방법 논문

정상과 병에 걸린 미국에서 혈병 구조를 조사하기위한 실험 및 이미징 기술

DOI:

10.3791/52019

⸱

2015년 4월 1일

 ,  ,  , 
1Wallace H. Coulter Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology & Emory University School of Medicine, 2Parker H. Petit Institute for Bioengineering & Bioscience, Georgia Institute of Technology, 3George W. Woodruff School of Mechanical Engineering, Georgia Institute of Technology

이 논문에서

요약

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이 원고에서는 질병 상태로 인한 정상 및 비정상 혈전 구조 간의 형태학적 차이를 조사하기 위해 혈액 준비, 컨포칼 현미경 검사 및 용해 속도 분석을 포함한 실험 기술을 제시합니다.

초록

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Fibrin은 혈전의 구조적 무결성을 유지하는 역할을 하는 세포 외 기질 단백질입니다. 지난 몇 년 동안 피브린에 대한 많은 연구가 이루어졌으며 여기에는 합성, 구조 기능 및 혈전의 용해에 대한 조사가 포함됩니다. 그러나 질병을 앓고 있는 환자로부터 발생하는 혈전의 형태학적, 구조적 특징에 대해서는 아직 많은 것이 알려져 있지 않습니다. 본 연구에서는 당뇨병 및 겸상 적혈구 빈혈과 같은 질병 상태로 인한 비정상적인 혈전 구조의 형태학적 차이를 조사할 수 있는 실험 기법을 제시합니다. 본 연구는 다양한 실험 분석법과 컨포칼 현미경을 사용하여 형태학적 차이를 평가하기 위해 피브린 혈전의 준비 및 평가에 중점을 둡니다. 또한 피브린 혈전의 용해 속도를 지속적으로 실시간으로 계산할 수 있는 방법도 설명되어 있습니다. 본 명세서에 기술된 기법은 당뇨병 또는 겸상적혈구질환 환자에서 심근경색, 허혈성 심장질환 및 뇌졸중과 같은 동반이환 혈전성 병리학을 규명하고자 하는 연구자 및 임상의에게 중요합니다.

서론

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혈관의 내피 라이닝 부상은 지혈 반응, 또는 혈전 형성을 통해 복구된다. 혈액 세포 외 매트릭스에 침투 할 때, 조직 인자는 응고 캐스케이드의 개시를 촉진 혈류 혈소판 활성화. 이 치유 과정의 핵심 요소는 기계적 고탄성 아르 피브린 섬유로 구성된 피브린 매트릭스이며, 큰 힘을 견딜 수있는 1-4. 많은 연구자들은 광범위 지난 수십 5-13 피브린의 형성 구조 및 기능을 연구 하였다.

예컨대 당뇨병 및 겸상 적혈구 질환 등 환자는 심근 경색, 허혈성 심질환 등의 혈전 성 합병증의 발병 위험이 증가하고, 14 ~ 19 스트로크. 2 백만 명 이상의 사람들이 새로 미국에서 매년 당뇨병으로 진단된다. 유형 I 여기서, : 두 가지 형태가있다몸은 몸이 인슐린에 저항하게 인슐린 및 유형 II, 충분한 양을 생산하는 데 실패합니다. 당뇨병 환자 중, 심혈관 질환 (CVD)는 질병 (20, 21)과 관련된 이환율과 사망율 80 %의 원인이다.

겸상 적혈구 질환 (SCD)는 미국 22 개 이상 십만명에 영향을 미치는 유전 적 혈액 질환이다. SCD 어려운 세포가 혈액 맥관 구조 (23)를 통과하도록하기 위해, 초승달 모양 될 적혈구 발생 점 돌연변이 질환이다. 이들 질환 상태는 모두 몸에서 죽상 조건을 개발할 가능성을 증가시킨다. 이에 대한 이유 중 하나는 병에 걸린 상태에서 변경 14,24-26 피브린의 구조와 기능의 결과이다.

모두 당뇨병과 겸상 적혈구 질환에서 hypercoagulation 및 죽상 혈전증과 심혈관 질환을 유발 hypofibrinolysis 활동 (C가있다VD) 건강한 환자에 비해 17,27,28. 이 hypofibrinolysis이 죽상 동맥 경화증의 진행을 촉진하고 조기 관상 동맥 질환 29 환자 재발 허혈성 이벤트를 낳는다 것으로 알려져있다. 현재 원고에서, 우리는이 특정 설정에 섬유소 물리적 특성의 역할을 조사했다. 비 병든 환자 혈병 구조는 얇은 섬유, 큰 모공, 일반적으로 밀도가 낮은 (14, 24)로 구성된다. 건강한 환자에서 증가 된 다공성 및 저밀도 피브린 혈병 16은 섬유소 용해를 촉진하는 것으로 밝혀졌다. 당뇨 및 겸상 적혈구 질환 hyperthrombotic 조건에서, 건강한 환자들 30-33에서 2.5 ㎎ / ㎖의 정상 수준에서 증가하는 피브리노겐 농도를 일으키는 피브리노겐 생산의 증가가있다. 건강한 비 DIA에 비해 당뇨병 환자에 형성된 피브린 혈병 더 분기점을 가지고, 밀도, 더 강성, 다공성이 덜한 것으로 밝혀졌다betic 환자 14,24,33-35. 변형 구조는 피브린 응괴 형성에 관여하는 단백질 당화 발생 메커니즘의 결과이다. 포도당 분자가 적절하게 가교 글루타민 리신 잔기 33,36,37에서 인간 인자 XIIIa에 (FXIIIa)를 억제 피브리노겐 분자에 리신 잔기에 결합 할 때 비 효소 (비가역) 당화 발생한다.

피브린 네트워크의 구조 분석은 최근 광범위하게 연구되어왔다. 특히, 연구자들은 전자 현미경과 혈관 (내피) 세포와 혈관 외 (섬유 아 세포 및 평활근) 모두 세포는 섬유소 구조 (40)를 분석하는 섬유소 구조 (39), 이용 점탄성과 스펙트럼 분석에 미치는 영향을 조사 섬유소 네트워크 (38)의 차원 복원 등을 활용 한 피브린 구조 및 기계적 특성 간의 상관 관계를 실험 개발하여 전산 41 접근 . 본 연구의 초점은 시뮬레이션 당뇨병과 겸상 적혈구 혈전증 조건 하에서 응고 구조를 수립하고 병에 걸린 상태에서 혈전의 구조 검사 및 기능에 대한 공 초점 현미경을 사용하는 것이 었습니다. 섬유소 혈전 인간 피브리노겐, 트롬빈​​ 및 FXIIIa에서 형성되었다. 혈전은 플라스 민을 사용하여 용해시켰다. 당뇨병 조건을 시뮬레이션하기 위해, 피브리노겐의 농도 증가는 체외 피브리노겐 당화를 유도하기 위해 포도당 용액에서 배양 하였다. 겸상 적혈구 질환 응고 조건을 시뮬레이션하기 위해 증가 피브리노겐 농도는 우리 그룹 (42)에 의해 이전에 수행으로 환자로부터 수집 겸상 적혈구 용적률과 혼합 하였다. 이러한 방법은 질병 및 구조 조건 하에서 피브린 응괴 형성 및 섬유소 용해에 관여하는 기능뿐만 아니라, CVD 유도 메커니즘을 조사 하였다. 이들 질환에 대한 현재 정보에 기초하여, 당화 피브린 응고 구조는 적은 밀도로했다ND 작은 구멍. 겸상 적혈구 환자 (적혈구)에서 적혈구와 섬유소 혈전은 밀도가 있었고, 적혈구의 응집과 응집 섬유소 클러스터를 표시. 이것은 이전에 43 결정된 노포 현상이다. 또한 섬유소 레이트와 건강한 정상 피브린에 비해 감소 플라스없이 당화 피브린 혈병에 훨씬 낮은 것이라고 가정 하였다. 결과는 당화 피브린 혈병 대해 상당히 상이한 용해 속도 결과 만 감소 플라스 농도 조건 하에서 관찰 된 것으로 나타났다. 세포 및 단백질이 응고 활성의 실시간 비디오의 캡처를 가능하게 그 나라의 상태로 남아 있기 때문에, 공 초점 현미경을 사용하여이 실험은 다른 이미징 기술의 방법들에 비해 현저한 장점들을 제공한다. 합성 유도부 응고이 방법은 환자의 샘플을 획득하고 개인을 필터링 또한보다 저렴하고 더 시간 효율적인단백질과 효소. 샘플 간의 변이성은 다른 혈장 단백질의 결과로서 없었다되도록 또한 혈전을 합성 분리 된 단백질 및 효소를 사용하여, 혈전 표준화 하였다.

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프로토콜

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참고 : 다음 프로토콜은 조지아 공대에서 임상 시험 심사위원회 (IRB)가 설정 한 가이드 라인을 준수합니다.

1. 혈액 수집 및 적혈구 격리 절차

  1. 10 ml의 헤파린 vacutainer 튜브에 기증자의 혈액의 40 ~ 120 ml의를 수집합니다. 컬렉션의 4 시간 이내에 PBMC (말초 혈액 단핵 세포) 분리를 시작합니다. 이 시간 동안 실온에서 혈액을 유지합니다.
    참고 :이 낮은 PBMC 수율 발생합니다으로 RT 또는 4 ° C에서 혈액의 O / N 저장하지 않는 것이 좋습니다.
  2. 전혈 1을 희석 : 1을 얼음처럼 차가운 (4 ° C) 멸균 PBS에.
  3. 피펫 빈, 멸균 50 ML 원뿔 튜브에 얼음처럼 차가운 친수성 ​​폴리 사카 라이드 10 ㎖. 조심스럽게 친수성 ​​폴리 사카 라이드의 상단에 희석 전체 혈액을 전송합니다.
  4. 아주 천천히 튜브의 측면을 따라 느린 설정과 피펫 혈액 25ml를 피펫을 사용합니다. 혈액 센트리하기 전에 당과 혼합되지 않았는지 확인친수성 폴리 사카 라이드는 달리 세포에 독성이 fugation 때문에, PBMC 수율이 낮은 것입니다.
  5. 4 ° C에서 400 XG에 30 분 동안 원심 분리기 혈액 샘플. 가능한 경우, 원심 분리 후 더 나은 분리를 위해 최대의 절반에 원심 분리기의 브레이크 속도를 줄일 수 있습니다.
  6. 원심 분리 된 혈액 시료의 혈장 / 혈소판 분획 대기음. 조심스럽게 직접 포장 RBC 레이어 위에 친수성 ​​폴리 사카 라이드 층을 대기음.
  7. 포장 된 적혈구의 8 ~ 10 ml의 수집 및 1 희석 : unsterile 0.9 % 염화나트륨 식염수로 1.

2. 공 초점 현미경 평가 당화의 응고 구조 (시뮬레이션 당뇨병 혈전)

  1. 37 ° C에서 인간 피브리노겐과 형광 표지 된 인간 피브리노겐 접합체를 해동.
  2. 피펫 0.5 ml의에 다음은 마이크로 원심 튜브를 졸업했다.
    1. 건강한 정상 피브리노겐 응고를 들어, 10 % 형광 표지 된 인간 피브리노겐과 인간 피브리노겐을 혼합5 mg / ml의 농도로 50 mM 트리스 / 100 mM의 NaCl을 완충액 접합체.
    2. 인위적 당화 피브리노겐 들어, (당뇨병 응고 시뮬레이션) 6.8 ㎎ / ㎖의 생성 된 농도 50mM 트리스 / 100 mM의 염화나트륨에 용해 글루코스 5mM의 용액에 인간 피브리노겐과 10 %의 형광 표지 된 피브리노겐 공액 부화.
  3. 빛에 대한 노출을 피하기 위해 불투명 재료를 사용하는 마이크로 원심 분리기 튜브 커버. 48 시간 동안 37 ° C의 물을 용기에 튜브를 부화.
  4. 슬라이드의 2면에 얇은 접착제를 부착하여 유리 현미경 슬라이드에 실을 확인합니다.
  5. 48 시간의 잠복기 후, RT에서 FXIIIa과 인간의 알파 트롬빈을 해동하여 섬유소 형성을위한 시약을 준비합니다.
  6. 5 mM의 염화칼슘이 버퍼에 80 U / ㎖로 FXIIIa을 희석.
  7. 5 mM의 염화칼슘이 버퍼에 4 U / ml의 트롬빈을 희석.
    1. 정상 응고를 들어, 피브리노겐, FXIIIa, 트롬빈​​의 최종 농도가 2.5 m 있는지 확인g / ㎖, 20 U / ㎖, 각각 50 μL의 부피로 1 U / ㎖,.
    2. 당화 혈전를 들어, 피브리노겐, FXIIIa, 트롬빈​​의 최종 농도가 각각 50 μL의 볼륨, 3.4 ㎎ / ㎖, 20 U / ㎖, 1 U / ㎖되어 있는지 확인하십시오.
  8. 즉시 접착제에 의해 형성된 챔버 내에 피브린 용액 30 μL 피펫.
  9. 접착제의 2 층의 상단에 0.15 mm의 두께가 22mm X 22mm 유리 커버 슬립을 놓습니다. 마르지 섬유소 혈전을 방지하기 위해 투명 접착제로 열린 측면 인감. 접착제가 섬유소 응고와 상호 작용하지 않도록하십시오.
  10. 섬유소 혈전 공 초점 이미징 전에 2 시간 동안 21 ~ 23 ° C에서 중합 할 수 있습니다.
  11. 488 nm의 아르곤 레이저 40X / 1.30 오일 M27 렌즈를 공 초점 현미경을 이용하여 혈전의 공 초점 현미경 이미지를 가져 가라.

겸상 적혈구 환자에서 적혈구를 포함하는 섬유소 혈전의 3 공 초점 현미경 평가

  1. 37 ° C에서 인간 피브리노겐과 형광 표지 된 인간 피브리노겐 접합체를 해동.
  2. 피펫 0.5 ml의에 다음은 마이크로 원심 튜브를 졸업했다.
    1. 건강한 정상 피브린 응괴를 들어, 5 mg / ml의 농도로 50 mM 트리스 / 100 mM의 NaCl을 완충액에 10 %의 형광 표지 된 인간 피브리노겐 공액 인간 피브리노겐 섞는다.
    2. SCD 적혈구를 함유하는 혈전의 경우, 피브리노겐 농도가 얻어진 10 ㎎ / ㎖로되어 50mM 트리스 / 100 mM의 NaCl을 예컨대 인간 피브리노겐과 10 %의 인간 피브리노겐 형광 표지 된 복합체를 혼합한다.
  3. 세포 표지 용액을 사용하여 격리 된 적혈구 (RBC 정상 및 분리 프로토콜로부터 얻어진 겸상 적혈구 환자에서 그 모두) 라벨.
    1. 선택된 임의의 무 혈청 배지에서 1 ㎖ 당 1 × 106의 밀도로 세포를 일시.
    2. 세포 표지 용액에 세포 현탁액의 5 μL / ㎖를 추가한다. 부드러운 피펫으로 잘 부드럽게 섞는다.
    3. 37 ° C에서 5 분 동안 1,500 rpm으로 표지 된 현탁액을 원심 튜브.
    4. 37 ° C 배지에서 세포를 다시 일시 부드럽게 상등액을 제거하고.
    5. 세척 절차 (3.3.4과 3.3.5)을 두 번 더 반복합니다.
  4. 5 mM의 염화칼슘이 버퍼에 80 U / ㎖로 FXIIIa을 희석.
  5. 5 mM의 염화칼슘이 버퍼에 4 U / ml의 트롬빈을 희석.
    1. 정상 응고를 들어, 피브리노겐, FXIIIa, 트롬빈​​의 최종 농도가 각각 50 μL의 볼륨, 2.5 ㎎ / ㎖, 20 U / ㎖, 1 U / ㎖되어 있는지 확인하십시오.
    2. SCD 적혈구를 포함하는 혈전의 경우, 피브리노겐, FXIIIa, 트롬빈​​의 최종 농도가 각각 50 μL의 볼륨, 5 ㎎ / ㎖, 20 U / ㎖, 1 U / ㎖되어 있는지 확인하십시오.
  6. 피펫 섬유소 용액에 표시된 적혈구의 10 μL. 피펫 현미경 유리 위에 적혈구와 섬유소의 30 μL (GL 준비를 밀어 참조ycated 혈전).
  7. 섬유소가 공 초점 이미징 전에 2 시간 동안 21 ~ 23 ° C에서 중합 할 수 있습니다.
  8. 공 초점 현미경을 이용하여 혈전의 공 촛점 이미지를 가지고, 형광 표지 된 섬유소와 적혈구를 자극하는 488 nm에서 633 nm의 파장으로 여기 레이저를 사용한다.

당화 응고 구조의 섬유소 용해 요금 4. 공 초점 현미경 평가

  1. 당화 혈전의 섬유소 용해 속도 평가를위한 당화 혈전 (프로토콜 2 단계)의 공 초점 현미경 프로토콜을 반복합니다.
  2. 투명 접착제로 챔버의 끝을 밀봉하지 마십시오. 피브린 혈병 탈수를 방지하기 위해 250 ml의 물을 함유하는 밀봉 된 인클로저에 21-23 ℃에서 1.5 시간 동안 중합하도록 허용.
  3. 중합 종료 후, 공 초점 현미경을 사용하여 응고 화상을 얻었다.
  4. 피펫 챔버의 개방 단부로 플라스 민과는 모세관 작용을 통해 응고 통해 플라스를 분산.
    1. 용정상적인 농도 피펫 챔버의 개구에 플라스 200 ㎍ / ml의 25 μL와 정상 및 당화 섬유소 용해 실험.
    2. 감소 된 농도 피펫 챔버의 개구에 50 ㎍ / ml의 25 μL와 당화 혈전 용.
  5. 혈전을 용해하는 플라스의 실시간 비디오 영상을 캡처하는 공 초점 현미경 소프트웨어의 시계열 기능 (그림 1 참조)를 사용합니다.
    1. 획득 모드를 클릭 한 다음 선택 "시계열을."사이클의 수와 녹화 시간 간격을 선택합니다.

5. 섬유소 용해 요금을 계산

  1. 응고의 고정 영역을 용해하는 데 필요한 경과 시간을 영역 (2500 2 ㎛)를 설정하고 계산함으로써 용해 속도를 결정. 이하의 식 (도 2)를 사용하여 용해 속도를 계산한다 :
    figure-protocol-1

섬유소 용해 요금 6. 통계 분석

  1. 통계 분석 소프트웨어를 사용하여 용해 된 데이터를 분석한다. 단방향 ANOVA 및 특별 Tukey의-크레이머 시험 44,45 게시물을 수행합니다.

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결과

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당화 섬유소 응고 구조의 공 초점 현미경 분석

정상 및 당화 혈전의 공 초점 현미경 이미지. 그림 3에 제시되어있다 정상 및 당화 혈전의 공 초점 현미경 분석 당화 혈전 밀도와 혈전 중합 동안 FXIIIa의 첨가없이 모두 정상 혈전보다 작은 구멍을 가진 것을 알 수있다. 그림 3a 및도 3b에서, 더 높은 섬유소 농도 (그림 3C 및 3D)와 당화 혈전보다 밀도가 낮은 구조를 만들어 낮은 섬유소 농도가있다.

당화에서 관찰되는 혈전 큰 밀도 (단위 면적당 섬유의 수)은 당뇨병 환자에서 발생 피브리노겐 농도 증가의 결과이다. 정상 혈전에서는 섬유소 더 선형이었고 FXIIIa, 중합시에 더 긴 섬유를 형성하는아마 섬유 간의 가교를 형성 FXIIIa의 결과이다. 당화 혈전의 경우, 섬유도 첨가 FXIIIa으로 짧...

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토론

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질환 상태에서 응고 메카니즘의 구조에 대한 의미있는 데이터를 얻기 위해서는, 이러한 조건에서 단백질 및 세포의 효과를 결정하기 위해 혈액 응고에 관여하는 인자를 분리하는 것이 중요하다. 이 프로토콜 및 시험 관내에서 당뇨병 상태에서 SCD 피브린 응괴의 구조를 조사하는 목적으로 개발되었다.

이는 변경된 조건 hypercoagulation, 죽상 혈전증 및 CVD 발생할 보낸 질환 상태에서 피브린 형성 및 섬유소 용해에 관여하는 메커니즘을 이해하는 것이 필요하다. 이 실험에서 얻어지는 공 초점 화상으로부터, hypercoagulation 활성이 증가 된 피브리노겐 농도를 유발 당뇨 SCD 상태에서 발생하는 것을 알 수있다. 네트워크를 통해 분기점보다 작은 기공 밀도 피브린 네트워크에서 증가 된 피브리노겐 농도를 초래한다. SCD 환자의 섬유소 네트워크에서 더 많은 섬유소 현재, BU가 아니라이 클러스터로 피브린을 entraps으로서도 네트워크의 구조를 변경 겸상...

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공개 사항

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저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

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저자는 실험 분석을 개발하는 데 많은 도움이 되는 토론을 해준 Georgia Tech의 Lam Lab에 감사를 표합니다. 이 간행물에 보고된 연구는 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 국립 심장, 폐 및 혈액 연구소(National Institutes of Health)의 연구 지원(수상 번호 K01HL115486과 미국 국립보건원(National Institutes of Health) 소장실의 New Innovator Grant 1DP2OD007433-01의 지원을 받았습니다. 이 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
PBSLife Technologies10010031
Ficoll-Paque (친수성 다당류)GE Healthcare45-001-749
10 ml 헤파린 화 진공 튜브BD Biosciences366643
Human FibrinogenEnzyme Research LaboratoriesN/A
Alexa Fluor 488 human fibrinogen conjugateMolecular ProbesF13191
0.5ml 눈금 마이크로 원심분리기 튜브Fisher Scientific05-408-120
포도당 분말Life Technologies15023-02
FXIIIa효소 연구소N/A
VIS 컨포칼 현미경Zeiss LSM 510LSM 510
50 mM TrisLonzaS50-642
염화칼슘(CaCl2)Sigma Aldrich449709-10G
Vybrant DiD 세포 라벨링 솔루션Life TechnologiesL7781
PlasminEnzyme Research LaboratoriesN/A
염화나트륨(5M NaCl)Life TechnologiesAM9759
통계 모델링 소프트웨어IBMSPSS Statistics 22

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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