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방법 논문

위한 도구로 리포좀 캡슐화 된 근적외선 형광의 형광 담금질 생체 광학 이미징

15.6K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/52136

⸱

2015년 1월 5일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Experimental Radiology, Institute of Diagnostic and Interventional Radiology I, Jena University Hospital, 2Department of Pharmaceutical Technology, Friedrich-Schiller-University Jena, 3Center for Electron Microscopy, Jena University Hospital

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

생체 내 이미징을 위한 형광단의 사용은 옵소니화, 빠른 제거, 낮은 검출 감도 및 숙주에 대한 세포 독성 효과로 인해 크게 제한될 수 있습니다. 필름 수화 및 압출에 의한 리포솜 내 형광단의 캡슐화는 형광 소멸 및 보호로 이어져 높은 검출 감도로 in vivo 이미징을 가능하게 합니다.

초록

광학 이미징은 광범위한 진단 방식을 제공하며 생체 의학 이미징 도구로 많은 관심을 끌고 있습니다. 현재 사용 가능한 이미징 기술의 엄청난 수와 기기의 발전에도 불구하고 in vivo 이미징에 적합한 고감도 프로브에 대한 요구는 여전히 존재합니다. 사용 가능한 전임상 형광 프로브의 일반적인 문제 중 하나는 생체 내에서 빠르게 제거되어 이미징 감도가 감소한다는 것입니다. 급격한 제거를 우회하기 위해, 표적 부위에서 염료 분자의 수를 늘리고, 그로 인해 배경 자가형광을 줄이고, 근적외선 형광 염료의 캡슐화, 리포좀에서 DY-676-COOH를 캡슐화하고, 염증의 생체 내 이미징 가능성을 검증했습니다. DY-676은 고농도에서 자체 담금질하는 능력으로 알려져 있습니다. 먼저 자가 담금질에 적합한 농도를 결정한 다음 이 담금질 농도를 PEGylated 리포좀의 수성 내부로 캡슐화했습니다. 리포좀의 담금질 및 활성화 가능성을 입증하기 위해 당사는 캡슐화된 염료에 영향을 주지 않고 리포솜 막을 손상시키는 가혹한 동결 방법을 사용합니다. 높은 수준의 형광 담금질을 특징으로 하는 리포솜은 Lip-Q라고 불렸습니다. 우리는 다양한 세포주를 사용한 실험을 통해 Lip-Q의 흡수가 주로 식세포작용에 의해 이루어진다는 것을 보여주었으며, 이를 통해 마우스 모델의 염증에 대한 생체 내 이미징을 위한 도구로서의 잠재력을 특성화할 수 있었습니다. 또한, 생쥐에서 zymosan-induced edema model을 사용하여 in vivo 염증의 광학 이미징에서 Lip-Q의 잠재력을 입증합니다. 염증으로 인한 향상된 투과성 및 유지(EPR) 효과로 인한 흡수 가능성을 고려하여 DY-676-COOH(Lip-dQ라고 함) 및 무료 DY-676-COOH의 낮은 담금질 농도를 가진 상시 가동 리포좀 제형을 동물 실험에서 Lip-Q와 비교했습니다.

서론

리포좀 집중적으로 연구 및 임상 응용에 가장 1,2- 생체 의용 약물 전달 시스템의 하나로서 역할을하고있다. 이들은 주로 천연 세포막의 일부를 모방하는 화합물이다 생체 둘 콜레스테롤 및 인지질로 구성된다. 친수성 물질은 수성 내부에 혼입 될 수있는 반면, 친 유성 제제는 리포좀 인지질 이중층 3 내에 내장 될 수있다. 리포좀의 수성 내부 내에 캡슐화 물질의 생체 내에서 분해에 대한 보호 기능을 부여하고 또한 종양 세포 파괴를 목표로 화학 요법 제를위한 예시적인 질병의 치료에 사용되는 세포 독성 약물의 독성 효과로부터 호스트 시스템을 방지한다. 폴리에틸렌 글리콜 중합체와 같은 리포솜 표면의 변형 (PEG 화)를 더 인해 sterical 안정화 (4)에 생체 내에서 리포솜 혈액 순환 시간을 연장한다. Moreov어, 리포좀 단백질 5, 6, 친수성 물질 7,8 효소 (9) 등 여러 가지 물질의 높은 농도를 격리한다 수 있습니다. 그러므로 그들은 암 치료 4 독소루비신으로 세포 독성 약물의 전달을 위해 자신의 승인을받을만한 신뢰할 임상 치료 및 진단 도구를 제공합니다. 유연성이 있기 때문에, 리포좀은 또한 진단 및 영상 유도 수술 목적의 형광체와 함께로드 될 수있다.

형광 이미징는 비용 효율적이며 그러나, 기본적인 요건을 요구 생체 진단 도구에 비 침습적. 이 생체 내 이미징을위한 가장 적합한 형광 색소가 빛을 분산 및 산란뿐만 아니라 물에서 발생하는 조직의자가 형광과 헤모글로빈이 낮은 범위의 특성 흡수 및 배출 최대 값이 있는지 입증 할 수있다. 따라서, 이러한 프로브는 650 nm의 10 (900) 사이에서 자신의 복근 / EM 최대 값을 가지고있다. 옵 소닌과 신속한 간극이 크게 생체 내 이미징 (11)을위한 그들의 적용을 제한 할 수 있으므로,이 외에, 시험 관내 및 생체 내 형광 색소의 안정성이 매우 중요하다. 불량한 안정성과 낮은 감도 또는 인도 사이 아닌 그린 (ICG) 12-16으로 볼 때 표적 장기에 세포 독성 효과와 같은 다른 효과는 원치 않는이며, 생체 내 이미징 프로브를 설계 할 때 고려되어야합니다. 이러한 관찰은 여러 임상 근적외선 형광 색소, 나노 입자뿐만 아니라 염증 반응, 암의 생체 내 이미징 및 영상 유도 수술 17 ~ 20를위한 새로운 기술의 적극적인 개발을 주도했다. 대부분의 전임상 NIRF (근 적외 형광)의 안정성에도 불구 염료 시험관, 간과 신장을 통해 빠르게 관류 및 클리어런스가 질환 및 염증 과정의 생체 내 이미징 광학의 사용을 방해.

ntent은 "> 따라서 우리는 다음과 같은 형광 색소의 캡슐화 프로토콜을 제시 잘 특징 근적외선 리포좀에 상대적으로 높은 농도 (21)에 자기 담금질에 그 경향이 알려져 형광 염료 DY-676-COOH. 높은 농도에서 H- 이량 체 형성 및 / 또는 파이 - 적층, 형광 분자 증가 사이 저농도. 스페이스를 형광 색소 분자 사이 포스터 공명 에너지 전이 (FRET)에 서로 포스터 반경 결과에 위치한 형광 분자 사이의 상호 작용을함으로써, 파이 - 스태킹 상호 작용을 방지하고 H-이량 체 형성 및 높은 형광 방출의 결과. 높고 낮은 농도 및 첨부 형광 소광 및 활성화 사이의 스위치는 광학 영상 (22)에 대해 이용 될 수 유망한 전략이다. NIRF 염료 고농도의 이러한 관점에서, 캡슐화 리포좀의 수성 내부에서 DY-676-COOH 더 파이다무료 염료에 비해 생체 내 이미징 vorable. 방법의 과제는 높은 농도의 염료를 캡슐화 인한 이득의 검증에서, 둘째 올바른 밀봉에 우선하고있다. 염료의 농도가 낮은 비 켄칭 리포솜 제형으로도 자유 염료의 켄칭 리포좀의 결상 특성을 비교하는 것은 필수적이다. 우리는 리포좀의 DY-676-COOH의 담금질 농도의 캡슐화가 가능하다 대체 동결 및 해동 사이클과 함께 간단하지만 매우 효과적인 필름 수화 및 압출 프로토콜을 보여줍니다. 이러한 역상 증발 법 (23)뿐만 아니라, 에탄올 주입법 24 리포좀을 제조하는데 사용하는 다른 방법은 많은 친수성 물질에 대한 높은 캡슐화 효율이 리포좀 제제를 사용. 그러나, 물질의 성질은 포위 효율에 영향을 미칠 수있는 캡슐화. 사실상여기에 제시된 필름 수화 및 압출 프로토콜은 DY-676-COOH의 캡슐화 가장 높은 효율을 밝혔다. 몇 시간 내에 염증 과정의 연구를 허용 DY-676-COOH, 자이 모산 - 유도 부종 모델의 리포좀 캡슐화의 장점을 설명하기 위해 사용되었다. 여기서, 캡슐화 DY-676-COOH 고농도 리포좀은 자유 염료 또는 낮은 염료 농도 비 켄칭 리포좀 제형보다 염증 과정의 생체 내 광 이미징 전신에 더 적합하다는 것을 입증한다. 따라서 기본 프로토콜은 형광 켄칭 리포좀 시험 관내 및 생체 내 활성 및 그들의 촬상 전위의 유효성을 생성하는 간단하고 빠른 방법을 제공한다.

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프로토콜

참고 : 모든 절차가 지역 동물위원회 및 동물의 윤리적 사용에 대한 국제 지침에 따라 승인됩니다.

용 재료 및기구 1. 준비

  1. 자발적으로 형성된 소포 분산액의 제조 (SFV)
    1. 다음과 같은 인지질의 재고 솔루션을 녹여 준비 : 214 ㎎ / ㎖ 계란 포스파티딜콜린 (EPC), 134 ㎎ / ㎖ 콜레스테롤, 122 ㎎ / ㎖ 1,2- distearoyl- SN -glycero-3-phosphoethanolamine- N - [메 톡시을 (폴리에틸렌 글리콜) -2000 (암모늄 염) (MPEG -DSPE 2000) 및 2 ㎎ / ㎖의 1,2- dioleoyl- SN -glycero -3- phosphoethanolamine- N - (7- 니트로 2-1,3-benzoxadiazol -4- 유리 병에 클로로포름 및 저장소 일) (암모늄염) (NBD-DOP​​E).
    2. 둥근 바닥 플라스크에 대략 3 ㎖ 클로로포름 퍼니 및 EP 이루어진 리포좀을 제조하는 둥근 바닥 플라스크에 인지질 스톡 용액의 적절한 용적을 전송할C : 3 : Chol을 0.5 : 6.5의 몰비가 mPEG 2000 -DSPE. 리포좀의 이중 형광 라벨은 지질 용액에 0.3 몰 % NBD-DOP​​E를 추가합니다.
    3. 회전 증발기를 사용하여 55 ° C에서 감압 (300 밀리바) 하에서 유기 인지질 용액으로부터 클로로포름을 증발시켰다.
    4. 균질 인지질 막을 형성 한 후, 잔류 클로로포름 퇴적물을 제거하기 위해 1 ~ 2 시간 동안 10 mbar의 압력을 감소시킨다.
    5. 클로로포름이 증발되는 동안, 10 mM 트리스 버퍼 pH 7.4에서 DY-676-COOH (6.181 μM)을 녹여 액체 질소 듀어 용기를 입력합니다. 초음파 목욕에 전환하고 50 ° C로 설정.
    6. DY-676-COOH (6.181 μM) 자발적으로 형성 소포 (SFV) 분산이 형성 될 때까지 건조 인지질 막과 격렬하게 소용돌이를 수화하는 둥근 바닥 플라스크에 솔루션의 적절한 볼륨 (0.5 ml)에 전송합니다. 인지질의 모든 지질 손실을 방지하기 위해 분산되어 있는지 확인합니다.
    7. 조심스럽게 TRAnsfer 환저 액체 질소로 SFV 분산액을 함유하는 플라스크를 3-5 분 동안 분산 물을 동결. 다음 분산을 해동 1-2 분 동안 격렬하게 분산 와동 50 ° C에서 초음파 목욕에 둥근 바닥 플라스크를 놓습니다. 일곱 동결 및 해동 사이클의 총을,이 절차를 여섯 번 반복합니다.
  2. SFV의 압출 균질 리포솜 소포를 형성
    1. 1 ML의 주사기 (주사기)에 SFV 분산을 전송하고 주사기-B에 LiposoFast - 기본 압출기를 사용하여 100 nm의 폴리 카보네이트 막을 통해 분산을 돌출.
    2. 다시 주사기로, 주사기-B의 분산을 돌출, 다음 사이클을 열 번 반복합니다. 때문에 압출, 시간이 명확한 분산에 흐릿한 모습에서 주사기 변화의 솔루션입니다. 열 사이클 (스물 단일 압출 단계) 장치로부터 주사기-B를 제거하고 멸균 주사기 내로 직접로부터 최후에 분산액을 압출 한 후1.5 ml의 반응 관.
  3. 리포좀의 정제 무료 염료에서 DY-676-COOH를 캡슐화
    1. 10 mM 트리스 버퍼 pH 7.4 (컬럼 길이 28cm, 직경 0.8 cm)에 침지 G25 구슬을 이용한 겔 크로마토 그래피 컬럼을 준비한다.
    2. 겔 매트릭스에 샘플 드레인 겔 침대에 압출 소포 분산의 0.5 ml의 이동 및하자.
    3. 10 mM 트리스 버퍼 pH 7.4 (그림 1A)와 리포좀을 용출 및 열에서 완전히 무료 염료 배수 될 때까지 열을 씻는다. 필요하다면, 수집하고 제조업체의 지침에 따라 탈염 탈수하여 무료 염료를 재활용합니다.
    4. 다음 10 멸균 mM 트리스 버퍼 pH 7.4의 적절한 볼륨을 분산 초 원심 분리 (200,000 XG, 8 ° C에서 2 시간)에 의해 용출 된 리포좀을 집중.
  4. 캡슐화 된 DY-676-COOH 농도의 정량화
    1. DY-676-COOH (0, 82, 124을 용해하여 검량선을 작성,10 mM 트리스 완충액 247, 494, 988 nM의)은, pH가 0.1 ~ 7.4 % 트리톤 (Triton) X100을 포함.
    2. 소포를 파괴하고 캡슐화 된 염료를 해제하는 1 % 트리톤 (Triton) X100을 포함하는 100 ㎕의 트리스 완충액에서 실온에서 5 분 동안 리포좀 2 μL (50 밀리몰 / L 스톡 100 nmol의 최종 지질)을 녹인다. 이어서 0.1 %의 트리톤 X100 최종 농도 10 mM 트리스 완충액, pH를 7.4으로 시료를 희석 (V / V) 1 ml의 총 부피를 만드는. 중복의 모든 샘플을 준비합니다.
    3. 여기 λ = 645 nm의 방출 λ = 700 nm에서 흡수 및 배출 모든 샘플 (무료 DY-676-COOH 트리톤 - X100 처리 리포좀)을 측정한다. 정하고 캡슐화 염료의 농도를 결정하는 자유 염료의 검량선을 사용한다.
  5. 리포좀 특성
    1. 동적 광산란에 의한 리포좀의 크기와 제타 전위를 결정합니다. AC 멸균 필터 (0.2 μm의) 10 mM 트리스 버퍼 pH 7.4 리포좀 샘플을 희석100 ~ 300 μM (지질)의 oncentration. 저용량 일회용 큐벳으로 희석 샘플을 전송하고 제조자의 지시에 따라 샘플을 측정한다.
    2. 표준 프로토콜에 따른 리포솜 소낭들의 크기, 완전성 및 균질성을 입증하기 위해 전자 현미경에 의해 특성화 리포좀.

2. 형광 담금질의 확인 및 준비 리포좀의 활성화

  1. 형광 소광 활성화 및 물리 화학적 분석
    1. 립-Q에 대한 두 개의 1.5 ml의 튜브와 무료 DY-676-COOH 2 튜브를 준비합니다. 전송 100 nmol의 총 지질 튜브에 대응 (캡슐화 DY-676-COOH 138 ㎍ / ㎖를 함유하는 42 밀리몰 / L-Q 립 스톡 용액 2.38 μL). 립-Q의 색소 함량 (138 ㎍ / 1,000 μL 사용 립-Q μL X 2.38에서 예를 들어 결과 0.38 μg의) 무료 DY-676-COOH 상당을 전송합니다. 하나의 욕조를 품어4 ° C에서 각 프로브의 전자 및 -80 ° C 하룻밤 (16 시간)에서 제 2 튜브를 동결.
    2. 30 ° C까지 가열 블록을 가열. 짓 눌린 얼음 냉각 상자를 채우고 실온에 10 mM 트리스 완충액 pH 7.4의 나누어지는 평형.
    3. 4 ° C에서 프로브를 제거하고 5 분 동안 30 ° C에서 -80 ° C에서 프로브 (빛으로부터 보호하기 위해 알루미늄 호일에 싸서) 신속하게 해동 실온에서 평형. (또한 빛으로부터 보호하기 위해 알루미늄 호일에 싸서) 실온에 전송하기 전에 1 분 동안 얼음에 해동 프로브를 진정.
    4. 100 ㎕의 최종 부피로 각각의 프로브 10 mM 트리스 완충액 (pH 7.4)를 첨가하고, 실온에서 10 분 동안 평형을 모든 프로브.
    5. 피펫 80 저용량 유리 큐벳 각 프로브의 μL 및 분광기상에서 400 내지 900 nm의 각 프로브에서의 흡수를 측정한다. 그에 상응하는 튜브에 프로브를 돌려줍니다.
    6. 적당한 유리 큐벳에 각 프로브의 80 μl를 전송674 nm에서 흥미로운 프로브에 의한 분광에 형광 방출을 측정하고 694-800 nm의에서 형광을 측정.
  2. 세포 흡수 및 형광 활성화
    1. 표준 상태 (37 ° C, 5 % CO 2 95 % 가습 분위기)에 따라 해당 문화 미디어 다음 세포주를 얻고 문화. 여기서, 뮤린 대식 세포주 J774A.1를 이용 (둘 베코 이글 배지를 10 % (v / v) 소 태아 혈청이 보충 된 수정 된), 인간 뇌종양 세포주 U-118MG (필수 비타민 및 10 %를 함유하는 MEM (V / ⅴ) 소 태아 혈청)와 인간 섬유 육종 세포주, HT-1080 (5 % FCS로 RPMI).
    2. 폴리 -L- 리신으로 코팅 8- 웰 챔버 슬라이드 (각 웰에 100 ㎕의 0.001 % 폴리 -L- 리신을 추가하고 10 분 동안 37 ° C에서 배양한다. 대기음 용액 챔버 슬라이드 적어도 4 마르기하자 무균 작업대에 실온에서 시간. 챔버 슬라이드를 씻어 3필요할 때까지 200 μL 행크 완충 식염수 용액으로 시간 후 39 ° C에서 파​​라핀, 알루미늄 호일 및 저장으로 그들을 밀봉.
    3. 챔버 슬라이드가 건조하는 동안 필요한까지, 4 ° C에서 리포좀과 염료 용액 및 저장을 필터 소독.
    4. 생체 NIR 형광 이미징 시스템에서의 전신 흡수 프로브와 분석을 위해 시험 3 세포주의 각각에 대한 5 작은 배양 플라스크 (총 15 주 형틀)을 제조. 시드 2 × 10 6 J774A.1, U-118MG과 (quintuples)에서 각각의 배지 5 ㎖와 문화 플라스크 당 HT-1080 세포는 16 ~ 24 시간 동안 성장한다. 상기 배양 플라스크에 평행하게 각각 챔버 슬라이드 2 웰에 각각의 세포주 (J774A.1 및 HT-1080) 또는 20,000 세포 (U-118MG) 30,000 세포를 시드 및 16-24 시간 동안 500 ㎕의 배양 배지에서 성장 .
    5. 다음날, 세포 라인 당 챔버 슬라이드 각 세포주의 한 웰에 두 플라스크 립 Q-100 nmol의 (최종 지질 량)을 추가한다.즉시 1 ~ 4 ° C에 세포주 당 플라스크 인큐베이터에 두 번째 플라스크를 전송합니다.
      주 : 챔버 슬라이드에 집중하게 프로브 부피 플라스크에 첨가하고, 챔버 슬라이드를 동일한 10 배 이상 (5 ml를 500 ㎕의 배양 배지이다). 미세한 검출 플라스크로부터 세포 펠릿 결상 NIR 형광 이미징 시스템보다 덜 민감하기 때문에 필요하다.
    6. 세포주 당 챔버 슬라이드 각 세포주의 한 웰에이 플라스크에서 세포 립-Q의 염료 함량 농도 상당액 자유 DY-676-COOH를 추가 한 다음 즉시 세포주 당 한 플라스크를 전송할 4 ° C의 (에너지 고갈) 및 인큐베이터에 챔버 슬라이드와 함께 다른 플라스크에. 해당 조건에서 24 시간 동안 모든 세포를 품어. 프로브없이 플라스크의 세포는 치료를받지 않은를 제공합니다.
  3. NIRF 이미징 및 반 정량 분석
    1. 24 시간 배양 기간 후 행크스와 세포를 2 회 세척 플라스크에서 세포를 수확 500 μL 튜브 소금 용액 (HBSS) 다음 원심 분리 (200 XG에 5 분) 500 μL HBSS에 세포 펠렛을 긁어 버퍼링.
    2. 여기 (615-665 ㎚) 및 배출 (> 700 nm의에서 컷)의 세포 펠렛 (및 HBSS) NIRF 이미 저와 이미지를 사용하여 필터로 튜브를 놓습니다.
    3. 자가 형광 공제 및 제조업체 지침에 따라자가 형광 대 대상의 강도를 평가합니다. 이것은 측정치들이 서로간에 비교할 수 있도록, 노광 시간, 카메라 이득 비닝 및 비트 깊이 스케일링 후에 카운트 레벨을 나타내는 평균 신호로서 형광 강도 (스케일링 계수 / 초)의 반 정량적 수준을 줄 것이다.
  4. 공 초점 현미경 분석
    1. 24 시간 배양 후, 500 μL HBSS로 2 회 세척 챔버 슬라이드에 세포를 수확.
    2. 가전​​ 수정200 μL HBSS 실온에서 30 분 동안 3.7 % (v / v)의 포름 알데히드를 포함와 재편.
    3. 고정이 진행되는 동안, DNA 얼룩 장착 솔루션, 훽스트 (Hoechst)-33258 1:50 희석.
    4. 고정 후, 다음 HBSS와 세포 2 번 씻어 유리 슬라이드에서 챔버를 분리합니다. 챔버 슬라이드의 우물에 해당하는 각각의 자리에서 DNA 얼룩을 포함하는 50 μl를 장착 솔루션을 추가합니다. RT (어두운)에 투명 매니큐어 및 자연 건조 10 분으로 가장자리를 밀봉, 커버 글라스와 세포를 커버.
    5. 적합한 형광 현미경 공 초점 현미경 이미지 세포. 핵 (훽스트-33258 : 여기 405 nm의, 방출 420-480 nm의) 해당 구성 요소의 시각화를위한 다음 여기 및 방출 설정을 사용합니다. NBD-DOP​​E (리포좀 지질 : 여기 488 nm에서 530 ㎚). DY-676-COOH (NIR 형광 염료 : 여기 633-645 nm의 방출 650-700 nm의).
      주 : 확인이 형광 현미경로만 제공은 더 높은 630 나노 미터보다 파장의 여기 및 방출을 허용 적절한 필터가 장착되어 있습니다.

3. 염증의 생체 형광 이미징에서 리포솜 기반

  1. 동물 및 재료의 제조
    1. 하우스 8~12주 된 물과식이 표준 조건에서 약 36g 무게 남성 NMRI 마우스.
    2. 세븐 일 전에 실험의 시작, 조직자가 형광을 줄이기 위해 모든 쥐에게 낮은 페오 포비 다이어트를 제공합니다.
    3. 24 시간 각 실험의 시작하기 전에, 원하는 영역에서 마우스 면도 (예, 뒷 다리 부종의 촬상이 요구되는 경우에이면의 전체 면적).
    4. 동물의 무게를 측정 및 프로브의 양을 계산 립-Q 사용의 내용을 염색 무게와 무료 DY-676-COOH (해당하는 kg 당) 10 μmol (지질 농도 마우스 (립-Q와 립 dQ를 당 주입한다) .
    5. 이미지 동물세포 펠릿에 사용 된 것과 동일한 설정을 사용하여 전신 NIR 형광 이미 저. 이 측정은 동물의자가 형광을 제공합니다.
    6. 1 ml의 등장 성 식염수를 10 mg을 모산-A를 용해하고 4 ℃에서 하룻밤 저장합니다.
  2. 염증 및 생체 내 NIRF 이미징의 유도
    1. 다음과 같은 솔루션이 포함 된 마우스에 3 주사기를 준비합니다. 50 μL 모산-A 용액 (10 ㎎ / ㎖) 50 ㎕를 등장 성 식염수와 두 번째 주사기와 하나의 주사기를 입력합니다. 제어 동물 용 립-Q와 립 dQ를 (10 μmol / kg 체중 (지질)가) (립-Q에서와 같이 농도) 시험 동물 무료 DY-676-COOH를 위해 지정되어있다 프로브와 세 번째 주사기를 입력합니다. 프로브는 150 μl의 최종 볼륨에 무균 HBSS로 희석되어 있는지 확인합니다.
    2. (건조를 방지하고 깊은 잠까지 2 % 이소 플루 란과 동물을 마취하고 발에 터치시 반응하지 않는하기 위해 동물의 눈에 아이 크림을 적용이)은 약 2 분 소요됩니다.
    3. (아직 마취) 따뜻한 매트에 마우스를 놓고 오른쪽 뒷다리에있는 모산-A 솔루션 피하 왼쪽 뒷다리에 식염수를 주입. (t 0 시간을 =로) 주입 / 측정 기록 시간을 즉시 정맥 프로브를 삽입 한 후 이후 이미지 동물을. 이미지 큐브 같은 결과 이​​미지를 저장하고 다른 모든 동물과 각각의 프로브에 대해 위 단계를 반복합니다.
    4. 이미지 동물 측정 챔버의 단계 (예를 들어, 아래 따뜻한 매트를 배치하여) 따뜻한있는 것을 확인하고 매 10 시간 게시 주사 2 시간 후에서 24 시간 후 주입, 저​​체온증을 방지하기 위해. 각 측정 한 후, 음식과 물을 광고 무제한으로 새장에 동물을 배치하고 온화한 동물 실에서 케이지를 배치합니다. 동물이 더 이상 터치에 반응하지 트면, 5-10 분 동안 이산화탄소 안락사 만드는 2 % 이소 플루 란 마취 제 의한 동물을 안락사반드시 동물이 완전히 호흡을 중지하고 엄격 경직이 발생.
    5. 표준 온라인으로 평가 될 수있다 프로토콜 (http://www.freebookez.com/mouse-dissection-lab-report/) 및 이미지 기관에 따라 쥐를 해부하다.
    6. 먼저 동물 (unmixing) (식염수로 뒷다리 왼쪽) 형광도에 대한 관심과 염증이 영역의 목표 형광 (모산-A와 오른쪽 뒷다리)의 다음 할당 영역의 전체 형광을 차감 한 제조업체의 지시에 따라 측정 결과를 평가합니다.

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결과

이러한 리포좀의 수성 내부에 여기에 사용 NIRF 염료 DY676-COOH와 같은 형광 염료의 고농도의 캡슐화는 형광 소광의 하이 레벨로 이끈다. 형광 급냉, 고농도 많은 형광체와 함께 볼 현상은, 대상 지역의 높은 감도 및 신뢰성있는 검출이 요구되고 생체 내 이미징 애플리케이션의 여러에서 이용 될 수있다. 리포좀의 사용은 또한 생체 내 (in vivo) 적용을위한 필수 불가결 염료의 보호를 제공한다. 리포좀의 철저한 특성화가 필요하며 생체 내 이미징을 위해 염료 캡슐화, 안정성과 리포좀의 크기, 형광 담금질 및 체외에서 캡슐화 된 색소의 활동도 적용의 수준 등 여러 가지 요인을 포함한다. 자유 염료의 비교, DY-676-COOH와 켄칭 리포좀 (립-Q)뿐만 아니라 매우 낮은 콘센트와 비 켄칭 리포솜 (dQ를 립)캡슐화 된 염료의 비율은 특히 생체 내 특성화에 대한 때문에 중요하다.

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토론

리포좀은 또한 형광 염료 전달​​ 시스템에 대한 역할을 할 수 있기 때문에, 그것들은 대상 질환의 촬상을 가능하게한다. 이러한 NIRF 염료, 여기서 사용 DY676-COOH, 형광 염료 등의 고농도의 캡슐화는 포획 염료의 형광 소광의 하이 레벨로 이끈다. 형광 급냉, 고농도로 많은 형광체와 함께 볼 현상은 대상 영역의 높은 감도 및 신뢰성있는 검출이 요구되는 생체 내 이미징 애플리케이션에서 여러 가지로 이용 될 수있다. 리포좀의 사용은 또한 생체 내 (in vivo) 적용을위한 필수 불가결 염료의 보호를 제공한다.

영화 수화 및 압출 기술은 필요에 따라 다른 크기 범위와 리포좀의 성공적인 준비를 할 수있는 널리 사용되는 방법이며, 서로 다른 물질 (25)의 다수의 캡슐화 등의 수정을 허용합니다. 따라서, 립의 제조에 적합osomes 이미징을 위해 NIR 형광 염료, DY-676-COOH로 캡슐화. 이 방법은 염료의 침묵 농...

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공개 사항

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감사의 글

이 작품은 독일 연구 협회의 HI-698 / 10-1 보조금과 RU-1652 / 1-1에 의해 지원되었다. 우리는 우수한 기술 지원과 종류의 지원에 대한 회사 DYOMICS GmbH에, 예나에 대한 도린 월 감사합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
< 강> 리포좀 준비를위한 재료 및 장비<
/ 강> 달걀 포스 파티 딜 콜린Avanti Polar Lipids840051P클로로포름에 용해하여 유리 바이알 (214 mg / ml)에 보관
레스테롤SigmaC8667클로로포름에 용해하여 유리 바이알 (134 mg / ml)에 보관하십시오.
1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000] (암모늄염)Avanti Polar Lipids880120P클로로포름에 용해시켜 유리병(122mg/ml)에 보관
1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-(7-니트로-2-1, 3-benzoxadiazol-4-yl) (암모늄 염)Avanti Polar Lipids810145P클로로포름에 용해시켜 유리 바이알에 보관 (2 mg/ml)
Sartorius MC1 (d = 0.01 mg)Sartorius AGResearch RC 210 P의 칭량에 사용됩니다
. Chi Labortechnik AGR-114인지질 필름의 수화에 사용됩니다
. 치 Labortechnik AGR-481인지질 필름의 수화에 사용됩니다
. 진공 컨트롤러B & uuml; chi Labortechnik AGB-720의 수화에 사용됩니다
. chi Labortechnik AGB-177인지질 필름 수화에 사용
순환 냉각기LAUDA DR. R. WOBSER
GMBH & CO. KG		WKL 230인지질 필름
DY-676-COOHDyomics GmbH676-0010 mM Tris에 용해하고 -20 °C에 재고를 저장하십시오. C
Tris-(Hydroxymethyl)-aminomethanApplichemA1086버퍼 10 mM, pH 7.4
TrichlormethanCarl Roth GmbH + Co. KGY015.2리포좀 제제에 사용
SonicatorMerck Eurolab GmbHUSR 170 H리포좀 제제에 사용
Vortex Genie 2 (Pop-off Cup, No. 146-3011-00)Scientific Industries Inc.리포좀 제제에 사용되는SI-0256
Sephadex G25 매체 GE Healthcare Europe GmbH17-0033-01리포좀 정제에 사용됩니다
Triton X100Ferak Berlin GmbH505002염료 정량화를 위해 리포솜을 파괴하는 데 사용됩니다
LiposoFast-BasicAvestin Inc.리포좀 압출에 사용
폴리카보네이트 필터 멤브레인, 100nm(Whatman Nucleopore Trans Etch Membrane, NUCLEPR PC 19 MM, 0.1 U)VWRLiposoFast-Basic을 통한 리포좀 압출에 사용
Fluostar Optima염료 정량화에 사용되는Labtech
Zetasizer Nano ZSMalvern포좀 크기 및 제타포텐셜 측정에 사용
초원심분리기 시료 농도에 사용되는Rotor Beckmann Coulter GmbHXL 80
Rotor Beckmann Coulter GmbHSW 55 TI는 시료
리포좀 및 광학 이미징 평가를 위한 재료 및 장비
Zymosan-A Saccharomyces cereviciaeSigmaZ4250-250MG염증
유도에 사용Isotonic Saline (0.9%)Fresenius GmbHPZN-2159621Zymosan-A
Isoflurane 기화기Ohmeda Isotec 4동물 마취에 사용됩니다
PZN-7253744마취
Thermo Mat Pro 20 WLucky Reptile61202-HTP-20마취 중에 동물을 따뜻하게 유지하는 데 사용됩니다.
Omnican-F (1 ml 주사) 의 피하 및 정맥 주사 적용에 사용되는BraunPZN-3115465
마취 중 동물의 눈 건조를 방지하는 데 사용
Hanks 완충 식염수 PAALaboratories / Biochrom AGL2045w / o Mg2 +, Ca2 + 및 페놀 레드. 프로브 희석 및 세포 세척을 위해
8-Well 챔버 슬라이드BD Biosciences354108세포 배양 후 현미경 검사에 사용됩니다.
세포 배양 플라스크Greiner BioOne
세포 배양 배지Gibco (life technologies GmbH)
태아 송아지 혈청 Invitrogen
Poly-L-Lysine 용액 (0.01%, 50  ml)SigmaP4832세포 배양 챔버 슬라이드를 코팅하는 데 사용됩니다
. Mountant PermafluorThermoScientific S21022-3현미경 검사용 장착 솔루션
Hoechst-33258AppliChemDNA 염색
Hera-Safe HeraeusInstruments세포 배양에 사용되는 멸균 작업대
HERA 세포Heraeus Instruments세포 배양에 사용되는 인큐베이터
LSM510-MetaZeiss컨포칼 현미경 검사
에 사용Maestro-TM in vivo 형광 이미징 시스템CRi, Woburn, 작은 동물의 전신 형광 이미징에 사용되는
분광 광도계 (Ultrospec 4300 pro UV)측정에 사용되는GE Healthcare
(Jasco FP-6200)형광 방출
Animals< / strong>
NMRI 마우스 (8-12 주령, 수컷)Elevage Janvier, France는 염증 시험에 사용됩니다.
콜 인지질 Rotavapor Bü는 은 은 인지질 필름 Vacobox Bü은 . . BMG 리 농도에 사용됩니다의 희석에 사용되며 .은 프로브 Panthenol 아이 크림 Jenapharm PZN-3524531는 현미경 검사용 흡수 분광 형광계 측정에 사용되는 Jasco

참고문헌

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