방법 논문

정상과 병에 걸린 미국에서 혈병 구조를 조사하기위한 실험 및 이미징 기술

DOI:

10.3791/52019

⸱

2015년 4월 1일

 ,  ,  , 
1Wallace H. Coulter Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology & Emory University School of Medicine, 2Parker H. Petit Institute for Bioengineering & Bioscience, Georgia Institute of Technology, 3George W. Woodruff School of Mechanical Engineering, Georgia Institute of Technology

이 논문에서

요약

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이 원고에서는 질병 상태로 인한 정상 및 비정상 혈전 구조 간의 형태학적 차이를 조사하기 위해 혈액 준비, 컨포칼 현미경 검사 및 용해 속도 분석을 포함한 실험 기술을 제시합니다.

초록

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Fibrin은 혈전의 구조적 무결성을 유지하는 역할을 하는 세포 외 기질 단백질입니다. 지난 몇 년 동안 피브린에 대한 많은 연구가 이루어졌으며 여기에는 합성, 구조 기능 및 혈전의 용해에 대한 조사가 포함됩니다. 그러나 질병을 앓고 있는 환자로부터 발생하는 혈전의 형태학적, 구조적 특징에 대해서는 아직 많은 것이 알려져 있지 않습니다. 본 연구에서는 당뇨병 및 겸상 적혈구 빈혈과 같은 질병 상태로 인한 비정상적인 혈전 구조의 형태학적 차이를 조사할 수 있는 실험 기법을 제시합니다. 본 연구는 다양한 실험 분석법과 컨포칼 현미경을 사용하여 형태학적 차이를 평가하기 위해 피브린 혈전의 준비 및 평가에 중점을 둡니다. 또한 피브린 혈전의 용해 속도를 지속적으로 실시간으로 계산할 수 있는 방법도 설명되어 있습니다. 본 명세서에 기술된 기법은 당뇨병 또는 겸상적혈구질환 환자에서 심근경색, 허혈성 심장질환 및 뇌졸중과 같은 동반이환 혈전성 병리학을 규명하고자 하는 연구자 및 임상의에게 중요합니다.

서론

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혈관의 내피 라이닝 부상은 지혈 반응, 또는 혈전 형성을 통해 복구된다. 혈액 세포 외 매트릭스에 침투 할 때, 조직 인자는 응고 캐스케이드의 개시를 촉진 혈류 혈소판 활성화. 이 치유 과정의 핵심 요소는 기계적 고탄성 아르 피브린 섬유로 구성된 피브린 매트릭스이며, 큰 힘을 견딜 수있는 1-4. 많은 연구자들은 광범위 지난 수십 5-13 피브린의 형성 구조 및 기능을 연구 하였다.

예컨대 당뇨병 및 겸상 적혈구 질환 등 환자는 심근 경색, 허혈성 심질환 등의 혈전 성 합병증의 발병 위험이 증가하고, 14 ~ 19 스트로크. 2 백만 명 이상의 사람들이 새로 미국에서 매년 당뇨병으로 진단된다. 유형 I 여기서, : 두 가지 형태가있다몸은 몸이 인슐린에 저항하게 인슐린 및 유형 II, 충분한 양을 생산하는 데 실패합니다. 당뇨병 환자 중, 심혈관 질환 (CVD)는 질병 (20, 21)과 관련된 이환율과 사망율 80 %의 원인이다.

겸상 적혈구 질환 (SCD)는 미국 22 개 이상 십만명에 영향을 미치는 유전 적 혈액 질환이다. SCD 어려운 세포가 혈액 맥관 구조 ....

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프로토콜

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참고 : 다음 프로토콜은 조지아 공대에서 임상 시험 심사위원회 (IRB)가 설정 한 가이드 라인을 준수합니다.

1. 혈액 수집 및 적혈구 격리 절차

  1. 10 ml의 헤파린 vacutainer 튜브에 기증자의 혈액의 40 ~ 120 ml의를 수집합니다. 컬렉션의 4 시간 이내에 PBMC (말초 혈액 단핵 세포) 분리를 시작합니다. 이 시간 동안 실온에서 혈액을 유지합니다.
    참고 :이 낮은 PBMC 수율 발생합니다으로 RT 또는 4 ° C에서 혈액의 O / N 저장하지 않는 것이 좋습니다.
  2. 전혈 1을 희석 : 1을 얼음처럼 차가운 (4 ° C) 멸균 PBS에.
  3. 피펫 빈, 멸균 50 ML 원뿔 튜브에 얼음처럼 차가운 친수성 ​​폴리 사카 라이드 10 ㎖. 조심스럽게 친수성 ​​폴리 사카 라이드의 상단에 희석 전체 혈액을 전송합니다.
  4. 아주 천천히 튜브의 측면을 따라 느린 설정과 피펫 혈액 25ml를 피펫을 사용합니다. 혈액 센트리하기 전에 당과 혼합되지 않았는지 확인친수성 폴리 사카 라이드는 달리 세포에 독성이 fugation 때문에, PBMC 수율이 낮은 것입니다.
  5. 4 ° C에서 400 XG에 30 분 동안 원심 분리기....

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결과

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당화 섬유소 응고 구조의 공 초점 현미경 분석

정상 및 당화 혈전의 공 초점 현미경 이미지. 그림 3에 제시되어있다 정상 및 당화 혈전의 공 초점 현미경 분석 당화 혈전 밀도와 혈전 중합 동안 FXIIIa의 첨가없이 모두 정상 혈전보다 작은 구멍을 가진 것을 알 수있다. 그림 3a 및도 3b에서, 더 높은 섬유소 농도 (그림 3C 및 3D)와 당화 혈전보다 밀도가 낮은 구조를 만들어 낮은 섬유소 농도가있다.

당화에서 관찰되는 혈전 큰 밀도 (단위 면적당 섬유의 수)은 당뇨병 환자에서 발생 피브리노겐 농도 증가의 결과이다. 정상 혈전에서는 섬유소 더 선형이었고 FXIIIa, 중합시에 더 긴 섬유를 형성하는아마 섬유 간의 가교를 형성 FXIIIa의 결과이다. 당화 혈전의 경우, 섬유도 첨가 FXIIIa으로 짧.......

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토론

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질환 상태에서 응고 메카니즘의 구조에 대한 의미있는 데이터를 얻기 위해서는, 이러한 조건에서 단백질 및 세포의 효과를 결정하기 위해 혈액 응고에 관여하는 인자를 분리하는 것이 중요하다. 이 프로토콜 및 시험 관내에서 당뇨병 상태에서 SCD 피브린 응괴의 구조를 조사하는 목적으로 개발되었다.

이는 변경된 조건 hypercoagulation, 죽상 혈전증 및 CVD 발생할 보낸 질환 상태에서 피브린 형성 및 섬유소 용해에 관여하는 메커니즘을 이해하는 것이 필요하다. 이 실험에서 얻어지는 공 초점 화상으로부터, hypercoagulation 활성이 증가 된 피브리노겐 농도를 유발 당뇨 SCD 상태에서 발생하는 것을 알 수있다. 네트워크를 통해 분기점보다 작은 기공 밀도 피브린 네트워크에서 증가 된 피브리노겐 농도를 초래한다. SCD 환자의 섬유소 네트워크에서 더 많은 섬유소 현재, BU가 아니라이 클러스터로 피브린을 entraps으로서도 네트워크의 구조를 변경 겸상.......

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공개 사항

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저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

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저자는 실험 분석을 개발하는 데 많은 도움이 되는 토론을 해준 Georgia Tech의 Lam Lab에 감사를 표합니다. 이 간행물에 보고된 연구는 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 국립 심장, 폐 및 혈액 연구소(National Institutes of Health)의 연구 지원(수상 번호 K01HL115486과 미국 국립보건원(National Institutes of Health) 소장실의 New Innovator Grant 1DP2OD007433-01의 지원을 받았습니다. 이 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
PBSLife Technologies10010031
Ficoll-Paque (친수성 다당류)GE Healthcare45-001-749
10 ml 헤파린 화 진공 튜브BD Biosciences366643
Human FibrinogenEnzyme Research LaboratoriesN/A
Alexa Fluor 488 human fibrinogen conjugateMolecular ProbesF13191
0.5ml 눈금 마이크로 원심분리기 튜브Fisher Scientific05-408-120
포도당 분말Life Technologies15023-02
FXIIIa효소 연구소N/A
VIS 컨포칼 현미경Zeiss LSM 510LSM 510
50 mM TrisLonzaS50-642
염화칼슘(CaCl2)Sigma Aldrich449709-10G
Vybrant DiD 세포 라벨링 솔루션Life TechnologiesL7781
PlasminEnzyme Research LaboratoriesN/A
염화나트륨(5M NaCl)Life TechnologiesAM9759
통계 모델링 소프트웨어IBMSPSS Statistics 22

참고문헌

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  1. Averett, R. D., et al. A Modular Fibrinogen Model that Captures the Stress-Strain Behavior of Fibers. Biophysical Journal. 103, 1537-1544 (2012).
  2. Carlisle, C. R., et al. The mechanical properties of individual, electrospun fibrinogen fibers.

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재인쇄 및 허가

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