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방법 논문

전사 분석을위한 대규모 Zebrafish의 배아 심장의 해부

14.1K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/52087

⸱

2015년 1월 12일

 ,  , 
1Max Delbrück Center for Molecular Medicine, 2Institute of Biochemistry and Biology, University of Potsdam, 3Institute of Molecular Biology, Medizinische Hochschule Hannover

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

제브라 피쉬의 심장 개발하는 동안 심장 유전자 발현 프로파일을 분석하기 위해, 총 RNA는 고립 된 마음에서 추출해야합니다. 여기서 우리는 심장 별의 mRNA를 얻기 위해 제브라 피쉬 배아에서 빠른 설명서를 해부하여 기능 / 구타 마음을 수집하기위한 프로토콜을 제시한다.

초록

제브라 피쉬 배아 심장은 전체 배아의 작은 부분을 나타내는, 몇백 세포로 구성된다. 따라서, 글로벌 배아 사체에 의해 마스크되는 심장 사체를 방지하기 위해, 상기 분석 하트 충분한 수를 수집 할 필요가있다. 제브라 피쉬 심장 개발이 급속히 진행 더욱이, 심장 수집 및 RNA 추출 방법은 샘플의 균일 성을 확보하기 위해서는 신속한 있어야한다. 여기서 우리는 제브라 피쉬 배아에서 기능 / 꺾고 마음을 수집하기위한 빠른 매뉴얼 해부 프로토콜을 제시한다. 이것은 전 사체 분석에서는 이들 정량적 실시간 중합 효소 연쇄 반응 (RT-qPCR에)와 같은 심장 특이 유전자 발현 수준을 결정하기 위해 후속 심장 특이 RNA 추출을위한 필수 조건이다. 방법은 다른 조직에 비해 제브라 피쉬 배아 심장의 접착 성 차이에 기초한다; 이것은 빠른 PHY 허용유체 전단력 중단, 단계적 여과 및 형질 전환 형광 표지 된 마음의 설명서 모음의 조합에 의해 심장 외 조직에서 심장의 이외에도 클래식 분리.

서론

제브라 피쉬 (다니오 레 리오 (rerio))는 널리 때문에 작은 크기와 형광 단백질의 조직 특이 적 발현과 유전자 변형 기자 라인의 가용성과 결합의 빠르고 투명하고 자궁 외 배아 발달로 생체 내에서 기관 형성을 연구하기 위해 발달 생물학에서 사용된다. 이 작은 척추 동물은 특히 초기 제브라 피쉬 배아의 산소가 심장 박동, 혈액 흐름에 의존하지 않기 때문에 심장 개발을 연구하기에 적합하다; 이러한 기능은 심장 혈관 돌연변이 1,2 많은 수의 특성을 허용하고 제브라 피쉬는 이제 심장 질환 (3) 연구 널리 알려진 모델 생물이다.

배아 개발하는 동안 유전자 발현을 연구하기 위해, 성적 증명서는 일반적으로 전체 마운트 현장 하이브리드에 (WISH) 4 분석, RT-qPCR에 5, 마이크로 어레이 (6), 또는 차세대 시퀀싱 (RNA-SEQ) 7. 동안WISH 전체 배아 내의 유전자 발현의 시공간적 분석, 전사 레벨은 일반적으로 RT-qPCR에, 마이크로 어레이 또는 RNA-SEQ 접근법에 의해 평가되어 있습니다. 그러나 이러한 방법은 특정 유전자 발현 프로파일 링에 대한 조직 농축이 필요합니다.

제브라 피쉬 배아 심장이 전체 배아의 작은 부분을 나타 내기 때문에, 심장 개발하는 동안 사체 연구는 해부과 마음의 농축을위한 프로토콜이 필요합니다. 또한, 생리 학적으로 관련 데이터를 얻기 위해, 그것은 RNA 추출까지 완전히 기능 심장 조직을 유지하는 것이 중요하다. 여기서 우리는 신속하게 생리 학적으로 정상 분리하고 효율적으로 추가 분석을위한 고품질의 RNA 샘플을 얻기 위해 제브라 피쉬 배아의 수백 마음을 구타하기위한 프로토콜을 설명합니다. 본 발명의 방법은 화상 및 맥레이 2006 년 8 의해보고 된 프로토콜을 기반으로합니다. 심장 조직의 농축의 경우, 두 가지 방법은 형질 전환 심근 기자 행을 사용하여및 다른 조직에 비해 제브라 피쉬 배아 마음의 차동 접착 특성을 활용. 간단히, 좁은 피펫 팁을 통해 아래로 많은 배아를 피펫으로, 마음이 동시에 배아의 몸에서 해제되고 순차적으로 두 개의 빠른 여과 단계에서 배아 파편 분리; 형광 표지 된 마음은 수동으로 남아있는 파편에서 분류 및 추가 처리를 위해 수집됩니다.

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프로토콜

이 프로토콜은 독일과 베를린 주법의 동물 보호 지침을 다음과; 제브라 피쉬의 처리는 동물 보호 (LaGeSo, 베를린 - 브란 덴 부르그)에 대한 지방 자치 단체에 의해 모니터링 하였다.

1. 심장 추출을위한 Zebrafish의 배아를 얻기

  1. 형질 전환 라인 9 twu34 마음 별 GFP 발현과 배아를 얻기 위해 : 같은 Tg는 (EGFP myl7)와 같은 크로스 심장 기자 제브라 피쉬.
  2. 원하는 배아 단계 10, 11까지 28.5 ° C에서 계란 물 배아를 유지한다. 수집 된 배아 인구는 유전자 발현의 변화를 제한하는 두 유전자와 발달 단계에 의해 균일 있는지 확인하십시오.
  3. 수동으로 배아를 Dechorionate.

2. 해부 Zebrafish의 배아 마음

참고 : 얼음의 모든 솔루션을 보관하십시오. 가능하면, 팀워크를 수행 한 사람이 EMB에서 마음을 해부한다ryos 다른 사람이 형광 실체 현미경 마음을 정렬한다. 이 작업은 몇 시간에서 배아의 수백의 처리를 할 수 있습니다.

  1. 1.5 ㎖의 원심 분리 관에 약 100 배아를 전송합니다. tricaine와 배아 (E3​​ 매체에 0.16 ㎎ / ㎖)을 마취. 배아가 명확하게 마취 일단 시험 (그들은 수영 튜브의 바닥에 침전물, 그러나 그들의 마음은 여전히​​ 치고있다하지 않음).
  2. tricaine / E3 솔루션을 제거하고 1 ml의 L-15 / 10 % FBS 배지로 한 번 배아를 씻어 얼음에 유지한다.
    참고 : L-15 / 10 % FBS 매체는 마음 RNAlater 또는 트리 졸에 전송 될 때까지 전체 해부 과정에서 살아 장기와 세포를 유지하는 것이 중요합니다.
  3. 노른자가 완전히 중단 될 때까지 라운드 젤로드 팁과 위아래로 배아 및 피펫에 5-8 시간을 1 ml의 L-15 / 10 % FBS 매체를 추가합니다. 배아 드롭 현명한 용액의 표면에, 드롭 버스트 수 있도록 피펫배아는 부드럽게 중단된다.
    참고 : 최대 피펫 아래로, 즉 더 피펫 팅이 후반 단계 (예를 들어 56 HPF에서)에 필요, 태아의 발달 단계에 따라하는 방법을 적극적으로 얼마나 자주 배아가있다.
  4. 너무 부드럽게 피펫 경우 어떤 마음이 배아에 부착 남아있을 수 있기 때문에 해부 배아의 첫 번째 일괄 들어, 배아의 무결성과 실체 현미경을 해부 마음의 비율을 평가합니다. 이에 따라 절개의 다음 라운드 피펫의 방식을 조정합니다.
    참고 : 플라스틱에 집착 마음을 최소화하기 위해 낮은 유지 피펫 팁과 마이크로 원심 튜브를 사용합니다.
  5. 50 ㎖ 원심 분리 튜브에 배치 된 100 ㎛ 필터 상에 시료를 적용; 1ml의 L-15 / 10 % FBS 배지를 1.5 ml의 튜브 헹구어 낸 후 (일부 하트 튜브의 벽에 달라 붙을 수있는) 샘플의 손실을 최소화하기 위해 필터에 이것을 적용한다. 1 ml의 L과 필터를 2 회 세척-15 / 10 % FBS. 이 단계에서는 마음이 필터를 통과하고 50 ML 튜브에 수집됩니다.
  6. 15 ml의 원심 분리 튜브에 배치 된 30 μm의 필터로 관류를 적용하고 1 ㎖의 L-15 / 10 % FBS 배지로 한번 필터를 헹군다. 이 초 여과 공정에서, 하트 필터에 보유되고, 작은 먼지는 세척된다.
  7. 거꾸로 필터를 켜고 1 ml의 L-15 / 10 % FBS와 세 개의 연속 세척을 적용하여 1 % 아가로 오스 코팅 된 배양 접시에 필터 중 마음을 세척하십시오.
  8. 수동 형광 실체 현미경 포셉 쌍 비 형광 배아 파편 (예 : 아이 렌즈)로부터 GFP 양성 하트 분리 접시의 중앙에이를 농축시킨다. 3 단계에 따라이를 수집합니다.
    참고 : 배아 나이가 24 HPF 경우, 마음, 구타 조직이 아직도 생리 학적으로 정상을 나타내는해야한다.

3. Dissec에서 mRNA의 격리를테드 마음

  1. (얼음) 0.75 ㎖의 RNAlater를 포함하는 1.5 ML 튜브에 가장 작은 부피의 마음 (예를 들어 10 μL)과 펫을 수집합니다. 더 마음 형광 실체 현미경을 보면서 피펫 팁에 남아 있는지 확인합니다.
  2. 대안 적으로, 화학적 후드 형광 현미경의 바로 근처에서 사용할 경우, 화학 후드 트리 졸 (주)에 수집 된 하트 옮긴다. 이 피펫 팁과 또한 마음의 원심 분리 동안 고집 마음의 가능한 손실을 회피 (3.4, 3.5 및 3.7 단계). 트리 졸와 같은 튜브에 격리 몇 차례의 마음을 풀 3.8 단계로 바로 이동; 최종 부피는 트리 졸 원래 부피의 10 %를 초과하지 않아야한다.
    참고 : 사용하기 전에 트리 졸 물질 안전 보건 자료 (MSDS)를 참조하십시오. 후드 아래 트리 졸 시약을 처리하고 개인 보호 장비를 권장 착용하십시오. 피부, 눈, 및 clothi과의 접촉을 피할 것NG. 모든 점화원을 제거 할 것.
  3. RNA 분리의 효율이 수집 된 조직의 양의 향상으로, (얼음) RNAlater와 같은 튜브에 격리 몇 차례의 마음을 풀. 총 샘플 부피 RNAlater 원래 부피의 10 %를 초과하는 경우, (얼음) 저장 RNAlater 0.75 ㎖를 추가로 관을 사용한다.
  4. 마음을 침전 4 ° C에서 20 분 동안 15,700 XG에서 샘플을 원심 분리기.
  5. 형광 실체 현미경을 이용하여, 3 ㎖ L-15 / 10 % FBS 배지를 함유하는 1 % 아가로 코팅 된 배양 접시에 최대한 신중만큼 상등액을 수집하지만, 원심 분리 튜브 바닥에 침강 마음을 방해하지 않는다. 마음의 최대 15 % 인해 RNAlater의 높은 점도에 뜨는에 남아있을 수 있기 때문에 단계 3.7에 설명 된대로, 그들을 검색 할 수 있습니다.
  6. 화학 후드에서 침전 마음이 들어있는 튜브에 0.5 ml의 트리 졸을 추가하고 얼음에 보관하십시오.
  7. 형광 microsco에서PE, 희석 3 ㎖ L-15 / 10 % FBS와 다른 1 % 아가 로스 코팅 접시에 RNAlater / L-15 / 10 % FBS 용액을 함유하는 1 % 아가 로스 코팅 접시에서 (단계 3.5)에서 하트 전송할 RNAlater 아웃. 페트리 접시의 중앙에 마음을 수집하고 화학 후드 트리 졸에 침전 된 마음의 튜브에 작은 볼륨을 전송합니다.
  8. 소용돌이는 트리 졸에 마음을 포함하는 1.5 ML 튜브는 마음에 혼란을 실온에서 5 분 동안 품어합니다.
  9. 화학 후드에서 100 μl의 클로로포름 (주의)를 추가, 철저하게 혼합하고 (사용하기 전에 최대 속도로 원심 분리기 30 초)를 1.5 ml의로 미리 회전 PLG 튜브를 트리 졸 / 클로로포름 용액을 전송합니다. 실온에서 3 분 동안 배양한다.
    참고 : 사용하기 전에 클로로포름 MSDS를 참조하십시오. 후드 클로로포름 시약을 처리하고 개인 보호 장비를 권장 착용하십시오. 피부, 눈, 및 의복에 접촉하지 않도록 할 것. 알칼리 금속과 멀리 혼합 위험성에서 보관하십시오.
  10. CentrifuGE의 4 ° C에서 15 분 동안 15,700 XG에 샘플 및 새로운 1.5 ML 튜브로 수성 단계를 전송합니다.
  11. 5 ~ 10 μg의 글리코겐과 이소프로판올 (-20 ° C에서) 예비 냉각 25​​0 μl를 추가; 잘 혼합 및 -20 ° C에서 밤새 품어.
  12. 4 ° C에서 30 분 동안 15,700 XG에서 샘플을 원심 분리기 상층 액을 버린다.
  13. 4 ° C에서 15 분 동안 15,700 XG에 1 ml의 75 % 에탄올, 원심 분리기와 펠렛을 세척하고 상층 액을 제거한다.
  14. 그것은 (예를 들면 10 ~ 15 분 동안)의 백색이 될 때까지 상온에서 펠렛을 건조하여 에탄올을 증발하자.
  15. 펠렛 20 μL RNA 분해 효소가없는 DDH 2 O를 추가하고 RNA를 용해 55 ° C에서 10 ~ 15 분 동안 배양; 다음 얼음에 보관하십시오.
  16. 흡광도를 측정하여 RNA 농도와 순도를 평가합니다. 1 % 아가 로스 겔상에서 샘플을 실행하여 RNA 무결성을 평가.

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결과

독점적으로 심근. (그림 1)에서 twu34 형질 전환 라인 (9), 녹색 형광 단백질 (GFP)을 표현한다 : 여기서 우리는 제브라 피쉬의 Tg (GFP myl7)를 사용하여 대표적인 심장 해부 실험을 설명합니다. 우리는 해부 하트 그들이 심장 시료의 순도를 평가하기 위해 유도 된 배아로부터 모두 모았다. 간단히, 동형 접합의 Tg (myl7 : GFP) twu34 제브라 피쉬 (9)는 모든 배아 마음이 GFP가 표시되도록되어 야생형과 outcrossed했다. 일부 500 배아 (56 HPF)를 1.5 ml의 튜브에 옮겼다 (약. 100 배아를 각) (그림. 1A1, 1B). 프로토콜 부분 (2 단계)과 그림 1A에 기술 된 바와 같이, 각각의 튜브 처리되었습니다. 마음이 아래로 여러 번 (그림. 1A2)를 피펫 팅에 의해 발표 후 100 μm의 필터 (그림. 1A3)에 적용되었다. ...

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토론

이 프로토콜은 유전자 발현 용 제브라 피쉬 배아 심장 조직의 신속한 분석을 보충한다. RNA 정제 할수있는 충분한 작동하기 때문에, 하트 손실 프로토콜의 모든 단계에서 방지 할 경우에는 먼저, 시료의 수량이 크게 향상된다 : 심장 특이 RNA 샘플의 양과 질을 크게 몇 결정적인 단계에 따라 출발 물질. 둘째, 실험에 전적으로 의존하는 샘플의 순도는, 정렬 및 엄격하게 다른 조직을 제외한 동안 배양 접시 내 마음을 수집하여 결정된다. 셋째, 샘플 품질은 비판적으로 배아의 파괴에 따라 발생할 수있는 RNA의 분해를 제한에 따라 달라집니다; 이것은 세포 죽음을 피하기 위해 세포 배양 배지를 사용하여 얼음에 샘플을 유지함으로써 달성된다. 마음이 RNAlater 또는 트리 졸에 전송 된 후 RNA 분해가 중지됩니다. 마음 페트리 접시에 치는 것을 강력하게 보여주는 심장 t문제는 절개 후 생리 학적으로 정상입니다.

우리는 충분히 RNA 안전하게 (함께 5 ~ 10 μg의 글리코겐으로) ...

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공개 사항

저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

이 정제 프로토콜의 기본 원리를 설명해 준 C. Burns, C. McRae, 그리고 우리 실험실에서 이 방법을 처음 구현한 F. Priller에게 감사드립니다. S.A.-S. 는 Deutsche Forschungsgemeinschaft(DFG)의 하이젠베르크 교수직의 지원을 받습니다. 이 작업은 DFG 보조금 SE2016/7-1의 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
물고기를 기르고 알을 모으는 장비 자세한 내용은 Zebrafish Book11 참조
형광 실체현미경
냉장 마이크로 원심분리기
UV-분광 광도계e.g. Thermo Scientific Nanodrop 2000
핵산 전기영동 챔버
페트리 접시 4cm Ø, E3 매체
마이크로 피펫 및 팁(P20, P100, P1000)
원심분리 튜브
15ml 및 50ml 원심분리 튜브
Dumont #5 겸
자 쌍ExactaCruz™ 멸균 랙에 있는 라운드 젤 로딩 팁, 1-200μ 엘 산타 크루즈sc - 201732
100 μ m 필터 (BD Falcon 100 mm Cell Strainer)BD Biosciences352360
30 μ m 필터 (Pre-Separation Filters-30 µ m)Miltenyi Biotec130-041-407
위상 잠금 젤, 무거운, 1.5 ml 튜브 프라임2302810
계란 물 매체60 μ g/ml 인스턴트 해양 바다 소금(ddH2O), 0.00001%(w/v) 메틸렌 블루
E3 매체 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4
Tricaine (3-amino benzoic acidethylester)Sigma-AldrichA-50404 mg/ml Tricaine stock solution, pH 7
1% 아가로스(E3 매체)
1% 아가로스 젤(TBE 완충액)
Leibovitz´ s L-15 미디엄 Gibco21083-027
FBS (Fetal Bovine Serum)SigmaF4135
RNAlaterAmbionAM7020
TrizolAmbion1559606
Glycogen Invitrogen10814-01020 &마이크로; g/&마이크로; l RNase-free 물에서
클로로포름
이소프로판올
75% 에탄올 (DEPC-ddH2O에서)
뉴클레아제가 없는 물 또는 멸균된 DEPC는 ddH2O
핵산 로딩 버퍼
TBE (Tris/Borate/EDTA) 전기 영동을 위한 버퍼를 처리했습니다.
: 에 1% 아가로스로 코팅1.5ml

참고문헌

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