방법 논문

MALDI-TOF 질량 분석 및 사용자 지정 데이터베이스의 사용은 고유 동굴 환경 (Kartchner 동굴, AZ, USA)에 토착 박테리아의 특성을

DOI:

10.3791/52064

⸱

2015년 1월 2일

 ,  ,  , 
1School of Mathematical and Natural Sciences, Arizona State University, 2Applied Maths NV

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 작업은 MALDI-TOF MS를 사용하여 박테리아를 신속하게 식별하기 위한 절차를 자세히 설명합니다. 식별 절차에는 스펙트럼 수집, 데이터베이스 구축 및 후속 분석이 포함됩니다. 유사성 계수 기반 방법과 바이오마커 기반 방법의 두 가지 식별 방법이 제시됩니다.

초록

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MALDI-TOF 질량 분석법은 속과 종, 그리고 경우에 따라 균주 수준에서 박테리아를 식별하기 위한 빠르고 신뢰할 수 있는 도구인 것으로 나타났습니다. 상업적으로 이용 가능한 오픈 소스 소프트웨어 도구는 식별을 용이하게 하기 위해 개발되었습니다. 그러나 문헌에는 범용/표준화된 데이터 분석 파이프라인이 설명되어 있지 않습니다. 여기에서는 MALDI-TOF 질량 분석기를 사용한 박테리아 식별 절차에 대한 포괄적이고 상세한 시연을 제공합니다. 미국 애리조나주 카치너 동굴(Kartchner Caverns)에서 분리된 15종의 다양한 박테리아에서 질량 스펙트럼을 수집하여 16S rDNA 염기서열분석으로 식별했습니다. 데이터베이스는 BioNumerics 7.1에서 구성되었습니다. 클러스터 분석, 피크 매칭 및 통계 분석을 포함한 질량 스펙트럼의 후속 분석이 수행되었습니다. 식별은 이 15개의 박테리아에서 무작위로 선택된 블라인드 코딩 샘플을 사용하여 수행되었습니다. 두 가지 식별 방법, 즉 유사성 계수 기반 방법과 바이오마커 기반 방법이 제시됩니다. 결과는 두 가지 식별 방법 모두 박테리아를 종 수준까지 식별할 수 있음을 보여줍니다.

서론

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MALDI-TOF(Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight) 질량 분석법(MS)은 속, 종 및 경우에 따라균주 수준 1-4에서 박테리아를 식별하기 위한 빠르고 신뢰할 수 있는 도구인 것으로 나타났습니다. MALDI-TOF MS는 세포 표면, 세포 내 막 및 박테리아 전체 세포 또는 단백질 추출물의 리보솜에서 유래한 생물학적 분자(일반적으로 단백질)를 이온화합니다1,5. 결과 피크는 분석된 박테리아의 특징적인 패턴 또는 "지문"을 형성합니다1. 박테리아의 식별은 이러한 질량 대 전하 "지문"을 기반으로 합니다.

가장 일반적으로 사용되는 두 가지 식별 전략은 라이브러리 기반 전략과 생물 정보학 기반 전략입니다1. 라이브러리 기반 접근 방식에는 식별을 위해 데이터베이스/라이브러리에서 이전에 수집된 알려진 박테리아의 질량 스펙트럼과 미지 물질의 질량 스펙트럼을 비교하는 것이 포함됩니다. BioNumerics, Biotyper 및 SARAMIS 소프트웨어 패키지와 같은 상용 소프트웨어와 SpectraBank6과 같은 오픈 소스 소프트웨어 도구를 사용하여 미지 박테리아와 참조 박테리아의 질량 스펙트럼 간의 유사성을 비교하고 정량화할 수 있습니다. 생물정보학 기반 접근법은 일반적으로 식별을 위해 완전히 염기서열화된 박테리아 게놈에 의존합니다. 특정 피크의 생물학적 특성을 규명하지 않는 라이브러리 기반 접근법과 달리, 생물정보학 기반 접근법은 단백질 식별1을 포함합니다.

최근 MALDI 지문 기반 연구의 대다수는 박테리아를 식별하기 위해 라이브러리 기반 접근 방식을 사용했습니다1. 라이브러리 기반 접근 방식에는 데이터베이스 구축과 질량 스펙트럼 간의 유사성 비교가 필요합니다. 연구에 따르면 배지3,7, 배양 시간8, 시료 준비 방법3 및 사용된 매트릭스9와 같은 많은 실험 절차가 얻은 질량 스펙트럼에 영향을 미칩니다. 더욱이, 밀접하게 관련된 일부 종과 균주는 미묘한 차이만 있는 스펙트럼을 생성합니다. 따라서 라이브러리 기반 접근 방식에는 반복 간에 재현성이 높은 질량 스펙트럼을 생성하기 위해 엄격하게 표준화된 절차가 필요합니다. 프로토콜의 사소한 변화는 특히 아종 및 균주 수준1,3,10에서 식별 효과를 손상시킬 수 있습니다. 그러나 제조업체에서 제공하는 참조 데이터베이스나 보고된 사용자 지정 데이터베이스에는 데이터베이스 구성 및/또는 데이터 분석 파이프라인의 적용을 위해 시각적으로 문서화된 절차가 포함되어 있지 않습니다. 이러한 이유로 이 작업의 목적은 MALDI-TOF MS를 사용하여 라이브러리 기반 박테리아 식별을 위한 포괄적이고 상세한 절차를 개발, 적용 및 시연하는 것이었습니다.

이 데모에서는 카르스틱 환경(미국 애리조나주 카치너 동굴)에서 분리된 15개 박테리아의 질량 스펙트럼을 수집하고 소프트웨어로 가져와 모델 데이터베이스를 구성했습니다. 데이터 처리 및 분석 파이프라인은 모델 데이터베이스를 사용하여 자세히 설명되었습니다. 마지막으로, 이 15개의 박테리아에서 무작위로 선택된 블라인드 코딩 박테리아의 질량 스펙트럼을 다시 수집하고 식별을 위해 모델 데이터베이스의 참조 스펙트럼과 비교했습니다. 결과는 박테리아가 유사성 계수 또는 잠재적인 바이오마커/피크 클래스를 기반으로 올바르게 식별될 수 있음을 보여줍니다.

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프로토콜

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주의 : 모든 환경에서 미확인 된 박테리아는 병원성 할 수 있으며, 적절한 바이오 안전성 프로토콜을 사용하여주의하여 취급해야합니다. 라이브 문화에 대한 작업은 생물 안전 레벨 2 (BSL-2) 절차를 사용하여 클래스 II 생물 안전 캐비닛에서 수행해야합니다. BSL-2 절차에 대한 자세한 내용은 페이지 33-38 "미생물 및 생물 의학 연구소에서 바이오 안전성"CDC / NIH의 제목 설명서,에서 사용할 수 있습니다. 문서에서 온라인으로 볼 수 있습니다 http://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/BMBL.pdf . 실험복 / 가운, 보호 안경, 니트릴 또는 라텍스 장갑을 포함 적절한 개인 보호 장비 (PPE)를 착용해야합니다. 표준 미생물 학적 방법과주의 사항을 준수해야하며, 생물학적 폐기물은 적절히 폐기해야합니다.

이 데모에 사용 된 박테리아는 Kartchner 동굴에서 분리되었다,AZ, USA, 건조 스펠 레오 뎀, 흐름 돌, 촉촉한 스펠 레오 뎀과 종유석 드립 (표 1) 등 4 개 환경에서. 모든 균주의 16S rDNA 염기 서열 분석에 의해 확인 된 25 % 글리세롤 2 B-R 매체에서 -80 ° C에 보관 하였다. 모든 실험은 실온에서 완료 하였다.

참고 : 우리는 데이터베이스 구축 및 미지의 질량 스펙트럼에 대한 질량 스펙트럼을 획득하기 위해 같은 샘플 준비 방법을 사용하는 것이 좋습니다. 시료 제조 방법은 스펙트럼의 품질 및 재현성에 영향을 미치는 세 이전에 도시되었다. 다른 샘플 준비 방법을 사용하는 것은 바람직하다 (변형 수준에서 예) 미지의 잘못된 식별, 특히 높은 분류 학적 해상도의 원인이 될 수 있습니다.

MALDI 대상 1. 증착

주의 : 여러 프로토콜 단백질 추출물 GUID에 따라 이용해야 산 및 유기 용매의 사용을 필요로 수득각각의 재료 안전 데이터 시트 (MSDS)에 포함 elines 및 정보. 적절한 보호구 착용해야하며, 사용되는 화학 물질의 종류와 양에 따라 달라집니다 (예를 들어, 아세토 니트릴 등의 독성, 가연성 솔벤트의 상당 수, 작업 할 때 / 가운, 장갑, 보호 안경, 그리고 호흡 보호 장치를 사용해야합니다 실험실 코트, 포름산과 트리 플루오로 산과 같은 부식성 산).

  1. 스테인레스 스틸 MALDI 표적 판에하고 건조 할 수 있도록 (해당 앞에서 설명한 프로토콜 11-13을 사용하여 얻은)에는 가능한 세포를 포함하지 않는 단백질 추출물 μL 보증금 1. 1 ㎕의 매트릭스 용액 (α 아노 -4- 하이드 록시 - 신 남산 용액)와 단백질 건조 추출물을 오버레이하고 건조시켜야.
  2. 각 생물 복제의 경우, 기술 복제합니다 (5-20 기술 회 반복) 적절한 수의 자리. 여기서, 각 생물 복제에 대 한 (10) 기술 복제하고 3 생물 복제합니다 w를 발견오히려 준비했다.
    참고 : 우리는 단백질 추출 시료 전처리 법을 이용하는 경우 연마 MALDI 스틸 타겟 판을 사용하는 것을 권장. 스틸 그라운드 대상 플레​​이트를 사용하여 확산 및 개별 샘플 우물 외부의 다른 샘플의 의도하지 않은 혼합의 원인이 될 수 있습니다.
  3. 보증금 1 μL의 calibrant의 대상 판에 표준이 건조 할 수 있습니다. 1 μL 매트릭스 솔루션을 오버레이하고 건조 할 수 있습니다.
  4. 음성 대조군으로 대상 접시에 보증금 2 μL 매트릭스 솔루션입니다.

2. 질량 스펙트럼 취득

  1. 질소 레이저 (λ = 337 ㎚)를 구비 한 MALDI-TOF 질량 분석기를 사용하여 브루 커 FlexControl 소프트웨어를 이용하여 동작.
  2. 100 샷 단위로 500 레이저 샷의 축적에 의해 긍정적 인 선형 모드에서 각 질량 스펙트럼을 수집합니다. 20kV의에 이온 원 (1) 전압을 설정; 이온 소스 (2) 18.15 kV의 전압을; 및 9.05 kV의에 렌즈 전압. 이러한 매개 변수는 악기 정시 참고및 FIC는 최적의 결과를 얻기 위해 다른 악기에 대한 조정이 필요할 수 있습니다.
  3. 충전 당 2 ~ 20 kDa의 자동화 된 스펙트럼 평가를위한 대량으로 충전 범위를 설정합니다. 중심 피크 검출 알고리즘을 사용합니다. (100) 다에서 최소 해상도 임계 값을 설정합니다. 100에서의 최소 세기 임계 값을 설정 2.에서 역치 잡음비 (S N)에 신호를 설정한다.

3. 데이터베이스 건설

  1. 데이터베이스 설계
    1. "새 데이터베이스 마법사"를 사용하여 BioNumerics 7.1에서 새 데이터베이스를 만듭니다.
    2. "실험 유형"패널에서 명령을 사용하여 스펙트럼 실험 유형, 예를 들어,을 Maldi를 만듭니다.
    3. "데이터베이스 디자인 패널"을 이용하여 레벨을 작성합니다. 사용하여 새로운 수준의 추가 "데이터베이스"메뉴의 명령 "레벨> 새로운 차원의 ... 추가". 여기에, "종"수준 "생물 복제"수준 "과"기술 복제 "수준 respectiv를 만들엘리.
  2. 가져 오기 및 원시 질량 스펙트럼을 전처리
    1. "파일"메뉴에서 "내보내기> 질량 스펙트럼"명령을 클릭하여 FlexAnalysis를 사용하여 .txt 파일로 원시 질량 스펙트럼을 보냅니다.
    2. 복제물 기술적 수준에서 데이터베이스로 원료 질량 스펙트럼 (.txt 파일)를 가져.
    3. 원시 질량 스펙트럼을 미리 처리.
      1. 가져 오기 및 재 샘플 (차 피팅 알고리즘을 사용하여).
      2. (50 점의 크기와 회전 디스크 포함) 기준 빼기를 수행합니다.
      3. (창 20 점의 크기와 10 점의 베타 카이저 창) 소음 [연속 웨이블릿 변환 (CWT)], 부드러운을 계산하고, 두 번째 기본 공제 (200 점의 크기와 디스크를 압연)을 수행합니다.
      4. [: 10 (N S) 잡음 비율 최소한의 신호와 CWT] 피크를 감지합니다.
    4. 전처리 한 후, 같은 피크를 포함하는 피크 목록과 같은 각각의 질량 스펙트럼의 특성 패턴을 저장크기, 피크 강도, S : 데이터베이스 N 등.
  3. 복합 질량 스펙트럼을 만들기
    1. "분석"메뉴의 "... 요약"명령을 사용하여 사전 처리 된 스펙트럼에서 복합 스펙트럼을 만듭니다. 목표 수준으로 "생물 복제"를 선택합니다.
    2. 여기에서, "생물 복제"수준에서 그 분리에 대 한 세 가지 복합 질량 스펙트럼의 결과로, 그 식민지의 복합 질량 스펙트럼을 산출하기 위해 같은 식민지의 10 기술 복제물의 질량 스펙트럼을 결합한다.
    3. 여기, 즉 "종"레벨에서 분리하기위한 하나의 복합 스펙트럼을 생성하기 위해 세 가지 복합 스펙트럼을 요약한다.
      참고 : 복합 스펙트럼은 기술 복제물의 포인트 별 평균입니다. 95 % 이상 (기본 설정)의 평균 유사도 (피어슨 상관 관계)를 복제 복합에서 제외됩니다. 그들은 (75 %에있는 경우 복합 스펙트럼의 봉우리 만이라고합니다포함 된 복제물의 기본 설정). 생물학적 복제판 들어, 이러한 설정은 각각 90 및 60 %였다.

4. 질량 스펙트럼 데이터 분석

  1. 데이터베이스의 항목을 선택하고 "비교"패널에서 "새로운 비교 만들기"명령을 클릭하여 비교를 만들 수 있습니다.
  2. 여기에, 비교 및​​ 분석을 보여주기 위해 "기술 복제"및 / 또는 "생명 복제"수준에서 질량 스펙트럼을 사용합니다.
  3. 비슷한 기반 클러스터 분석과 다차원 스케일링 (MDS)
    1. 색상 그룹을 만듭니다. 세 가지 생물학적 복합 질량 스펙트럼을 선택하고 해당 분리에 대 한 그룹을 만듭니다 "그룹"메뉴의 명령 "선택에서 만들기 새 그룹"을 클릭합니다. 자동 이러한 세 질량 스펙트럼에 사용 색을 지정한다.
    2. 또한,의 명령을 사용하여 해당 색상으로 필드 상태를 정의하는 "이 정의 필드를 기준으로 모든 그룹이 그룹에 대해 정의 된 같은 색을 사용하도록 데이터베이스 항목 "패널.
    3. 클러스터 분석을 수행합니다. "클러스터링"메뉴의 "클러스터 분석을 계산"명령을 클릭합니다. 비교 설정 1 페이지, "피어슨 상관 관계"를 선택하고 기본값으로 다른 매개 변수를 둡니다. 2 페이지에서 "UPGMA"를 선택합니다. 그런 다음 "마침"을 클릭합니다.
    4. "통계"메뉴의 MDS를 사용하여 플롯 "다차원 스케일링을 ..."명령을 얻습니다.
  4. 피크 일치
    1. "실험"패널의 스펙트럼 유형 "을 Maldi"을 클릭합니다. 그런 다음 "레이아웃> 이미지보기"를 선택합니다. 스펙트럼 겔 밴드로 표시됩니다.
    2. "스펙트럼"메뉴에서 "피크 일치를 수행"명령을 사용하여 피크 매칭을 수행합니다.
  5. 피크 클래스 식별
    1. 주성분 분석 (PCA)을 수행. 강조 "MALDI 실험 "실험의 유형" "패널과 사용"PCA를 수행하는 통계 "메뉴"에서 명령 "주 구성 요소 분석을 ....
    2. 양방향 클러스터링을 수행합니다. "비교"창에서 "통계> 매트릭스 마이닝을 ..."을 클릭합니다. 피크 클래스에 정합 피크의 세기는 서로 다른 색상 (열 맵)를 이용하여 표현된다.

사용자 지정 데이터베이스 5. 박테리아 식별

  1. 비슷한 계수 기반 방법
    1. 비교를 만들고 단계 4.3.3에 설명 된대로 "기술 복제"수준의 질량 스펙트럼을 기반으로 Dendrogram이를 생성합니다. 유사성의 비교를 위해 Dendrogram이를 저장합니다.
    2. "선택 항목을 확인> 분석"알 수없는 질량 스펙트럼을 선택하고을 클릭합니다. 확인 대화 상자가 나타납니다.
    3. "비교를 기반으로"분류 유형 (또는 저장 classif를 선택IER) 및 "다음"을 클릭합니다. 다음 페이지에서 참조 비교로 저장 Dendrogram이를 선택하고 "다음"을 클릭합니다.
    4. 식별 방법으로 "기본 유사성"을 선택하고 "다음"을 클릭합니다.
    5. 채점 방법으로 "최대 유사성"을 선택합니다. 각 매개 변수에 대한 적절한 임계 값과 최소값의 차이 값을 입력하고 "다음"을 클릭합니다.
    6. 계산이 완료되면, 확인 창이 나타납니다. "결과"패널에서 가장 잘 알 수없는 일치하는 데이터베이스의 구성원이 나열됩니다.
    7. 식별 프로젝트를 저장하고 "확인 프로젝트"패널에서 "교차 유효성 검사 분석"명령을 사용하여 ID를 확인합니다.
  2. 잠재적 바이오 마커 기반 방법
    1. 피크 클래스를 정의합니다. "매트릭스 광업"창에서 공통적 인 특징을 공유하는 피크 세트를 선택하고 정시 이러한 피크를 정의FIC 피크 클래스 (잠재적 인 바이오 마커)를 사용하여 "스펙트럼> 피크 클래스 유형을 ... 관리" "비교 창"에서.
    2. 여기에, 모든 15 균주에 대한 격리 각 특정 피크 클래스를 정의합니다.
    3. 미지의 질량 스펙트럼을 선택하고, 전술 한 바와 같이 정의 피크 클래스 이러한 스펙트럼의 피크와 일치.

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결과

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이 데모에 건설 데이터베이스는 "종", "생물 복제"와 "기술 복제"각각 (그림 1A)을 포함한 "모든 레벨"최고에서 최저 수준을 4 단계를했다. "기술 복제"수준의 기술 복제물의 모든 전처리 스펙트럼을 포함. "생물 복제"와 "종"레벨은 복합 (요약) 스펙트럼을 포함. "모든 레벨"모든 기술적 복제 스펙트럼뿐만 아니라 모든 복합 스펙트럼을 포함.

스펙트럼 요약 절차 대표 피크를 사용하여도 1에 나타내었다. 각 구성원 질량 스펙트럼은 얇은 회색 선으로 나타납니다. 복합 스펙트럼은 빨간색으로 색 선으로 표시됩니다. 인접 피크를 쉽게 육안 검사 (그림 1B)를 허용하는 다른 색으로 표시됩니다.

표 1에 나타낸다. 높은 재현성 바실러스 종 B 대 98.0 ± 1.4이고, 최저 재현성 Curvibacter 종<...

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토론

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이 데모는 특성화 및 MALDI-TOF MS와 사용자 지정 데이터베이스를 사용하여 세균의 식별의 세부 절차를 보여 주었다. 예를 들어 전통적인 분자 방법과 비교하여, 16S rDNA의 염기 서열, MALDI-TOF MS 기반 지문 방법은 다양한 박테리아의보다 신속한 식별을 용이하게한다. 견고성으로 인해,이 기술은 널리 임상 환경에서 설정 1,14-16에서 박테리아, 바이러스, 곰팡이 및 효모를 특성화하기 위해 사용된다. 또한, MALDI-TOF MS는, 어떤 경우에는, 더 높은 해상도 분류학을 수득 한 것으로보고되었다. 예를 들어, B. 특검팀. A, B, D 및 E는 함께 클러스터링 (도 2) 경향이 있지만, 명확하게 분리시키고, 다른 B. (SP)의 스펙트럼 사이의 유사도. (그림 2) 80 % 미만이었다. 대조적으로, 이들 균주의 16S rDNA 염기 서열은 이들 균주를 ...

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공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자 Vranckx와 Janssens는 이 비디오에 사용된 데이터 분석 소프트웨어 제조업체인 Applied Maths NV의 직원입니다. Applied Maths NV는 이 비디오에서 강조된 일부 소프트웨어 모듈과 이 비디오와 관련된 출판 비용의 일부를 제공했습니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 작업은 애리조나 주립 대학의 New College of Interdisciplinary Arts and Sciences, Applied Maths NV 및 National Science Foundation(ROA Supplement to Award No. MCB0604300). 이 자료에 표현된 모든 의견, 연구 결과, 결론 또는 권장 사항은 저자의 것이며 반드시 National Science Foundation의 견해를 반영하는 것은 아닙니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
α-cyano-4-hydroxy-cinnamic acidACROS Organics163440050≥ 97%, CAS 28168-41-8
Bruker FlexControl 소프트웨어Bruker Daltonics버전 3.0
Bruker FlexAnalysis 소프트웨어Bruker Daltonics버전 3.0
Bionumerics 소프트웨어응용 수학버전 7.1

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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  17. Zhang, L., Borror, C. M., Sandrin, T. R. A designed experiments approach to optimization of automated data acquisition during characterization of bacteria with MALDI-TOF mass spectrometry. Plos One. 9 (3), (2014).
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BioNumerics 7 1

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