방법 논문

에 미세 소관 역학을 측정하는 plusTipTracker 소프트웨어를 사용 운송에 필요한 정보 미국 교통부 성장 콘

DOI:

10.3791/52138

⸱

2014년 9월 7일

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, Boston College

이 논문에서

요약

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MATLAB 기반, 오픈 소스 소프트웨어 패키지, plusTipTracker은 미세 소관 역학 정량화 형광 - 표지 + 팁 이미지 시리즈를 분석하는데 사용될 수있다.

초록

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미세 소관 (MT) 플러스 - 엔드 추적 단백질 (+ 팁) 이동 단말의 증가 플러스 끝에 지역화 및 MT 역학 1,2를 조절한다. MT 역학 분석에 가장 잘 알려지고 널리 이용 + 팁 중 하나는 모든 MT 성장 플러스 단부에 결합 최종 결합 단백질, EB1,이며, 따라서, MT 중합 한 마커이다. 성장 콘 내의 EB1 동작의 많은 연구는 개별적인 이동 단말 1-3를 분석 시간과 바이어스 된 컴퓨터 보조 손 추적 방법을 이용했다. 우리의 접근 방식은 고해상도, 배양 된 배아 성장 콘 5에서 태그 EB1의 라이브 이미지의 취득 다음 소프트웨어 패키지, plusTipTracker 사를 사용하여 MT 역학의 글로벌 매개 변수를 정량화하는 것입니다. 이 소프트웨어는 형광 표지 된 팁 + 영화 자동 감지, 추적, 시각화 및 분석을 결합 MATLAB 기반, 오픈 - 소스, 사용자 친화적 인 패키지. 여기서는 plusTipT를 사용하기위한 프로토콜을 제시배양하여 Xenopus laevis의 성장 콘에서 형광 표지 + 팁 혜성의 분석을위한 racker. 그러나,이 소프트웨어는 다양한 세포 유형 6-8 MT 동력학을 특성화하는데 사용될 수있다.

서론

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이 방법의 목표는 정량적 인 미세 소관 (MT)에 관한 정보 플러스 - 엔드 추적 단백질 (+ 팁) 성장 콘 생활의 역 동성을 획득하는 것입니다. MT + 팁은 이동 단말 9,10의 플러스 끝에 지역화 단백질의 그룹입니다. 그들은 중합, 재앙, 그리고 구조의 비율을 포함하여 MT 동적 불안정성 (11)의 매개 변수를 조절하는 다양한 기능을 수행합니다. MT 역학을 분석 한 잘 사용하는 방법은 성장 MT에 특이 적으로 결합 플러스 종료 1,12을 + 팁 EB1의 동작을 추적하는 것입니다. EB1은 성장 MT에 여러 개의 다른 단백질을 모집하는 것으로 알려져 플러스가 종료 MT 성장과 재앙 주파수 (15, 16)를 모두 촉진, 13, 14, 그리고 최근 MT 성숙 요인 15으로 설립되었습니다됩니다.

성장 콘 내에서 MT 역학의 많은 연구 EB1의 localizati로, 시간이 1 ~ 3 위에 EB1-GFP 역학의 변화를 측정하기 위해 손으로 추적 방법을 활용 한MT에게 플러스 단부 MT 중합 용 마커로서 사용될 수있다. MT 성장을위한 프록시로서 EB1-GFP 혜성 검사 용 주요 이점은 MT 역학 심지어 상당한 MT 오버랩 영역에서 측정 될 수 있다는 것이다. 손 추적 EB1-GFP 혜성의 방법은 MT에 유용한 통찰을 제공 하였지만 그것이 시간 소모적이며, 바이어스 될 수 있고, 행동들 1-3. 중요한 정보를 놓칠 수 있습니다 또한, 비정상적인 성장으로 콘 행동 가능성 (손으로 추적 할 때 일반적으로 필요한) 이동 단말의 일부만을 분석 골격 역학에 분 변화의 결과이다.

따라서, 우리는 높은 - 해상도, 배양 된 배아 성장 콘 5 태그 EB1의 라이브 화상의 취득 후, 소프트웨어 패키지, plusTipTracker 4를 사용하여 글로벌 MT 역학 파라미터를 측정한다. Danuser 연구소에서 개발이 소프트웨어는 다양한 세포 유형 6-8 MT 동력학을 특성화 여러 연구에 사용되었다. 그것은 우리를 오픈 소스입니다어 친화적 인 형광 표지 + 팁의 영화에 대한 자동 탐지, 추적, 시각화 및 분석을 포함 MATLAB 기반의 패키지로 제공된다. MT 역학의 특정 매개 변수가이 소프트웨어에 의해 계산됩니다의 긴 목록 (자세한 내용은 참고 4 참조)하지만, 성장 콘에서 MT 역학의 분석을 위해, 가장 유용한 매개 변수 (미크론 / 분) MT 성장 궤도 속도 아르, 성장 트랙 (초) 수명, 및 (미크론)의 성장 선로 길이. 소프트웨어 ( "소프트웨어"에서) Danuser 랩 웹 사이트에서 직접 다운로드 할 수 있습니다. Danuser 연구소는 현재 원래의 독립형 소프트웨어를 사용 가능한 상태로 유지하는 소프트웨어 패키지라고 불리는 U-트랙 2.0에 통합되어 + TIP 추적 분석을위한 새로운 인터페이스를 지원한다. 두 프로그램 사이의 기본 알고리즘은 인터페이스 및 분석 출력 만 차이, (적어도 2014 년 기준)와 동일하다. MATLAB 작은 및 / 또는 계산과 분석 체험관 초보자 용줬어은 plusTipTracker는 자동화 된 통계 매개 변수의 출력을 포함하여보다 사용자 친화적 인 기능을 가지고 있습니다.

여기서 우리는 배양 Xenopus의 laevis의 성장 콘에 EB1-GFP 역학의 이미지를 분석하는 단계를 설명합니다. 이 프로토콜은 MT 역학 (17)을 조사 최근 논문에서 사용되었다. 또한 로워 외를 참조하십시오. 2,012 5 EB1-GFP를 표현 배양 성장 콘에 대한 자세한 설명은. 이 논문은 주로 성장 원추의 EB1-GFP 역학 조사에 집중하지만, 동일한 프로토콜이 다른 세포 유형 (17)에 사용될 수있다. 모든 세포 유형의 경우, 프레임 간의 시간 간격은 최적의 TIP + 추적을위한 0.5-2 초 사이에 있어야한다. 프레임 간의 최대 4 초의 시간 간격이 가능하지만, 이것은 추가적인 추적 오차의 시간 간격 결과 증가 하였다.

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프로토콜

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이 프로토콜 및 비디오보다 상세하게 사에 소프트웨어 패키지를 설명하는 원래의 종이 동반자뿐만 아니라 Danuser 연구소 웹 사이트에서 소프트웨어 다운로드와 함께 제공되는 기술 보고서의 역할을하기위한 것입니다. 독자는 소프트웨어를 사용에 대한 추가 질문이있는 경우주의 깊게 문서를 검토하는 것이 좋습니다.

1 이전 이미지 분석에

  1. TIFF (태그가 지정된 이미지 파일 형식) 이미지 파일의 시퀀스로 각 시간 경과 영화를 변환 할 수 있습니다. 여러 성장 콘 / 세포가 특정 영화가있는 경우, 첫째 작물 각 성장 콘 / 셀은 자신의 이미지 시퀀스를 만들 수 있습니다.
    참고 :이 필요하지 않습니다, 개별 지역 -의 - 관심 (ROI)을 plusTipTracker 내에서 선택 될 수있다. 그러나, 작은 화상 사이즈를 사용하여 연산 처리의 속도를 증가시킨다, 그래서 이미지에 상당한 빈 공간이있는 경우에는이 단계를 권장합니다.
  2. 자신의 각 TIFF 시리즈를 저장MATLAB이 액세스 설정 경로 내에서 "이미지"라는 폴더 ( "이미지"대소 문자를 구분되어 있습니다). "현재 폴더"창에서 해당 파일 디렉토리에 새 경로를 추가 이동하려면 디렉토리 아이콘을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 "경로 추가 - 선택된 폴더 및 하위 폴더"를 선택합니다. 그것은 plusTipTracker 소프트웨어 폴더뿐만 아니라, 경로에 추가하는 것이 중요합니다.

2 plusTipGetTracks

주 : 화상 해석의 첫 번째 단계는, EB1-GFP를 검출 혜성 혜성 트랙에 연결 한 미소 관 역학 파라미터를 결정하는 것이다. 이것은 명령어 "plusTipGetTracks"4로 얻어진다.

  1. 분석, 오픈 MATLAB 응용 프로그램을 시작하고 명령 창에 "plusTipGetTracks"를 입력합니다. 이 새로운 대화 상자가 나타날 수 있습니다.
  2. "최대 신규 프로젝트 설정"을 클릭하고 하나 (또는​​ MOR을 선택e)에 해당하는 "이미지"폴더 (또는 "이미지"폴더)를 포함하는 디렉토리를 선택하여 이전 TIFF 이미지 시리즈의. 이 단계가 완료되면, 파일 디렉토리 (roi_1) ( "이미지"를 보유하고있는 동일한 폴더)가 생성 될 미래의 데이터 파일을 포함하는 것이다. 참고 : "설정 신규 프로젝트"단계는 별도의 세션 동안, 사전에 완료 할 수 있습니다.
  3. "마지막 지점을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭, 다각형을 선택하고 '마스크 만들기'를 클릭"새 창이 나타납니다. "확인"을 클릭합니다. 선택한 이미지 시리즈의 첫 번째 이미지는 표시됩니다. 클릭하고 성장 콘의 전체를 포괄하는 다각형을 만들기 위해 마우스를 사용합니다. 두 다각형을 닫으려면 마우스를 클릭합니다.
  4. 다각형이 폐쇄되면, 대화 상자가 나타납니다 : "다른 투자 수익 (ROI)을 선택 하시겠습니까?"이미지가 "예"를 선택 분석 할 수있는 또 다른 성장 콘이있는 경우; 그렇지 않으면이야당선자 "아니오".
  5. 즉시 분석 할 프로젝트를 선택합니다. "프로젝트 선택"을 클릭하고 분석하는 폴더 (roi_X)을 선택합니다.
  6. listSelectGUI 화면이 나타납니다. 화면의 왼쪽으로부터 프로젝트 (들)을 선택하고 화면의 오른쪽으로 위로 이동한다. "확인"을 클릭합니다. 프로젝트 목록을 저장하고 "저장"을 클릭 할 수있는 위치를 선택합니다.
  7. "탐지", "추적"및 "사후 처리"를 선택합니다. 이러한 선택이 이루어지고 나면, 대화 상자의 오른쪽은 구성이 될 것입니다. 각 옵션을 구성합니다.
    1. 이러한 매개 변수는 MT의 트랙으로 감지 혜성을 연결하는 데 사용됩니다. 추적이 제어 매개 변수 선택을위한 세부 사항은 페이지 소프트웨어 패키지를 다운로드하면 함께 제공되는 기술 보고서​​의 PDF의 9 ~ 10에 포함되어 있습니다; 문제가 발생주의 경우이 보고서를 읽어보십시오. Xenop에 EB1-GFP 혜성의 추적의 목적우리가 성장 콘 사용 laevis의 다음 추적 설정 : 검색 반경 범위 (픽셀) 5-12, 최소 서브 트랙 길이 (프레임) 3; 최대 갭 길이​​ (프레임) 8; 최대 수축 계수 0.8, 최대 각도 앞으로 50, 최대 각도 뒤로 10, 변동 반경 2.5. 이러한 설정은 그림 1에 나타내었다.

    참고 : 최대 수축 팩터는 "뒤로 갭"으로, 검출 된 "후방 갭"의 수를 줄이기 위해 설정된 트랙 결합에 혼잡 조건으로 주어진 에러 가능성, 성장 원추의 문맥에서 분석하는데 유용하지 않다. 성장 원뿔 이동 단말은 성장과 수축에 부가 작은 빈번한 전좌를 나타내고, 이들 제어 설정을 늘리면 결합하는 단계에서 증가 된 이동을 허용하는 부가 적으로, 모두 최대 순방향 각도뿐만 아니라 변동 반경은 비교적 높게 설정된다.
    1. 원하는 특정 이미지 수집 설정에 따라 사후 처리 설정에서 입력합니다.
  8. 설정이 구성되고 나면, "시작"을 클릭합니다. 이 소프트웨어는 선택되었습니다 중 설정이 실행됩니다. 이 사업을 추진과 크기의 수에 따라 시간 분 정도 걸릴 수 있습니다. 명령 창은 각 기능의 남은 예상 시간이 표시됩니다. plusTipGetTracks 단계가 완료되면, 명령 윈도우는 "완료!"를 표시 할 것이다
    참고 : 미크론 (MT 역학의 특정 매개 변수가 지금이 소프트웨어에 의해 계산 된의 긴 목록 (자세한 내용은 참고 4 참조)하지만, 성장 콘에서 MT 역학의 분석, 검토 할 수있는 가장 유용한 매개 변수 MT 성장 궤도 속도 아르 / 분), 초 성장 트랙 수명 () 및 마이크론의 성장 트랙 길이 ().

3 plusTipSeeTracks

참고 : 이제 미세 소관 트랙이 정의되어 있는지, 함수 "plustipSeeTracks는"트랙 시각화 4에 사용됩니다. 이 기능공간 MT 역학지도와 속도 영화를 포함하여 시각화를위한 다중 출력을 제공하지만, 여기에 초점이 성장 콘의 이미지에 중첩 MT 트랙을 표시하려면 "트랙 영화"를 사용하여에만입니다 수 있습니다. plusTipGetTracks가 동시에 여러 동영상을 분석 할 수 있지만, plusTipSeeTracks는 한 번에 하나의 동영상을 분석 할 수있다.

  1. 명령 창에 "plusTipSeeTracks"를 입력합니다.
  2. 대화 상자를로드 한 후, "프로젝트 선택"을 클릭합니다. 시각화하고 "폴더 선택"을 클릭하여 프로젝트를 포함하는 상위 디렉토리를 선택합니다. 새 창이 나타납니다 : "시각화 할 프로젝트를 선택합니다." 시각화하고 "확인"을 클릭하여 파일을 선택합니다.
  3. 다음, "선택 저장 ROI"를 클릭하십시오. 이전 단계에서 선택한 것과 동일한 roi_X 폴더로 이동하고 "roiYX"라는 이름의 파일을 선택합니다.
  4. w 지정 "출력 디렉토리를 선택"을 클릭하여여기에 MATLAB 트랙 시각화 파일을 저장합니다. 참고 : 우리는 나머지 데이터가 들어있는 동일한 폴더를 사용하는 것이 좋습니다.
  5. 선택 "트랙 영화를 만들기"및 화면 + 팁 혜성에서 계산 된 트랙 plusTipGetTracks의 모든 표시가 나타납니다. 이 단계는 파일 "allTracks_X_X_X"에서, 동영상 포맷 추적 시계열을 저장한다. AVI 등의 동영상을 저장할 수있는 옵션이 다른 기본 형식은 Quicktime.mov 파일로입니다 있습니다.

4 plusTipGroupAnalysis

참고 :이 마지막 기능은 분석과 MT 트랙 매개 변수의 비교를 위해 영화의 그룹을 만드는 데 사용됩니다.

  1. 명령 창에 "plusTipGroupAnalysis"를 입력합니다. 수동으로 비교 그룹을 선택하려면 첫째 "계층에서 자동 그룹"을 선택 취소합니다. 그런 다음, "선택 프로젝트"를 클릭하십시오. 모든 roi_X 폴더를 포함하는 상위 디렉토리로 이동분석합니다.
  2. listSelectGUI 화면이 나타납니다. 화면의 좌측에서 그룹에 포함하고 화면의 오른쪽으로 위로 이동하는 모든 프로젝트를 선택한다. "확인"을 클릭합니다. 프로젝트 목록을 저장하고 "저장"을 클릭 할 수있는 위치를 선택합니다.
  3. 창이 나타납니다 : "목록에서 첫번째 그룹을 선택하십시오." "확인"을 클릭합니다. listSelectGUI 창이 다시 표시됩니다. 이 시간 함께 풀링해야 첫 번째 그룹에 해당하는 파일 만 선택합니다. "확인"을 클릭합니다.
  4. 그런 다음 그룹 이름을 입력하고 "OK"를 클릭하십시오. 그에 따라 답변 및 그룹을 계속 선택 "다른 그룹을 선택?"창이 나타납니다. 창이 나타납니다 : "그룹 목록을 저장하는 위치를 선택합니다." 위치로 이동하고 "저장"을 클릭합니다.
  5. 출력 폴더에있을 것이다 선택 "을 선택 출력 디렉토리"를 클릭합니다저장.
  6. 실시 기 분석의 종류를 선택 - MT 트랙 수행되어야 각 그룹 또는 세포 분석 당 풀링할지 여부. 권장 통계 시험은 이미 지정되어 있습니다. 분석에서 모든 트랙을 포함하려면 해제를 - 선택 "영화의 시작 / 끝에서 트랙을 제거합니다." 그렇지 않으면, 선택이 상자를 갖는 동영상이 시작 또는 끝으로 과정에있는 모든 MT 성장 트랙을 제거합니다.
  7. 그룹 분석 선택이 설정되면, "그룹을 비교"를 선택합니다.

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결과

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여기에 설명 된 살아있는 세포에서 + TIP 역학을 정량화 여러 가지 정보 파일을 제공하므로이 소프트웨어를 사용.

함수 plusTipGetTracks는 (도 1에 도시 된 예시적인 설정을 사용하여) 트랙을 식별하고 + TIP의 트랙에 관한 매개 변수를 제공한다. 소프트웨어가 획득 한 것을 정보를 보려면 단계 2.2에서 만든 roi_X 디렉토리로 이동합니다. "공적"폴더가 검출 된 혜성의 이미지를 보여주는 시리즈 인 "overlayImages"를 포함하고 있습니다. 혜성 검출의 정확성을 증명할 수 이미지 분석 소프트웨어를 이용하여 이러한 이미지를 검사한다. "메타"폴더에는 자세한 "projData"파일을 포함 + 팁 혜성 통계에 대한 정보뿐만 아니라 "통계"파일이 포함되어 있습니다. "통계"파일을 보려면, 스프레드 시트 응용 프로그램의 오픈 워크 시트로 드래그합니다. 이 파일은 계산이 포함되어각 영화 (그림 2) d는...

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토론

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PlusTipTracker 신속하고 자동으로, 또는 세포 성장 원뿔 거의 모든 가시 EB1-GFP를 검출 혜성 혜성 트랙으로 링크 및 MT 파라미터를 계산하는 단순한, 그래픽 사용자 인터페이스를 제공한다. 다른 게시물은 (. 예를 들어, 마르크스 등 성장 콘 (18)의 태그 EB1 역학도 활용 정량 분석) 소프트웨어의 유사한 형태의 디자인이 신고되었습니다. 그러나,이 소프트웨어는 자유롭게 오픈 소스를 설계 전문 Danuser 연구소의 웹 사이트에서 다운로드 턴키 세포 생물학적 사회에 유용한 소프트웨어를 한, 접근의 용이성에서 고유 나타납니다. MATLAB에 대한 액세스가 요구되는 반면, 하나는 소프트웨어를 이용하기 위해이 컴퓨터 프로그램 숙지 할 필요가 없다. 그러나, 사용의 용이성을 위해 해결해야 할 몇 가지 포인트가있다.

우선, 강도를 사용할 때 발생하는 일반적인 문제 중 하나가처음 tware 및 컴퓨터 프로그램은 파일 경로에 관한 것이...

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공개 사항

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저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

감사의 글

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plusTipTracker 소프트웨어를 만들고 소프트웨어 사용에 관해 유익한 토론을 해주신 Gaudenz Danuser 박사와 그의 연구실 구성원들, 특히 Maria Bagonis와 Sebastien Besson에게 감사드립니다. 특히 비디오 제작 및 편집에 도움과 지원을 아끼지 않은 Boston College Media Center에 감사드립니다. 또한 유용한 토론과 건설적인 비판을 해준 로워리 랩(Lowery Lab)의 구성원들에게, 그리고 원고를 교정해 준 아비게일 앙투안(Abigail Antoine)에게도 감사를 표한다. 이 연구는 LAL에 NIH R00 MH095768 상을 수여하여 자금을 지원받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
plusTipTracker 소프트웨어Danuser Labhttp://lccb.hms.harvard.edu/software.html이 소프트웨어는 향후 다른 웹 사이트에서 호스팅 될 수 있습니다.  목록에 있는 사이트가 없는 경우 웹 검색 엔진에서 "Danuser Lab Software"를 검색하여 사이트를 찾으십시오.
MATLAB 소프트웨어Mathworkshttp://www.mathworks.com/products/matlab/

참고문헌

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