염증성 탈수초성 질환의 피질 병변에서 탈수초화 및 신경 세포 사멸의 메커니즘을 다루기 위해 다양한 동물 모델이 사용됩니다. 여기에서는 뇌 절편에 희소돌기아교세포 특이적 CD8+ T 세포를 사용하여 희소돌기아교세포 및 신경세포 사멸을 초래하는 생체 외 접근법을 설명합니다. 모델의 잠재적인 응용 프로그램 및 제한 사항에 대해 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
뉴런과 축삭돌기의 파괴를 동반한 희소돌기아교세포의 사멸은 다발성 경화증(MS)과 같은 염증성 탈수초 질환의 피질 및 피질하 회백질 병변에서 전형적인 조직병리학적 소견입니다. 이러한 질환에서는 주로 미엘린 및 희소돌기아교세포 관련 항원에 대한 추정 특이성을 가진 CD8+ T 세포가 발견되므로 회백질 병변의 신경 세포 사멸은 이러한 세포의 부수적 효과일 수 있습니다. 언급된 병태생리학적 과정의 기저에 깔린 메커니즘을 연구하기 위해 다양한 유형의 동물 모델이 확립되었습니다. 그러나, 그것들이 다발성경화증의 일부 측면을 모방한다 하더라도, "담보적" 신경세포 사멸의 정확한 메커니즘과 시간 경과를 해부하는 것은 불가능합니다. 이 과정을 다루기 위해 여기에서는 희소돌기아교세포가 지시하는 CD8+ T 세포 공격 후 신경 손상의 메커니즘과 시간 반응을 연구하는 프로토콜을 보여줍니다. 미엘린 수초(myelin sheath)와 희소돌기아교세포(oligodendrocyte)만을 표적으로 하기 위해, 시험관 내 활성화 희소돌기아교세포 특이적 CD8+ T 세포를 급성으로 분리된 뇌 절편으로 전달합니다. 정의된 잠복기 후, 미엘린과 신경 손상은 다른 관심 영역에서 분석될 수 있습니다. 이 모델의 잠재적인 응용 프로그램 및 제한 사항에 대해 설명합니다.
서론
뉴런과 축삭의 소실을 동반한 희소돌기아교세포의 사멸과 수초의 파괴는 다발성 경화증(MS)을 앓고 있는 개인의 회백질 병변에서 전형적인 병리학적 소견입니다1,2. 피질 병변은 지금까지 세 가지 하위 유형 2으로 나눌 수 있습니다: 피질하 병변, 피질 내 병변 및 백혈 피질 병변. 백질 플라크와 비교했을 때, 침투는 CD8+ T-세포가 우세한 것이 특징이며, 이는 회백질 염증에서 결정적인 역할을 할 수 있음을 시사합니다3. 또한, 혈액, 뇌척수액(CSF) 및 염증성 병변 내 올리고클론 확장은 CD8+ T 세포 자체에서 발견될 수 있습니다4-6.
이에 따라 CD8+ T-세포는 다른 미엘린 단백질에 특이적일 수 있다고 가정합니다7,8. 실제로, CD8+ T-세포는 MHC I 발현11을 보이는 희소돌기아교세포와 미엘린초(myelin sheath)9,10 근처에서 발견되며, 따라서 수초(myelin sheath)의 손실에 책임이 있을 수 있습니다. 이 과정은 종종 중추신경계(CNS) 회백질1,2 내의 광범위한 '부수적' 신경 및 축삭 손상과 함께 볼 수 있습니다. 사실, 희소돌기아교세포와 뉴런의 직간접적인 사멸은 두 가지 다른 메커니즘을 통해 CD8+ T 세포에 의해 유도됩니다: (i) 퍼포린과 그랜자임의 방출에 따른 세포독성 과립의 형성으로 인한 세포막 팽창 및 파열, 그리고 (ii) Fas 수용체에 대한 결찰 또는 FasL의 표면노출 8,12,13.
언급된 과정의 기본 메커니즘을 연구하기 위해 다양한 유형의 동물 모델이 확립되었습니다. 이와 관련하여, 희소돌기아교세포(oligodendrocyte) 또는 성상세포(astrocyte)와 같은 중추신경계(CNS) 신경교세포에서 유도 발현되는 자가항원에 특이적인 프라이밍된 CD8+ T-세포는 회백질에서 ''담보적'' 뉴런 및 축삭 사멸을 분석하기 위해 채택적으로 전달될 수 있습니다14,15. 이러한 생체 내 실험을 수행하는 것은 다발성경화증의 일부 병태생리학적 측면을 모방하는 데 큰 도움이 되지만, 이 접근법은 축삭 손상 및 신경 세포 사멸의 기본 메커니즘과 동역학을 해결하는 데 적합하지 않습니다.
이러한 제한을 극복하기 위해 희소성 수지 세포가 지시하는 CD8+ T 세포 공격 후 신경 세포 사멸의 메커니즘과 시간 경과를 연구하기 위한 생체 외 접근법이 확립되었습니다. 희소돌기아교세포와 그에 따른 미엘린 수초 생산만이 면역 세포에 의해 표적화되어야 하기 때문에, MHC class-I-restricted, ovalbumin (OVA)-반응성 OT-I Tcell이 사용된다16. 이 세포는 이후에 희소돌기아교세포(ODC-OVA 마우스)에서 OVA를 선택적으로 발현하는 마우스에서 얻은 뇌 절편으로 전달됩니다(17).
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프로토콜
생쥐를 사용하는 모든 실험은 각 기관 동물 관리 및 사용위원회의 지침에 따라 수행되어야한다.
마우스 실험 1. 일반 댓글
- 무균 상태에서 마우스를 유지하고 그들에게 음식과 물을 임의로에 액세스 할 수 있습니다.
참고 : 면역 학적 패턴은 나이와 성별에 따라 달라질 수 있기 때문에 실험 그룹의 나이와 성별 일치 마우스를 사용하는 것이 중요합니다.
(2)의 제조 및 활성화 OVA 특이 CD8 + T 세포 (OT-I)
- 뇌 조각을 준비하기 전에 오일 후술 OT-I T 세포의 자극을 수행한다.
주 : 5 × 5 활성화 효과기 CD8 + OT-I T 세포 (CD8 + T 세포 MHC-I 분자의 컨텍스트에서 유일한 OVA 257-264 펩티드를 인식하는 트랜스 제닉 마우스)를 슬라이스마다 필요한 농도 5 × 10 5 실험을 선택했다세포가 동시에 슬라이스로 이주 시동 한번 좋은 세포 - 세포 상호 작용을 선호하는 최적 하나로 우방 세포의 양이 하나의 셀 (8, 18)를 계산하는 허용 과잉 반응을 유도하기 위해 너무 높지 않다. - OT-I T 세포를 배양 매체를 준비합니다. 5 % 소 태아 혈청 (FCS), 10 mM의 HEPES, 2 mM L- 글루타민 50 μM 2- 머 캅토 에탄올, 1 % 비 필수 아미노산 및 25 ㎍ / ml의 겐타 마이신을 500 ㎖의 DMEM을 보완. 사용할 때까지 4 ° C에서 매체를 저장합니다.
- 참조 (16)에 따라 OT-I 형질 전환 마우스의 비장을 제거합니다. 준비된 매체로 전송합니다.
- 5 분, 4 ° C 300 XG에 70 μm의 여과기 및 원심 분리기 서스펜션을 통해 비장를 매쉬업하여 단일 세포 현탁액을 생성합니다.
- 적혈구를 용해시키기 위해 5 분 동안 5 ㎖ 암모늄, 염화 칼륨 (ACK) 완충액 (150 mM의 CL NH 4, 10 mM의 KHCO 3, 0.1 mM의 EDTA, pH를 7.3)와 세포 현탁액을 배양한다.
- incubati 중지다시 10 ml의 배지를 원심 분리기에 함께 전술 한 바와 같이.
- 매체에 세포 현탁액을 희석 수를 계산합니다. 판 3 × 10 7 세포의 밀도로 세포 / 웰에서 12 웰 플레이트 프라임 그들을 배양하여 OVA 257 - 264 (SIINFEKL 1 ㎚) 및 인터루킨 -2 (IL-2) (500 IU / ml)에 대한 오일.
- 사일 후, 500 IU의 농도 / ㎖를 다시 IL-2를 추가한다.
- 자극에이어서, 제조업 자의 지시에 따라 음성 선별 계 마우스 CD8 + T 세포 단리 키트를 사용하여 세포 현탁액으로부터 OT-I-T 세포를 정제. 정제는 CD4, CD11b를, 중 CD11c, CD19, CD45R (B220), CD49b (DX5), CD105, MHC 클래스 II, 테르-119 및 TCRγ에 대한 항체의 칵테일을 사용하여 모든 비 CD8가 + 세포의 고갈을 기반으로 / δ 후 정제 된 CD8 + T 세포의 용출 자석 열을 사용하여 폐기되는.
참고 :이 procedu에서 중요한 단계재를 제조하고 의해 표시된다 : 그것은 덩어리의 존재가 용출 단계 동안 열을 차단할 수 있기 때문에, 반응은 단 하나의 셀을 포함하는 것이 중요하다; Byotin 칵테일을 추가하기 전에 셀의 계산은 시료의 청정도에 중요하고 절차는 비특이적 항체 바인딩을 최소화하기 위해 얼음을 수행하여야한다.
OT-I T 세포 급성 뇌 조각 및 공동 문화의 3. 준비
- 급성 뇌의 제조에 앞서 19, 200 mM의 수크로오스로부터 20㎜ PIPES, 2.5mM의 KCL, 1.25 mM의의 NaH 2 PO 4, 10mM의 황산, 0.5 CaCl2를 10 mM의 덱 스트로스를 사용 placedine 차가운 생리 식염수 용액을 조제을 슬라이스 화 인공 뇌척수액 (ACSF), 125 mM의 염화나트륨, 2.5의 KCl을 사용하여 1.25의 NaH 2 PO 4, 24 mM의 NaHCO3을, 2 mM의 황산, 10 mM의 포도당 2 mM의 CaCl2를. 저기서으로 7.35에 각 솔루션의 산도를 조정g의 NaOH. ACSF의 pH를 조정하기 전에, 용액은 95 % O 2 및 5 % CO 2의 혼합물로 버블 링되어야한다.
- 솔루션을 사전 냉각.
- 8 마취 - (10 주 된 쥐를 예를 들면, C57BL 5.0 %의 이소 플루 란, 5.0 %의 할로 탄 또는 대기 IP를 통해 100 ㎎ / kg 케타민과 10 mg / kg 체중의 자일 라진 (xylazine)을 주사를 사용하여 제어 또는 흡입과 형질 전환 ODC-OVA 마우스 (17) / 6 마취. 마취의 수준을 평가하고, 한 번에 목을 벨 수있는 발가락 핀치를 사용하고 제도적 동물 보호에 따라 쥐를 안락사와 안락사에 대한위원회의 기준을 사용합니다.
- 복부 위치에 마우스를 넣습니다. 소독 및 sagittally 두피를 잘라. , sagitally 두개골 뼈를 열고 국자의 도움으로 신속하게 뇌를 제거하고 접착제를 사용하여에 vibratome의 판에 끼 웁니다.
- 준비된 placedine 얼음처럼 차가운 생리 식염수와 함께 접시를 채 웁니다.
- 에 vibratome 300 μm의 관상 조각을 잘라.
참고 :이 절차는 알고있다n은 적어도 8 시간의 19 ~ 21 시간 내에 세포의 기능적 연구에 적합한 실행 가능한 그대로 티슈 시편을 얻었다. 사실, 이미 6 시간 후에 시작이 기간 후에, 준비는 품질 저하, 활동 전위 생성 및 전파 같은 기본적인 기능적인 특성, 즉 변화를 보여준다. - 절편 한 후, ACSF 가득 12 웰 플레이트의 각 웰에 즉시 한 조각을 전송합니다.
- 조각 당 신중 5 × 10 5 OT-I T 세포를 추가합니다.
- 인큐베이터에서 최대 8 시간 (37 ° C, 5 % CO 2)에 대한 슬라이스를 품어.
- 잠복기, 수확 조각과 후의 OCT 화합물 조직-TEK를 사용하여 그것들을 포함하고 액체 질소에서 그들을 동결. 평가, 예를 들면에 더 조직 학적 연구를위한 -20 ° C에서 신경 세포의 구조 (예를 들어, 사용 방지 MAPII 또는 방지 synaptophysin에 항체) 또는 세포 사멸을 (를 저장 예를 들어, 안티 카스파-3 항체 및 안티 NeuN 안티를 사용하여시체) 표준 절차에 따라.
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결과
희소 돌기 아교 세포 지시 CD8 + T 세포와 뇌 조각의 배양 후, 희소 돌기 아교 세포뿐만 아니라 신경 세포 사멸 (도 2a 및도 1C, 각각을) 받다. 아폽토시스 학적 징후 (예, 카스파 제 -3, Tunel에)은 초기 배양은 3 시간 후에 검출 될 수있다. 부화 기간은 준비하고 재현 가능한 결과의 좋은 품질을 보장하기 위해 더 이상 8 시간 이하 여야한다. 사멸 세포는 모든 유수 지역에서 우세와 조각을 통해 찾을 수 있습니다. 구조적 무결성 및 세포 사멸 신경 세포의 조각의 대표적인 조직 학적 염색은 그림 1A-C에 도시되어있다.
결과 파라미터를 평가하기위한 관심의 인큐베이션 동안 상이한 시간 점들이있다. 본 연구실에서 수행되는 전형적인 시간 경과 후에는, 즉, 세포 - 세포 상호 작용이 시간 0에서, 다음 3, 4, 6 시간 (최대 상호 작용이 관찰) 분석 파라미터들을...
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토론
다양한 동물 모델은 MS와 같은 염증성 탈수 초성 질환의 병리학 적 특징을 해결하기 위해 지난 수십 년에 걸쳐 설명되었다. 비보 마우스 및 래트 모델은 광범위 질환의 병태 생리 학적 특징을 모방하는 데 사용된다, 즉, 탈수 초화 및 재유 수화 처리의 결과 분석 염증 및 신경 퇴행의 섞일 에피소드. 그럼에도 불구하고, 단지 생체 방법은 정확한 기본 메커니즘을 해부 할 수 있습니다.
급성 뇌 조각의 제조는 널리 배포 모델이고 신뢰성있는 반복 가능한 것으로 간주 될 수있다. 셀 상호 - 분리 및 희소 돌기 아교 세포 - 특이 적 면역 세포의 배양과 조합에서, 특히기구와 면역 세포와 공격 세포의 동력학 연구의 관점에서, 특정 실험 문제를 해결하는데 사용될 수있다. 기타 생체 외 접근법은 널리 공지되어있다22 사용하지만 즉 OT-I T 세포에 노출 노출 여부 WT의 Caspase3 면역 반응을 확인, 다른 "...
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공개 사항
저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.
감사의 글
이 연구는 Interdisciplinary Center for Clinical Research (IZKF) Münster (SEED 03/12, SB), Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB TR128, TP B6 to S.G.M. ME3283/2-1 to S.G.M.) 및 Innovative Medizinische Forschung, Münster (I-BI111316, SB 및 SGM)의 지원을 받았습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 12-웰 플레이트 | Corning | 3513 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 31350-010 | |
| 2-Methylbutan | Roth | 3927.1 | |
| 70 µ m 여과기 | Falcon | 352350 | |
| CaCl2 | Merck | 1.02382.0500 | 염화칼슘 |
| CD8+-isolation kit | Miltenyi Biotech | 130-090-859 | |
| D(+)-glucose | Merck | 1.08337.1000 | |
| DMEM | Gibco | 31966-021 | 37 ° C 사용 전 수조 |
| EDTA | Sigma | E5134 | |
| FCS | PAA Laboratories | A15-151 | 태아 송아 혈청 |
| Gentamicin | Gibco | 15750-060 | |
| HEPES 1 M | Gibco | 15630-050 | |
| IL-2 | Peprotech | 212-12 | |
| Isofluran | Abbott | 05260-05 | |
| KCl | Merck | 1.04933.0500 | 염화칼륨 |
| KHCO3 | Sigma | P9144 | 탄산수소칼 |
| L-글루타민 | Gibco | 35050-038 | |
| MgSO4 | Merck | 1.05886.0500 | 황산마그네슘 |
| NaCl | Sigma | 31434 | 염화나트륨 |
| NaH < > 2 < / sub> PO 4 < / sub> * H 2 < / sub>O | Merck | 1.06346.0500 | 인산 수소 나트륨 |
| NaHCO 3< / sub> | Merck | 1.06329.0500 | 탄산 수소 나트륨 |
| NaOH | Merck | 1.09137.1000 | 수산화 나트륨 |
| NH4< / sub>Cl | 시그마 | 213330 | 염화 암모늄 |
| 비 필수 아미노산 | Gibco | 11140-050 | |
| OVA (257-264) | Genscript | RP10611 | ovalbumin |
| PIPES | 시그마 | P6757 | |
| 설탕 | 머크 | 1.07687.1000 | |
| Tissue-tek OCT | Sakura | 4583 |
참고문헌
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