는 끝까지 마음을 믿는다포유 동물 세포에서 PRMTs의 동북 아시아의 .......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
저자가 공개하는 게 없다.
감사의 글
본 연구는 재향 군인의 미국학과에서 우수상 지원하고, NIH는 RW하는 R01CA138528을 부여했다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| S-아데노실-L-[메틸-3H] 메티오닌 | Perkin Elmer | ||
| Ecoscint ultra | National Diagnostics | LS-270 | |
| 병 상단 디스펜서 | National Diagnostics | LS-900 | |
| AutoFluor | National Diagnostics | LS-315 | |
| 6 ml 섬광 바이알 | National Diagnostics | SKU:SVC-06 | |
| GST-sepharose | GE Life Sciences | ||
| L-글루타티온 환원 | 시그마 | G4251 | |
| Lipofectamine | Invitrogen | 형질주입 시약 | |
| , Beas2B, | ATCC | ||
| , Optimem, | Invitrogen | ||
| NP-40 | US-Biologicals, | ||
| SDS, | 시그마 | ||
| , 나트륨, 데옥시콜레이트 | 시그마 | ||
| PMSF | 시그마 | ||
| 항 HA 친화성 매트릭스 | Roche | ||
| Tris | Sigma | ||
| Nacl | Sigma Bio-rad | ||
| gel doc | Bio Rad | ||
| 항 HA 항체 | roche | ||
| Ponseau S | Fisher Scientific |
참고문헌
- Paik, W. K., Kim, S. Protein methylase I. Purification and properties of the enzyme. J Biol Chem. 243, 2108-2114 (1968).
- Lin, W. J., Gary, J. D., Yang, M. C., Clarke, S., Herschman, H. R. The mammalian immediate-early TI....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
