펩타이드 어레이는 단백질 라이신 메틸전이효소(PKMT)의 기질 특이성을 분석하고 PKMT의 기질 스펙트럼을 정의하여 생물학적 역할을 이해하는 데 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 펩타이드 어레이를 합성하고, PKMT로 메틸화하고, 결과를 분석하는 방법을 설명합니다.
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이 논문에서
요약
SPOT 방법으로 합성된
초록
라이신 메틸화는 신흥 포스트 번역 수정하고이 세포 개발 및 많은 질병에서 중요한 역할을 담당 곳에는 여러 히스톤과 비 히스톤 단백질에 발견되었습니다. 약 5,000 라이신 메틸화 단백질 라이신 methyltransferases의 몇 수십 설정되어 다른 단백질에 확인되었다. 이제이 하나 또는 두 개의 기판이 효소의 여러 가지에 대해 확인 된 그러나까지, 각 PKMT 여러 단백질의 메틸하는 것이 좋습니다. 이 문제에 접근하기 위해, 우리가 도입 펩타이드 어레이 기반의 기질 특이성은 PKMTs 분석. 펩타이드 배열은 서로 다른 시퀀스가 여러 기판의 메틸화가 하나의 어레이 테스트 할 수 있기 때문에 PKMTs의 특이성을 특성화 할 수있는 강력한 도구입니다. 우리는 Intavis SPOT 신디사이저를 사용하여 셀룰로오스 막에 펩타이드 배열을 합성 및 다양한 PKMTs의 특이성을 분석 하였다. 이들 효소의 여러 위해, 결과에 기초하여, 신규 Substrates를 식별 할 수 있습니다. 예를 들어, 펩타이드 어레이를 사용함으로써 NSD1 위해, 우리는 H4의 K44 대신보고를 H4K20의 메틸과 더불어 H1.5K168은 이미 공지 H3K36 위에 매우 바람직한 기판 인 것으로 나타났다. 따라서, 펩타이드 배열은 생화학 PKMTs의 특성을 할 수있는 강력한 도구입니다.
서론
지난 20 년 동안, 여러 보고서는 세포 개발 및 암 등 여러 질병,하지만 최근에 단백질 리신 메틸화는 또 다른 중요한 PTM로 떠오르고있다에서 번역 후 변형 (PTM)의 중요성을 보여 주었다. 초기 히스톤 메틸화 라이신 필수적인 염색질 마크 것으로 확인되었지만, 이후의 작업은 여러 비 - 히스톤 단백질 1-4 리신 메틸화 하였다. 리신 잔기의 ε - 아미노기에 S-L 아데노 실 메티오닌의 메틸 기의 순차적 인 전송은 인간 게놈에서 60 개 이상의 단백질을 포함 리신 단백질 Methyltransferases (PKMTs)라는 효소 패밀리에 의하여 촉매된다. PKMTs 처음 특정 라이신 잔기 메틸화 나중에보고들은 또한 비 - 히스톤 단백질 5 메틸화 수 있다고 입증 히스톤 변형 효소로 발견되었다. 지금까지 약 5,000 라이신 메틸화 다른 단백질 6에 확인 된 하지만, 이러한 수정에 대한 책임이있는 효소는 종종 식별되지 않습니다. 그 이유 중 하나는 가장 PKMTs의 특이성이 광범위하게 연구되어 있지 않은 점이다. 따라서, 반복적으로 PKMTs 신규 기질이 발견되어 발생한다. PKMTs의 기질 특이성의 상세한 지식의 결여는 그들의 생물학적 기능 및 역할에 대한 이해를 방해한다. 상세 PKMT의 특이성을 연구하는 하나 또는 ....
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프로토콜
펩타이드 배열 1. 준비
- 펩타이드 시퀀스의 프로그래밍
- MultiPep 정찰기 소프트웨어를 사용하여 합성 펩티드 서열을 디자인. 단일 문자 코드의 펩티드 서열을 입력합니다.
펩타이드 1 : TARKSTGGKA - 정의 된 기판의 인식에 필요한 중요한 아미노산을 화면에 특정 명령 (.replace, A)와 알라닌 또는 아르기닌 도보 라이브러리를 생성합니다. 다음 예에서 예를 들어 첫 번째 라인은 야생형 서열이고 두번째 행에서 각 펩타이드의 아미노산이 알라닌으로 순차적으로 변경된다.
, 교체
TARKSTG
-ARKSTG
T- -RKSTG
맞대기 -KSTG
하는 표적 -STG
TARK- -TG
TARKS- -G
TARKST- - 유사한 명령 (.replace의 R을 사용합니다.모든 천연 가능한 아미노산 잔기 (결국 시스테인, 메티오닌 및 트립토판을 생략 1.1.2에 기재된 바와 같이 이들 잔기 산화하는 경향이 때로는 낮은 합성 수율 때문에), N 등)를 교체 합의 판정 펩타이드 어레이를 합성 효소에 대한 기질 서열 모티브.
참고 :도 4a에 도시 된 바....
- MultiPep 정찰기 소프트웨어를 사용하여 합성 펩티드 서열을 디자인. 단일 문자 코드의 펩티드 서열을 입력합니다.
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결과
이 방법에 의해 펩티드 5,16-19 어레이 성공적 생화학 PKMTs의 특이성을 특성화하는 데 사용하고, PKMT 여러 신규 한 히스톤 및 비 히스톤 기질의 동정을 행 하였다. PKMT (또는 효소)의 올바른 기판 스펙트럼을 정의하는 분자 메커니즘과 세포 기능의 이해를 향한 중요한 단계입니다.
펩티드 SPOT 어레이 메틸화 방법의 적용 예로서, 우리는 (19)의 NSD1 PKMT 특이성 분석 결과를 설명한다. 우리의 작업에 이전,이 효소는 K36에서 히스톤 H3와 히스톤 H4 K20에서뿐만 아니라 K218과 K221.도에서 NF-kB의 가족 전사 인자 P65 포함 메틸 레이트 여러 기판에 설명했다. 도 4a와 NSD1 펩타이드 어레이의 메틸화 반응의 예를 도시한다. 이 실험 H3에 기초하여 큰 펩티드 배열 (31-49) 서열은 그 모든 가능한 합성 하였다 포함원래 시퀀스의 단일.......
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토론
여기에 설명 된대로 합성 SPOT 단백질 - 단백질 상호 작용 부위를 맵핑하고 수정 펩티드 효소 기질 인식을 조사 할 수있는 강력한 방법이다. SPOT 방법에 의해 합성 된 펩타이드가이 각 인스턴스에서 확인하기 어려운 90 % 이상의 순도 21 것으로보고되었지만 때문에 SPOT 합성은 아직 특정 단점을 갖는다. 따라서, 결과는 예를 이용한 단백질 또는 도메인에 대한 표준 방법에 의해 합성, 정제 된 펩타이드와 다른 방법에 의해 재생되어야한다. 또한, SPOT 어레이들의 다른 중요한 단점은 재사용 할 수없는 대부분의 시간은 하나의 어레이 여러 세이를 수행하기 때문이다.
낮은 안정성 아미노산 합성의 효율을 높이기 위해 보호 된 아르기닌 마찬가지로 매 5 사이클들이 신선한 것이 중요하다. 효소 반응 또는 단백질 결합 연구에서 종종 펩티드 스폿의 주변부는 Mo가 있는지 관찰센터 ( "링 자리 효과")보다 신호 강도 재. 이 효과는 스폿의 중앙 부.......
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공개 사항
이해 상충이 선언되지 않았습니다.
감사의 글
이 작업은 DFG 보조금 JE 252/7의 지원을 받았습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 에탄올 abs 그라디언트 등급 HPLC | Honeywell | 10299901 | 가연성 |
| N, N-Dimethylformamide 펩타이드 합성 | Biosolve | 4193302 | 가연성, 독성 |
| Piperidine ≥ 펩타이드 합성을 위한 99% | Roth | A122.1 | 가연성, 독성, 부식성 |
| Oxyma Pure (에틸(하이드록시이미노)시아노아세테이트) | Novabiochem | 8510860100 | |
| N,N' -Diisopropylcarbodiimide purum ≥ 98 % GC | Fluka | 38370 | 가연성, 독성, 부식성 |
| 무수물 | Roth | CP28.1 | 가연성, 독성, 부식성 |
| 트리 이소 프로필 실란 99 % | Aldrich | 233781 | 가연성, 독성 |
| 디클로로 메탄 ≥ 99.9% | Roth | P089.1 | 발암성 |
| N-메틸-2-피롤리돈 | Roth | 4306.2 | 독성 |
| 유도체화된 셀룰로오스 멤브레인 | Intavis AG Kö ln | 32.1 | |
| Trifluoroacetic acid | Roth | P088.2 | 독성, 부식성 |
| Bromphenolblue | AppliChem | A3640.0010 | |
| 암모늄 탄산수소 | Roth | T871.2 | 독성 |
| 나트륨 도데 실 설페이트 펠렛 | Roth | CN30.3 | 독성, 가연성 |
| MultiPep 합성제 | Intavis AG K ö ln | n.a.HyperfilmTM | |
| 고성능 필름 | GE 헬스케어 | 28906837 | |
| Phoretix 소프트웨어 | TotalLab | n.a. |
참고문헌
- Margueron, R., Reinberg, D. Chromatin structure and the inheritance of epigenetic information. Nat. Rev. Genet. 11, 285-296 (2010).
- Dawson, M. A., Kouzarides, T. Cancer epigenetics: from mechanism to therapy. Cell. 150, 12-27 (2012).
- Helin, K., Dhanak, D.
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재인쇄 및 허가
