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방법 논문

마우스 폐에 섬유소 젤의 주입은 폐 관련 신생 혈관 연구에

9.7K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/52012

⸱

2014년 12월 21일

 , 
1Vascular Biology Program, Department of Surgery, Boston Children's Hospital and Harvard Medical School

이 논문에서

요약

국소 혈관 신생을 자극하는 장기 특이적 미세환경의 재현은 손상된 조직의 성공적인 재생을 위해 필수적입니다. 이 보고서는 폐 특이적 미세환경이 성체 쥐의 혈관 신생과 폐포 재생을 조절하는 방법을 탐구하기 위해 살아있는 쥐의 폐 표면에 피브린 젤을 이식하는 새로운 방법을 보여줍니다.

초록

줄기 세포 연구와 생명 공학 기술의 최근 중요한 발전은 재생 및 정형 외과 및 치주 분야에서 간단한 조직에 손상을 복구하는 생체 물질을 활용에 큰 진전을 만들었습니다. 장기 재생의 생물학적 과정을 잘 탐구되지 않은 때문에 구조 및 폐 등과 같은보다 복잡한 3 차원 (3D) 장기의 기능을 재생하려고 시도하는 것은 매우 성공적이지 못 하였다. 이는 혈관 신생은 새로운 혈관의 형성은, 기관 재생에 중요한 역할을한다는 것을 분명 해지고있다. 새로 vasculatures 산소, 영양분 및 장기 재생을 위해 요구되는 다양한 세포 구성 요소를 제공 할뿐만 아니라, 조직 재생에 유익한 로컬 신호를 제공하지 만 형성. 그러므로, 성공적으로 성인의 폐를 재생하기 위해서는 로컬 폐 조직의 재생을 드라이브하는 혈관 신생 폐 특정 미세 환경 요점을 되풀이하는 것이 필요하다. 공동 비록nventional 생체 등의 히드로 겔 (예를 들어, 섬유소 또는 콜라겐 젤 또는 마트 리겔 - Engelbreth-홀름 - 떼 마우스 육종 세포에 의해 분비 ECM 단백질 혼합물)이 풍부한 세포 외 기질 (ECM)의 피하 주입으로 혈관 신생 분석, 광범위하게 탐구하기 위해 사용된다 폐에 생체 재료의 소성을 주입하는 방법이 잘 확립되지 않았기 때문에 혈관의 일반적인 메커니즘은, 폐 특정 혈관 신생은 잘 특징되지 않았습니다. 이 프로토콜의 목적은 겔 내부 호스트 폐 유래의 혈관 신생을 성공적 재현부 허용 살아있는 성인 마우스의 폐 표면 상 피브린 겔을 이식하는 독특한 방법을 도입하는 것이다. 이 방법은 폐 별 미세 정상 및 병적 상태 모두에서 혈관 신생과 치조골 재생을 제어하는​​ 메커니즘을 탐구하는 연구자 수 있습니다. 이식 된 생체 재료에 출시 된 이후 인접 리터에 물리적, 화학적 신호를 공급하고웅 조직, 폐 병변 이러한 생체 물질의 주입은 잠재적 폐 질환의 다양한 유형에 대한 새로운 치료 방법을 개발하기 위해 연구를 가능 인접 병든 조직을 정상화 할 수있다.

서론

이 프로토콜의 전반적인 목적은 연구자 폐 혈관 및 폐포 개발의 분자 메커니즘을 특성화 할 수 성인 마우스의 폐 표면 상 피브린 겔을 이식하는 방법을 소개하고, 가능한 생체 모방 물질을 개발하기 위해이 지식을 활용하는 것이다 각종 폐 질환을 치료하는 생리 폐 혈관 및 폐포의 형성을 recapitulating.

35 개 이상의 만 명의 미국인이 만성 폐쇄성 폐 질환과 폐 섬유증을 포함한 만성 폐 질환으로 고통 받고 있습니다. 이 환자는 크게 일상 생활 1-3을 손상 등의 호흡 곤란, 흉부 압박감, 잔소리 기침, 피로 오래 지속되는 만성 호흡기 증상을 가지고있다. 이러한 폐 질환에 대한 효과적인 치료법을 개발하는 노력의 큰 금액에도 불구하고, 현재 치료법이 없다; 따라서, 이러한 환자의 삶의 질은 가난하고 경제적이며, 인간의 비용은 안녕하다GH 4-7. 현재 폐 이식은 말기 만성 폐 질환을 가진 환자를 저장할 수있는 유일한 방법입니다. 그러나, 이식 기증자, 높은 비용, 심각한 합병증, 낮은 생존율 8-11의 부족, 이식은 최적의 방법이 아닙니다. 조직 공학 기술 최근의 급속한 발전은 전구 세포 나 유도 만능 줄기 (IPS) 세포 12,13 다양한 종류의 탈세 포화 전체 폐를 다시 채우기에 의해 이식 폐를 생명 공학자 인 연구자를 가능하게했다. 그러나 이러한 생체 공학 폐는 주입 12,14,15 후 몇 시간 동안 호스트 동물의 기능입니다. 폐의 복잡한 구조 및 기능을 재생시키기 바이오 소재를 활용하여도 상당히 성공적이지 못했다. 성인 폐 재생을 제어하는​​ 키 생물학적 과정이 잘 탐험되지 않은 때문일 수 있습니다. 폐에서 혈관 시스템의 형성은 초기의 가장 중요한 이벤트 중 하나 두리입니다NG 개발 및 재생 16-21. 새롭게 산소 만, 영양분과 기관 형성을 위해 요구되는 다양한 세포 구성 요소를 제공 할뿐만 아니라, 주위의 세포에 유익한 22-25 규제 신호를 제공하지 폐 vasculatures 형성. 따라서, 혈관 신생은 성인 폐 24,26,27 회생 폐포에 중요한 역할을한다. 또한, 규제 완화 된 혈관 형성은 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD) (28), 기관지 폐 이형성증 21-23, 29 및 폐 섬유증과 같은 만성 폐 질환에 기여한다. 따라서, 폐 엔지니어링 또는 만성 폐 질환을 치료하기위한보다 효율적인 전략을 개발하기 위해서는, 특정의 폐 혈관의 근본적인 메커니즘을 이해하는 것이 필요하다.

각 기관은 생리적, 병리 적 상태로 30 ~ 33 사이에 다를 수 있습니다 고유의 기계적, 화학적 특성을 표시합니다. 이 기관 고유의 microenviron사항은 내피 세포의 행동을 조절하고 기관 고유의 방식으로 24,34-36 혈관 네트워크 형성을 조율. 따라서, 폐보다 효율적인 재생을위한 전략을 개발, 폐 혈관 관련 기본 메커니즘은 이해되어야한다. 피하 하이드로 겔 주입 등의 생체 기존의 혈관 신생 분석은 혈관 신생 연구 37-39 광범위하게 사용되었지만, 그 방법은 기관 고유의 혈관 신생을 요점을 되풀이하지 않습니다. 최근에 마우스 폐 탄성 금형에 이식 마트 리겔을 신규 한 방법이 개발되고 성공적 겔 (22)에 혈관과 폐 상피 세포를 보충하는 것으로 나타났다. 이 독특한 접근 방식은 연구자가 생리적, 병리 적 상태에서 혈관 및 비 혈관 폐 세포 사이의 폐 특정 혈관 신생의 메커니즘뿐만 아니라 상호 작용을 탐구 할 수 있습니다. 1) 마트 리겔은 임상 적용에 적합하지 않기 때문에; 2) 예를더 임상 적 접근법으로서, 하이드로 겔 및 호스트 폐 조직 및 3) 폐에 탄성 몰드 잠재적 호흡 동안 폐 기능 및 통증 장애 발생 사이의 상호 작용에 영향을 미칠 수있는 겔을 캐스팅하는데 사용 lastic 금형, 3D 피브린 매트릭스가 혈관 신생 인자를 함유하는 (혈관 내피 성장 인자 (VEGF) / 염기성 섬유 아세포 성장 인자 (bFGF)) 탄성 몰드에 캐스팅없이 마우스 폐에 주입되었고, 성공적 호스트 폐 유래의 혈관 신생을 효과적으로 요약했다. 피브린 겔, 트롬빈 절단 된 피브리노겐으로부터 생성 중합체는 피 브릴, 트랩 40,41 생체 내에서 혈관 신생을 촉진하는 등의 bFGF와 VEGF의 혈관 신생 인자와 같은 다양한 공지되어있다. 그 때문에 회생 능력과 생분해 자연 42 피브린 겔 널리 조직 공학 분야에서 사용된다.

이 문서에서는 생활 adul의 폐 표면에 섬유소 젤을 이식하는 새롭고 독특한 접근 방식을 소개합니다t 마우스와 호스트 폐 유래 혈관이 생체 내에서 젤 내부에 효과적으로 요약되어 있음을 보여줍니다. 폐 혈관 신생 관련 공부 연구자 있도록 이러한 방법은, 아마도 폐 질환의 다양한 유형에 대한 새로운 치료 방법의 개발로 이어질 상당히 성공적 성인 폐를 재생하는 노력을 진행한다.

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프로토콜

참고 : 생체 내 동물 연구는 국립 보건원 (National Institutes of Health)의 실험 동물의 관리 및 사용을위한 설명서의 권장 사항을 엄격히 준수하여 실시 하였다. 이 프로토콜은 검토하고 보스턴 아동 병원의 동물 관리 및 사용위원회 (프로토콜 번호 : 13-10-2526R, 14-02-2568R)에 의해 승인되었다. 이 프로토콜에서 사용되는 모든 약물은 제약 학년이며,이 약은 무균 상태에서 제조된다.

1. 섬유소 젤 준비

  1. VEGF와 bFGF에 포함되어 섬유소 젤을 준비합니다.
    1. 실온까지 -80 ° C (25 ℃)에서 저장된다 피브리노겐과 트롬빈 녹여 원액.
    2. 피브리노겐에 (0 ~ 100 NG / ml의 최종 농도), 염화칼슘 (2) (최종 농도 45 mM의), VEGF (최종 농도 0 ~ 100 NG / ㎖)과의 bFGF : 트롬빈 (2.5 U / ml의 최종 농도)를 추가합니다 솔루션 (최종 농도 0.9 %의 sodiu 12.5 ㎎ / ㎖m 1.5 ML 튜브에 염화물 용액 43 ~ 45).
    3. 피펫으로 가볍게 섞는다.
    4. 부드럽게 P200 피펫 팁을 사용하여 드롭 현명한 방식으로 멸균 플라스틱 접시에 혼합물의 200 μl를 피펫.
    5. 그들은 응고 될 때까지 30 ~ 60 분 동안 37 ° C에서 방울을 품어.
      주 : 겔이 고체화 주입 (도 1a) 전에 몇 시간 동안 실온 (25 °의 C)에서 밀봉 된 플라스틱 접시에 유지 될 수있다.
  2. 주입하기 전에 작은 수술 가위를 사용하여 약 3 × 3 × 3mm 큐브에 섬유소 젤 트림.

2. 마우스 준비

  1. 복강에 케타민 (100 ㎎ / ㎏)과 자일 라진 (10 ㎎ / ㎏)의 (IP) 주입을 성인 마우스 (8~12주)를 마취와 마우스가 적절하게 마우스의 발가락을 곤란하게하여 마취되어 있는지 확인합니다.
    1. 실험 기간 동안 건조를 방지하기 위해 마우스의 눈에 수의사 연고를 사용합니다.
  2. 애프터 셰 이브 쿵푸마우스의 흉곽의 좌측을 통해 R.
  3. 마우스의 기관 내 삽관을 수행합니다.
  4. 삽관에 마우스가 70 °로 각도 서서 스탠드 상단에있는 작은 고무 밴드를 통해 상부 앞니를 후킹하여 위치에 마우스를 잡아 놓습니다.
  5. 조심스럽게 무딘 집게를 사용하여 한쪽으로 혀를 집어 넣으.
  6. 광섬유 구즈넥 현미경 조명의 도움으로 후두를 시각화.
  7. 기관에 기관 탄성 카테터 (21 G)를 삽입합니다.
  8. 마우스가 자발적으로 (보통 100 ~ 150 호흡 / 분, 아니 역설적 또는 얕은 호흡) 부드러운 방법으로 호흡 있는지 확인합니다.
  9. 해부 현미경으로 발생하기 쉬운 위치에 마우스를 놓습니다.
  10. 기계적으로 설치류 인공 호흡기 사용하여 마우스 환기 (150 호흡 / 분, 7 ml에 / 호흡량을 kg).
  11. 4 번째와 5 번째 늑골 사이 늑간 공간을 찾기 위해 갈비뼈를 계산합니다.
  12. B 영역에 걸쳐 멸균 필드 만들기Y는 철저하게 알코올과 포비돈 - 요오드로 닦는 것. 무균 수술 드레이프 적절하게 수술 부위를 커버.

3. 마우스 수술

  1. 피부에 0.25 % bupivacaine을 (200 μL)의 지방 주입 후, 해부 가위를 사용하여 늑간 공간을 통해 가로 피부 절개 (약 1cm 길이)합니다.
  2. 늑간 근육에 0.25 %의 부피 바카 (200 μL)를 주입 한 후, 미세한 작은 가위를 사용하여 4 번째와 5 번째 갈비뼈 사이의 근육 절개를합니다.
  3. 완전히 왼쪽 폐를 시각화하기 위해 갈비뼈 사이의 해부 견인기를 삽입합니다.
    1. 미세 집게를 사용 왼쪽 폐의 중심의 내장 늑막의 작은 지역 (1 × 1mm 광장)를 쳤어요.
    2. 출혈 및 공기 누출을 완전히 제어 될 때까지 멸균 면봉을 사용하여 영역에 약간 힘을 주어.
    3. 피브리노겐 / 트롬빈 (피브린 접착제)의 신선한 혼합물 (단계 1.1.2. 20 & #의 소량을 넣어181; P200 피펫 팁을 사용하여 영역에 걸쳐 L).
  4. 조심스럽게 영역 (그림 1b)를 통해 작은 집게를 사용하여 하나 섬유소 젤 (1.2 단계)를 배치합니다.
    1. 젤 잘 폐의 호흡 운동시 지역에 고정되어 있는지 확인합니다.
  5. 도 대규모 공기 누출이나 폐에서 출혈이 있는지 확인합니다.
  6. 이없는 흡수성 봉합사와의 긴밀한 절개 (근육과 피부 층), 제거 할 수 있습니다.
  7. 기흉을 방지하기 위해 27 G 바늘과 1 ML의 주사기를 사용하여 흉강을 대기음.
  8. 기계 환기를 종료합니다.

4. 마우스 복구

  1. 마우스가 자발적으로 부드러운 방법 (일반 100 ~ 150 호흡 / 분, 아니 역설적 또는 얕은 호흡)에서 호흡되어 있는지 확인합니다.
  2. IP는 1 ㎖ 주입 탈수를 방지하기 위해 0.9 %의 NaCl을 미리 예열.
  3. 마우스가 순환 온수 패드에 복구 할 수 있습니다.
  4. endotrache 제거마우스가 안정된 호흡을 확인 후 알 튜브.
  5. 수술후 진통제로서 3 일간, 멜 록시 캄 (5 ㎎ / ㎏, 피하 주사 (SC)를 주입한다.
  6. 이 (복부에 출시 할 수 똑바로 유지) 흉골과 의식 때까지 조심스럽게 15 분 간격의 최소 마우스의 움직임을 모니터링합니다.
  7. 복구 후, 수술없이 생쥐에서 분리 된 새로운 케이지에 마우스를 반환합니다.
  8. 매일 다음과 같은 감염의 징후 (발적, 부종, 방전), 동물의 기본적인 생물학적 기능 (음식과 물을 섭취, 배뇨, 배변, 체중 증가)뿐만 아니라 임상 증상의 고통에 대한 수술 부위 (경직 감소 운동을) 모니터 수술.

5. 수확 폐

  1. 7~30일 주입 후, 압축 가스의 소스를 통해 CO 2를 사용하여 마우스를 안락사.
  2. xyphoid 과정의 팁과 흉골 사이에 절개를합니다노치 (중간 흉골)와 호흡 관을 절단과 심장, 폐, 기관지에 모든 연결을 해부하여 조직 학적 및 생화학 적 분석을위한 이식 젤 수확 전체 폐.
  3. 하룻밤의 OCT 화합물에 포함 된 4 ºC에서 4 % 파라 포름 알데히드 용액으로 폐 이식 젤을 수정, 30 μm의 두께의 직렬 단계 섹션을.
  4. 조직 학적 (헤 마톡 실린 및 에오신 염색) 및 면역 조직 화학 분석을 수행합니다 (내피 마커 : CD31, 상피 마커 : 아쿠아 포린 (AQP) 5 계면 활성제 단백질 (SP) -B) 공 초점 현미경 22,37,40를 사용하여.
  5. 3D 이미지 분석 소프트웨어 (37)를 이용하여 폐 내피 세포의 3 차원 영상 및 상피 세포를 형성하는 광학 부 (30 μm의 두께)의 스택을 컴파일한다.
  6. 이미지 분석 소프트웨어 (46)를 이용하여 새로 형성된 혈관의 투영 면적을 정량화.

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결과

호스트 폐 유래 혈관 형성은 폐에 주입 된 생체 물질의 내부에 효과적으로 요약되어 있는지 여부를 조사하기 위해서, 피브린 겔 주요 혈관 신생 인자의 VEGF와 bFGF를 보충 (0, 10, 100 ng이다 / mL 씩)로서 살아있는 마우스의 폐 표면 상에 이식 하였다 마트 리겔 (22)를 사용하여보고했다. 도 1a에 도시 된 바와 같이, 이러한 혈관 성장 인자를 포함하는 피브린 겔 (47)을 제작 하였다. 개흉술 후, 좌측 폐 표면의 작은 영역은 집게를 사용하여 긁어시키고 제조 피브린 겔 FDA 승인 널리 정지 효과적인 실란트로서 사용된다 피브린 접착제를 소량 사용하여 성인 쥐의 폐에 주입시켰다 공기 누출 및 폐 수술 48, 49 (그림 1b)를 출혈 줄일 수 있습니다. 대부분의 마우스는 심한 호흡기 증상 (예를 들면, 기흉, 호흡 곤란)없이 회복. 이레 주입 한 후, 마우스는 안락사와 폐 하...

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토론

이 문서에서는 성인 마우스를 삶의 폐 표면에 생체 적합 물질을 이식하는 새로운 방법을 소개합니다. 이 시스템을 호스트 폐 유래 혈관이 성공적으로 재료 내부에 효과적으로 요약된다. 이 시스템은 연구자가 내피 세포 사이의 크로스 토크를 탐색 할 수 있습니다, 다른 세포 (예를 들면, 상피 세포, 중간 엽 세포, 면역 세포) 지역의 혈관 신생 50 ~ 53과 치조골 재생 24,54에 필요한 다양한 ECM 구성 요소. 기존의 생체 내 피하 하이드로 겔 주입이 혈관 신생 연구 37-39 광범위하게 사용되었지만, 그 방법은 기관 고유의 혈관 신생을 요점을 되풀이하지 않습니다. 하이드로 겔 폐 표면에 직접 주입하는이 ​​시스템은, 성인 쥐의 폐에서의 혈관 신생 및 치조골의 재생 폐 특정 미세 환경의 역할을 조사하기 위해 연구를 가능하게 할 것이다. 이러한 겔은 다양한 ECM 풍부한 biomate 제조 될 수있다다양한 화학 인자 (예 :

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공개 사항

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

감사의 글

이 작품은 미국 심장 협회 (AM), 미국 국방부 (BC074986), 보스턴 어린이 병원 교수 경력 개발 원정대 (TM, AM)에서 기금에 의해 지원되었다. 저자는 기술 지원을 아만다 장과 엘리자베스 지앙 감사합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
인간 태반에서 추출한 피브리노겐SigmaF4883
소 플라즈마에서SigmaT9549피브린 젤 제조용
조합 마우스 VEGF 164R& D493-MV피브린 젤 보충을 위해
재조합 마우스 bFGFR& D3139-FB피브린 젤 설치
류 삽관 스탠드Braintree Scientific INCRIS 100삽관 광섬유
광원Fisher Scientific12-565-35삽관
21G 탄성 카테터B.Braun4251652-02삽관
MiniVent 인공 호흡기Harvard 장치CGS-8009 surgey
Absobable 봉합EthiconPDP304
항체Biosciences553370
AQP5AbcamAB78486Immunohistochemistry
항체에 대한 SP-B에 대한 면역조직화학 항체AbcamAB40876면역조직화학
피브린 겔 트롬빈 제작 재사 Ethicon PDP304 수술용 봉합사 수술용 봉합사 BD

참고문헌

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