염증성 탈수초성 질환의 피질 병변에서 탈수초화 및 신경 세포 사멸의 메커니즘을 다루기 위해 다양한 동물 모델이 사용됩니다. 여기에서는 뇌 절편에 희소돌기아교세포 특이적 CD8+ T 세포를 사용하여 희소돌기아교세포 및 신경세포 사멸을 초래하는 생체 외 접근법을 설명합니다. 모델의 잠재적인 응용 프로그램 및 제한 사항에 대해 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
뉴런과 축삭돌기의 파괴를 동반한 희소돌기아교세포의 사멸은 다발성 경화증(MS)과 같은 염증성 탈수초 질환의 피질 및 피질하 회백질 병변에서 전형적인 조직병리학적 소견입니다. 이러한 질환에서는 주로 미엘린 및 희소돌기아교세포 관련 항원에 대한 추정 특이성을 가진 CD8+ T 세포가 발견되므로 회백질 병변의 신경 세포 사멸은 이러한 세포의 부수적 효과일 수 있습니다. 언급된 병태생리학적 과정의 기저에 깔린 메커니즘을 연구하기 위해 다양한 유형의 동물 모델이 확립되었습니다. 그러나, 그것들이 다발성경화증의 일부 측면을 모방한다 하더라도, "담보적" 신경세포 사멸의 정확한 메커니즘과 시간 경과를 해부하는 것은 불가능합니다. 이 과정을 다루기 위해 여기에서는 희소돌기아교세포가 지시하는 CD8+ T 세포 공격 후 신경 손상의 메커니즘과 시간 반응을 연구하는 프로토콜을 보여줍니다. 미엘린 수초(myelin sheath)와 희소돌기아교세포(oligodendrocyte)만을 표적으로 하기 위해, 시험관 내 활성화 희소돌기아교세포 특이적 CD8+ T 세포를 급성으로 분리된 뇌 절편으로 전달합니다. 정의된 잠복기 후, 미엘린과 신경 손상은 다른 관심 영역에서 분석될 수 있습니다. 이 모델의 잠재적인 응용 프로그램 및 제한 사항에 대해 설명합니다.
서론
뉴런과 축삭의 소실을 동반한 희소돌기아교세포의 사멸과 수초의 파괴는 다발성 경화증(MS)을 앓고 있는 개인의 회백질 병변에서 전형적인 병리학적 소견입니다1,2. 피질 병변은 지금까지 세 가지 하위 유형 2으로 나눌 수 있습니다: 피질하 병변, 피질 내 병변 및 백혈 피질 병변. 백질 플라크와 비교했을 때, 침투는 CD8+ T-세포가 우세한 것이 특징이며, 이는 회백질 염증에서 결정적인 역할을 할 수 있음을 시사합니다3. 또한, 혈액, 뇌척수액(CSF) 및 염증성 병변 내 올리고클론 확장은 CD8+ T 세포 자체에서 발견될 수 있습니다4-6.
이에 따라 CD8+ T-세포는 다른 미엘린 단백질에 특이적일 수 있다고 가정합니다7,8. 실제로, CD8+ T-세포는 MHC I 발현11을 보이는 희소돌기아교세포와 미엘린초(myelin sheath)9,10 근처에서 발견되며, 따라서 수초(myelin sheath)의 손실에 책임이 있을 수 있습니다. 이 과정은 종종 중추신경계(CNS) 회백질1,2 내의 광범위한 '부수적'....
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프로토콜
생쥐를 사용하는 모든 실험은 각 기관 동물 관리 및 사용위원회의 지침에 따라 수행되어야한다.
마우스 실험 1. 일반 댓글
- 무균 상태에서 마우스를 유지하고 그들에게 음식과 물을 임의로에 액세스 할 수 있습니다.
참고 : 면역 학적 패턴은 나이와 성별에 따라 달라질 수 있기 때문에 실험 그룹의 나이와 성별 일치 마우스를 사용하는 것이 중요합니다.
(2)의 제조 및 활성화 OVA 특이 CD8 + T 세포 (OT-I)
- 뇌 조각을 준비하기 전에 오일 후술 OT-I T 세포의 자극을 수행한다.
주 : 5 × 5 활성화 효과기 CD8 + OT-I T 세포 (CD8 + T 세포 MHC-I 분자의 컨텍스트에서 유일한 OVA 257-264 펩티드를 인식하는 트랜스 제닉 마우스)를 슬라이스마다 필요한 농도 5 × 10 5 실험을 선택했다세포가 동시에 슬라이스로 이주 시동 한번 좋은 세포 - 세포 상호 작용을 선호하는 최적 하나로 우방 세포의 양이 하나의 셀 (8, 18)를 계산하는 허용 과잉 반응을....
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결과
희소 돌기 아교 세포 지시 CD8 + T 세포와 뇌 조각의 배양 후, 희소 돌기 아교 세포뿐만 아니라 신경 세포 사멸 (도 2a 및도 1C, 각각을) 받다. 아폽토시스 학적 징후 (예, 카스파 제 -3, Tunel에)은 초기 배양은 3 시간 후에 검출 될 수있다. 부화 기간은 준비하고 재현 가능한 결과의 좋은 품질을 보장하기 위해 더 이상 8 시간 이하 여야한다. 사멸 세포는 모든 유수 지역에서 우세와 조각을 통해 찾을 수 있습니다. 구조적 무결성 및 세포 사멸 신경 세포의 조각의 대표적인 조직 학적 염색은 그림 1A-C에 도시되어있다.
결과 파라미터를 평가하기위한 관심의 인큐베이션 동안 상이한 시간 점들이있다. 본 연구실에서 수행되는 전형적인 시간 경과 후에는, 즉, 세포 - 세포 상호 작용이 시간 0에서, 다음 3, 4, 6 시간 (최대 상호 작용이 관찰) 분석 파라미터들을.......
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토론
다양한 동물 모델은 MS와 같은 염증성 탈수 초성 질환의 병리학 적 특징을 해결하기 위해 지난 수십 년에 걸쳐 설명되었다. 비보 마우스 및 래트 모델은 광범위 질환의 병태 생리 학적 특징을 모방하는 데 사용된다, 즉, 탈수 초화 및 재유 수화 처리의 결과 분석 염증 및 신경 퇴행의 섞일 에피소드. 그럼에도 불구하고, 단지 생체 방법은 정확한 기본 메커니즘을 해부 할 수 있습니다.
급성 뇌 조각의 제조는 널리 배포 모델이고 신뢰성있는 반복 가능한 것으로 간주 될 수있다. 셀 상호 - 분리 및 희소 돌기 아교 세포 - 특이 적 면역 세포의 배양과 조합에서, 특히기구와 면역 세포와 공격 세포의 동력학 연구의 관점에서, 특정 실험 문제를 해결하는데 사용될 수있다. 기타 생체 외 접근법은 널리 공지되어있다22 사용하지만 즉 OT-I T 세포에 노출 노출 여부 WT의 Caspase3 면역 반응을 확인, 다른 ".......
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공개 사항
저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.
감사의 글
이 연구는 Interdisciplinary Center for Clinical Research (IZKF) Münster (SEED 03/12, SB), Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB TR128, TP B6 to S.G.M. ME3283/2-1 to S.G.M.) 및 Innovative Medizinische Forschung, Münster (I-BI111316, SB 및 SGM)의 지원을 받았습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 12-웰 플레이트 | Corning | 3513 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 31350-010 | |
| 2-Methylbutan | Roth | 3927.1 | |
| 70 µ m 여과기 | Falcon | 352350 | |
| CaCl2 | Merck | 1.02382.0500 | 염화칼슘 |
| CD8+-isolation kit | Miltenyi Biotech | 130-090-859 | |
| D(+)-glucose | Merck | 1.08337.1000 | |
| DMEM | Gibco | 31966-021 | 37 ° C 사용 전 수조 |
| EDTA | Sigma | E5134 | |
| FCS | PAA Laboratories | A15-151 | 태아 송아 혈청 |
| Gentamicin | Gibco | 15750-060 | |
| HEPES 1 M | Gibco | 15630-050 | |
| IL-2 | Peprotech | 212-12 | |
| Isofluran | Abbott | 05260-05 | |
| KCl | Merck | 1.04933.0500 | 염화칼륨 |
| KHCO3 | Sigma | P9144 | 탄산수소칼 |
| L-글루타민 | Gibco | 35050-038 | |
| MgSO4 | Merck | 1.05886.0500 | 황산마그네슘 |
| NaCl | Sigma | 31434 | 염화나트륨 |
| NaH < > 2 < / sub> PO 4 < / sub> * H 2 < / sub>O | Merck | 1.06346.0500 | 인산 수소 나트륨 |
| NaHCO 3< / sub> | Merck | 1.06329.0500 | 탄산 수소 나트륨 |
| NaOH | Merck | 1.09137.1000 | 수산화 나트륨 |
| NH4< / sub>Cl | 시그마 | 213330 | 염화 암모늄 |
| 비 필수 아미노산 | Gibco | 11140-050 | |
| OVA (257-264) | Genscript | RP10611 | ovalbumin |
| PIPES | 시그마 | P6757 | |
| 설탕 | 머크 | 1.07687.1000 | |
| Tissue-tek OCT | Sakura | 4583 |
참고문헌
- Moll, N. M., et al. Cortical demyelination in PML and MS: Similarities and differences. Neurology. 70 (5), 336-343 (2008).
- Peterson, J. W., Bo, L., Mork, S., Chang, A., Trapp, B. D. Transected neurites, apoptotic neurons, and reduced infl....
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재인쇄 및 허가
