펩타이드 배열을 사용하여 단백질 - 단백질 상호 작용 사이트를 확인

요약

펩타이드 어레이 스크리닝은 단백질-단백질 상호 작용 부위를 식별하기 위한 고처리량 분석법입니다. 이를 통해 표적 단백질의 여러 상호 작용을 매핑할 수 있으며 단백질을 표적으로 하는 억제제의 부위를 식별하는 방법으로 사용할 수 있습니다. 여기에서는 펩타이드 어레이를 스크리닝하고 분석하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다.

초록

단백질 - 단백질 상호 작용은 유기체의 살아있는 세포의 항상성 및 제어 공정의 대부분을 매개한다. 장애인 단백질 상호 작용은 단백질 상호 작용에게 중요한 약물 표적을, 질병의 원인이 될 수 있습니다. 이것은 분자 레벨에서의 이러한 상호 작용을 이해하는 것이 매우 중요하다. 단백질 상호 작용은 세포의 생화학 적 분석에서 양적 생물 리 학적 분석법에 이르는 다양한 기술을 이용하여 연구하고 있으며, 이들 도메인은 단백질 또는 펩타이드와, 전체 길이 단백질과 중 수행 될 수있다. 펩타이드는 펩타이드가 용이하게 합성 할 수 있기 때문에 단백질의 상호 작용을 연구하고, 특정 상호 작용 사이트에 집중 할 수 있도록 우수한 도구를 제공합니다. 펩타이드 어레이는 치료 목적 표적 단백질에 결합 펩티드 두 단백질 사이의 상호 작용 위치의 식별뿐만 아니라 스크리닝을 가능하게한다. 그들은 또한 높은 처리량 SAR 연구를 할 수 있습니다. 결합 부위, typi의 식별을위한학적 펩타이드 어레이는 일반적으로 부분적으로 원하는 타겟 단백질의 하나 또는 그 이상의 파트너 단백질의 전체 서열로부터 유도 된 10 내지 20 잔기 펩티드 겹치는 포함. 표적 단백질을 바인딩 어레이 스크리닝 단백질 만 소량 사용 쉽고 빠른 방법에서 파트너 단백질의 결합 부위에 대응하는, 펩티드 결합을 보여준다.

이 문서에서 우리는 목적 단백질과 파트너 사이의 상호 작용 사이트를 매핑하는 펩타이드 배열을 선별하기위한 프로토콜을 설명합니다. 펩티드 배열은 고려 그들의 이차 구조를 고려 파트너 단백질의 서열에 기초하여 설계된다. 이 프로토콜에 사용되는 배열은 INTAVIS 바이오 어낼 리티 컬 인스트루먼트 준비 Celluspots 배열했다. 이 배열은 바인딩 불특정 한 후 연구 단백질 배양 방지하기 위해 차단됩니다. 항체를 이용하여 검출 단백질 간의 특이 적 상호 작용 부위에 대응하는 펩타이드 결합을 보여준다.

서론

단백질 - 단백질 상호 작용은 살아있는 세포에서의 처리의 대부분을 매개한다. 장애인 단백질 상호 작용은 단백질 상호 작용에게 중요한 약물 표적을, 질병의 원인이 될 수 있습니다. 이것은 분자 레벨에서의 이러한 상호 작용을 이해하는 것이 매우 중요하다. 단백질 상호 작용은 세포의 생화학 적 분석에서 양적 생물 리 학적 분석법에 이르는 다양한 기술을 이용하여 연구하고 있으며, 이들 도메인은 단백질 또는 펩타이드와, 전체 길이 단백질과 중 수행 될 수있다. 펩타이드는 단백질 상호 작용을 연구하는 우수한 도구를 제공합니다. 펩티드는 쉽게 합성 한 손과 반면 ^1,2에 고 스루풋 방식으로 다수의 표적 단백질에 특이 적 상호 작용 부위에 초점을 허용 할 수 있기 때문이다. 펩타이드 어레이 스크리닝은 빠르고, 단시간 ^(3)에 다수의 파트너와 표적 단백질의 상호 작용에 관한 많은 양의 데이터를 획득하기위한 방법을 수행하기 쉬운. 단백질 - 단백질 상호 작용을 검출하고 분석하기위한 다른 생화학 또는 생물 물리학 적 방법과 달리, 펩티드 배열 선별은 단백질의 매우 낮은 농도를 필요로하며, 매우 약한 결합 검출 할 수있다. 펩타이드 배열이 효소의 활동 ^(6)과 높은 처리량을 연구, 단백질 - 단백질 또는 수용체 - 리간드 상호 작용 사이트 ^4, 동종 또는 이종 올리고머 인터페이스의 매핑과 같은 펩타이드 - 단백질 상호 작용에 많은 응용 프로그램의 특성 항체를 ⁵ 항원 사용할 수있는 구조 - 활동 관계 (SAR)는 ^{7 연구.} 펩타이드 배열 검사에 대한 심도있는 검토를 위해 카츠 등을 참조하십시오. ⁴

펩타이드 어레이의 여러 유형 현재 존재한다. 펩타이드의 합성을 주로 SPOT 기법 ^4,8를 사용하여, 직접 고체 지지체에 펩티드의 고체 지지체, 또는 합성을 부착하기 전에 : 펩타이드 어레이를 만들기위한 두 가지 주요 합성 전략이있다.펩티드는 9- 플루 오레 닐 옥시 카보 닐 (Fmoc) 화학 ^(8)에 의해 일반적으로 고체 지지체 상에 합성된다. 일반적인 합성 기법 중 C 말단을 통해 펩타이드 N 말단을 통해 첨부 파일 (예를 들어, JPT의 pepstar 배열 ⁹⁾ 및 펩타이드 첨부 파일은 (예를 들어, PEPSCAN의 pepchip 어레이 ^(10), JPT의 pepspot 배열 ⁹ INTAVIS의 celluspot 어레이 ^{(11)) 4.} 고체 지지체는 다양하며, 그래서 그것에 펩타이드 결합의 화학적 성질을 수행 할 수 있습니다. Cys 또는 말단 펩티드는 티올 기 ^(12)를 통해 유리 슬라이드에 부착 될 수있다. 펩티드의 N 말단이 공유 결합 된 아미노산의 에스테르 화를 통해 셀룰로오스 막에 수산기에 결합 될 수있는 ^{8 첨부.}

여기서 우리는 단백질 - 단백질 상호 작용을 연구하기위한 방법으로 펩타이드 어레이 스크리닝 상세한 프로토콜을 제시한다. 우리가 사용하는 배열은 큰 AMO를 포함하는 마이크로 어레이 인 Celluspots 배열입니다유리 슬라이드에서 지원하는 작은 셀룰로오스 막에 점 (384 점 중복)의 UNT. 이 낮은 단백질의 볼륨과 항체 작업과 하나의 실험 당 데이터의 상당한 양을 획득 할 수 있습니다. 이 배열은 또한 바인딩 선호도가 낮은 검출 할 수 있습니다 높은 펩타이드 밀도가 포함되어 있습니다. 어레이는 정상 세포 증식 ^(13)을 제어하기에 매우 중요하다 STIL-CHFR 상호 작용을 매핑하기 위해 사용되었다. 두 단백질 사이의 상호 작용은 제어되지 않은 암의 발생을 초래할 수있다. 이 상호 작용을 매핑하여 우리는 특정 결합 부위와 잔여 ^{14 바인딩을} 발견했다. 이것은이 단백질 - 단백질 상호 작용을 억제하는 억제제 합리적 설계를위한 길을 열어.

프로토콜

1. 펩타이드 어레이 설계

1. 부분적으로 10 ~ 20 잔기 펩티드 겹치는에 표적 단백질의 서열을 나눈다. 특정 실험에 오버랩 량과 행하는 실험실 자원 있지만 원칙적 긴 오버랩을 더 다양하다. 펩타이드의 상호 작용에 대한 책임을 질 수있는 단백질 계정 알려진 이차 구조 요소를 고려 설계 할 때.
2. 상업 업체를 통해 설계 펩타이드 배열을 주문. 여기서, 사용 펩티드 공유 C 말단을 통해 어레이에 결합.

바인딩 2. 차단 비 특정

1. 0.05 % 트윈 -20 (TBST / PBST)를 함유하는 50mM 트리스 또는 포스페이트 완충액을 확인하고 (정확한 이온 강도를 알기 위해)의 HCl 또는 NaOH를 측정 된 양 및 NaCl을 사용하여 원하는 이온 강도와 원하는 pH로 조정 . 여기에서, 7.5의 pH 및 150 mm의 이온 세기를 사용한다.
2. 의 블로킹 용액을 만들기2.5 %는 (W / v)의 TBST / PBST에서 탈지유 분말.
3. 비특이적 결합을 방지하기 위해, 차단 용액 5ml에 배열 몰입. 2-4 상온에서 시간 또는 하룻​​밤 진탕 4 ºC에서의 배열을 품어.

3. 단백질과 배양

1. 실온에서 진탕 기에서 5 분 동안 5 ㎖를 TBST / PBST 회 30 초 동안 차단 용액과 5 ml의 제 배열을 씻는다.
2. (v가 ​​/ w) 비특이적 결합을 방지하기 탈지유 분말 2.5 %를 함유하는 그의 태그 된 단백질 용액 5 ㎖로 세척하고 어레이를 부화. 여기서, 설명 블로킹 용액에 용해 된 단백질 용액의 4.5 μM (STIL 500-650)을 사용한다.
   NOTE : 보통 5-10 μM 단백질은 선별을 위해 사용되지만, 단백질 농도는 결합 친화력과의 로컬 어레이에 결합 된 펩타이드의 농도 (효율에 따라, 심지어 낮은 2-3 μM 일 수있다 합성). 버퍼있는 단백질다양 할 수 있지만, 상술 한 용해 같은 차단 용액을 사용하여 단백질을 희석하는 것이 일반적이다.
3. 실온에서 밤새 또는 4 ºC에서 3-8 시간 동안 단백질 용액을 인큐베이션 어레이.

4. 항체와 함께 배양

1. 5 ml의 TBST / PBST로 배열을 세 번 씻으십시오. 처음 세탁은 실온에서 진탕에 두 5 분 세척 한 다음 30 초입니다.
2. 실온에서 쉐이커상에서 1 시간 동안 블로킹 용액과 동일한 농도에서 동일한 성분을 함유 배양 완충액 : 희석 된 HRP 컨쥬 게이트 된 항체 5 ㎖ (1500 1)로 세정 배열 부화. 항체는 표적 단백질 또는 태그 중 하나를 결합 할 수있다.
3. 인트없이 동일한 프로토콜을 반복함으로써 배열 표적 단백질 (예를 들어, 올리고머 화를위한 연구)로부터 펩티드를 포함 특히 어레이 펩타이드 항체의 상호 작용을 시험 대조 실험을 수행P (3), 단백질과 인큐베이션.
4. 5 ml의 TBST / PBST로 배열을 세 번 씻으십시오. 처음 세탁은 실온에서 진탕에 두 5 분 세척 한 다음 30 초입니다.

5. 배열을 읽기

1. ECL 웨스턴 블로 팅 기판 키트와 함께 발광 개발을 수행하십시오.
2. 발광 이미지 분석기로 검출을 수행.
3. 결과를 분석합니다. 어레이의 두 중복이 같은 신호를 보여, 그래서 결과를 신뢰할 수 있는지 확인합니다. 파트너 단백질의 구조가 알려지면, 결합 펩티드 구조에서 검색하고 결합 부위를 찾는다. 순서에 멀리있다하더라도 펩타이드는 차 구조에 가깝게하고 구속력있는 사이트를 만들 수 있습니다.

결과

STIL은 매우 중요 centrosomal 단백질이다. ^{19 -} 그것은 정상적인 세포 분열 및 세포 증식을 ^{13, 15를} 제어합니다. STIL 여러 단백질 ^18,20,21과 상호 작용하고 상호 작용의 대부분은 본질적으로 무질서 지역 (IDR) ⁽¹⁴⁾ 자사의 중앙 부분을 통해 발생합니다. 우리는 STIL 결합 단백질 CHFR에서 유래 펩타이드로 구성된 배열을 설계했습니다. CHFR 스트레스 ²² 유사 분열에 응답하여 유도되는 종양 억제이다. CHFR의 STIL 결합 도메인의 구조가 시간에 알려지지 않았다 때문에 프로토콜의 단계 1.1에 기재된 바와 같이, 우리는 7 잔기의 오버랩으로 15 잔기 긴 펩티드 단백질 도메인을 분할. 전술 한 프로토콜에 설명하고도 1에 도시 된 바와 같이 우리는 CHFR-STIL 결합 부위를 식별하기위한 스크리닝 펩티드 배열을 수행. 우리를 제공 할 수 중복 384 펩티드 ...

토론

펩타이드 어레이 스크리닝 파트너에서 표적 단백질의 결합 부위를 식별하기위한 훌륭한 도구이다. 상기 분석을 수행하기 쉽고 빠르게 결과는 하나 또는 두 개의 일 얻을 수있다. 펩타이드 어레이 스크리닝 다재다능 많은 목적을 위해 사용될 수있다. 그것은 예컨대 인산화와 같은 번역 후 변형을 특성화하고 키나제의 기판을 식별하는데 사용될 수있다. 예 : 급성 골수성 백혈병 관련이 FLT3 키나제, 펩티드 배열 ^{(6) 스크리닝에} 의해 발견 티르 - 함유 기질 펩티드를 인산화. 티로신 키나제 억제제의 파 조파 닙과 라파티닙의 억제 특성은 ^{23 스크리닝} 펩타이드 어레이를 사용하여 테스트 하였다. 펩티드 배열은 단백질 - 단백질 상호 작용을 중개 사이트를 식별하기 위해 사용될 수있다. 이 방법을 사용하여 우리의 실험실에서 연구 단백질의 예는 다음과 같습니다 HIV-1 VIF 단백질 및 세포 A3G 단백질 사이의 상호 작용이 우리를 특징으로했다펩타이드 어레이 ^(24)를 보내고; 펩타이드 ...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
펩타이드 어레이	INTAVIS Bioanalytical Instruments
His-probe 항체 (H-3) HRP	Santa Cruz Biotechnology	sc-8036 HRP
EZ-ECL Kit	Biological industries	20-500-120
Skim Milk	Becton, Dickinson and Company	232100
LAS-3000 camera	후지 필름