방법 논문

마우스 지느러미 열 압박 손상에 마이크로 글 리아와 대 식세포와 축삭의 상호 작용의 생체 내에 이미징

DOI:

10.3791/52228

⸱

2014년 11월 23일

 ,  ,  , 
1Department of Neurosciences, Case Western Reserve University, 2Department of Biomedical Engineering, Case Western Reserve University, 3Department of Pediatrics, Case Western Reserve University

이 논문에서

요약

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Two-photon intravital imaging은 등쪽 기둥 외상성 척수 파쇄 손상이 있는 골수 키메라 동물의 원래 조직 환경에서 척수의 다양한 세포 유형 간의 상호 작용을 조사하는 데 사용할 수 있습니다.

초록

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외상성 척수 손상은 혈액 유래 대식세포와 중추신경계(CNS)에 상주하는 미세아교세포와 관련된 염증 반응을 일으킵니다. 생체 내 이광자 현미경 검사는 살아있는 동물의 척수 병변에서 대식세포와 미세아교세포를 연구할 수 있습니다. 이것은 등기둥에 외상성 부상을 입은 성인 동물에서 수행할 수 있습니다. 여기에서는 대식세포 또는 미세아교세포만 유전적으로 암호화된 녹색 형광 단백질로 표지된 동물을 얻기 위해 방사선 조사 골수 키메라를 사용하여 중추신경계에서 대식세포와 미세아교세포를 구별하는 방법을 설명합니다. 또한 척수의 등주를 분쇄하여 후판 절제술을 통해 동물에서 쉽게 시각화할 수 있는 간단하고 쉽게 접근할 수 있는 직사각형 병변을 생성하는 부상 모델을 설명합니다. 또한, 부상 후 처음 며칠에서 몇 주 동안 세포 상호 작용 연구를 위해 해부학적 손상 부위에서 동물을 순차적으로 이미지화하는 절차를 간략하게 설명합니다.

서론

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중추 신경계 (CNS)의 질병이나 부상으로 염증 반응이 저조한 특히 면역 조직 내의 세포와 거주자 사이의 상호 작용에 관해서, 이해된다. 척수 이들 세포 상호 작용의 조사는 살아있는 동물에서 특히 중요하다. 유일한 쉽게 접근 할 수 CNS 백색질이 가능한 실험 방법을 개선에 노력을 집중하기에 중요한 지역 만들기, 척수의 등 열입니다. 이 조사로 인해 액세스하고 이미징 CNS 안정화에 기술적 어려움에 제한되고있다. 척수 라이브 영상은 초기 모독 후 몇 시간 이상 척수 손상 이전에, 그러나, 연구는 거의 1-13 다루었 셀룰러 이동을 설명 하였다. 외상성 척수 병변은 뉴런, 아스트로 사이트, 섬유 아세포, NG2 선조 세포 및 면역 세포를 includi을 가진 복잡한 환경미세 아교 세포, 호중구, 대 식세포, T 세포, B 세포 및 수지상 세포 14,15 겨. 대 식세포는 순환부터 침입 병변에 대한 책임 식세포 면역 세포의 서브 세트이다. 이들 식세포의 역할은 이들 세포는 손상된 조직의 손상과 보호 역할을 모두 수행 할 수 있음을 나타내는 보고서, 논란이되고있다. 이러한 역할은 부상당한 동물 21,23,24에서 기능 적자를 상처에 복용 표현형을 치유하고 감소로, 손상 후 보조 축삭 dieback을 증가시키고 식세포으로 16-22으로 행동 이르기까지 다양합니다.

이전에는 주로 건강한 조직의 형태에 의존 한 미세 아교 세포에서 대 식세포를 구별하려고 시도합니다. 그러나 활성화 된 미세 아교 세포와 대 식세포는 같은 마커의 많은 표현하고 BAS를 연구하기 어려운 이러한 세포의 다양한 활동의 분리를하고, 부상 25 ~ 29 후 구별 형태를 표시30 만 이러한 요인에 에디션. 이 방법은 생체 내에서 이들 세포 유형을 판별 덜 유용하지만 이러한 균체 33,34 유세포 분석기를 사용하여 CD45의 발현에 의해 분리 될 수있다. 단핵구 이러한 마커의 발현의 역동적 인 변화가 정확한 분석 (35, 36)를 복잡하게 대 식세포로 분화하지만, 미세 아교 세포와 대 식세포에서 CCR2 및 CX3CR1의 활용 발현 차이는, 탐구하고있다. 대식 세포가 골수 전구 세포에서 파생 된 모욕 (31, 32) 후 부상 CNS를 입력하는 동안 미세 아교 세포는 중추 신경계에 거주하는 면역 세포 인 태아의 개발 과정에서 난황 전구 세포에서 발생한다. 이러한 두 종류의 세포를 구별하는 형태를 사용하는 또 다른 방법은 CNS 상주을 유지하면서, 도너 전구 세포로부터 유도 된 대 식세포에서 추적 마커를 발현 도너 동물에서 전구 세포와 골수를 대체하는 것, RECIPient 유래 미세 아교 세포. 이 골수 키메라 모델은 일반적으로 많은 다른 응용 프로그램 37-40에 이용된다. 따라서이 방법은 특정 애플리케이션에서의 사용을 제한하는, 숙주에서 골수 전구 세포를 박멸하는데 사용 조사 또는 세포 독성 약물에 의해 야기되는 뇌 혈관 장벽의 완전성의 손상과 관련된 고유주의를 갖는다. 최근 CNS의 대 식세포와 미세 아교 세포 사이의 기능적 차이는 유동 세포 계측법, 유전자 칩 어레이 분석 및 미래에 매우 유용 할 것이다 키메라 24,26,41-44 방법을 사용하여 식별 될하기 시작했다. 이러한 두 종류의 세포를 분리하기 어려운 상태 그대로지만, 고유의 기능을 이해하는 것은 모두 CNS 내의 미세 아교 세포 및 대식 세포를 포함하는 질환의 치료 표적으로 이어지는 중요하다.

척수 내 병변 세포 상호 작용에 대한 설명은 주로 세포 배양 모델을 포함하는 연구에서왔다. 이 D이다살아있는 동물에서 함께 영상 모두 척수 병변 및 면역 세포와 관련된 문제에 대한 UE. 다양한 종류와 심각도의 척수 손상의 현재 설치류 모델은 타박상 모델 45, 46, 핀 찌를 부상 2, 열상 (47), 여기 16,18,48 설명 등의 열 압박 손상을 포함한다. 수막에 염증 부상의 정도에 따라 증가 및 직렬 이미징을위한 창이나 수술의 주입에 대한 독특한 도전을 포즈. 이러한 문제점 중 일부는 대 식세포의 침윤뿐만 아니라 수술 부위 위에 섬유 조직의 생성을 포함한다. 등의 열 압박 손상을 연구하기 위해 여기 에서처럼 이러한 문제 중 일부는 작은 병변을 만들고 경질 이후 다시 개방 수술을 허용하는 paraspinous 근육 사이의 비 면역 원성 수술 드레싱 노출 된 척수를 덮고에 의해 극복 될 수있다 . 스핀의 이미지 만 등의 부분에있는 기능타박상 모델은 주로 자주 부상 45,49 후 특히 이른 시점에서, 등의 컬럼의 가장 지느러미 부분을 살려주는 중앙 코드에 손상을 줄 수 있기 때문에 알 코드는, 부상의 선택을 제한한다. 따라서, 우리는 병변 내 병변에 축삭의 상대 위치를 쉽게 정량화 세포 운동의 관찰 모두에 유용 깨끗하고, 반복, 직사각형 모양의 병변을 산출 간단한 손상 모델에 대해 설명합니다.

프로토콜

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참고 : 모든 동물은 보관 및 기관의 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 따라 사용되어야한다. 여기에 설명 된 모든 절차는 케이스 웨스턴 리저브 대학 IACUC에 의해 승인됩니다.

1. 형질 전환 동물

  1. 축삭 (네-1 YFP H) (50)와 미세 아교 세포 / 단핵 세포에 라벨을 상업적으로 이용 가능한 형광 기자 마우스를 사용 (CX3CR1 GFP / GFP (51), 물질의 목록 참조). 이 마우스는 교차하고 제도적 동물 보호 정책에 따라 개별 사육 식민지로 유지되어야한다.

2. 골수 키메라

  1. 받는 사람 동물로 사용하기에 나이가 적어도 팔주 아르 동물을 식별합니다.
  2. 심지어 몸 전체 조사를 위해 위치에 마우스를 개최하도록 설계 원형 조사 잡고 케이지에서 호스트 동물을 놓습니다.
  3. 세슘에 타이머를 설정 (CS-137) 조사기는 전신 방사선 도스를 관리 할 수제조업체의 지침에 따라 동물 800 ~ 1,000 RADS의 나이 (여기에 표시된 예는 980 RADS 있습니다).
  4. 4 시간의 최소 휴식을 자신의 새장에 동물을 돌려줍니다.
  5. 적절한 유전자형의 동물 도너 선택 골수 전구 세포의 소스로 (도 2a 참조).
    주 : 해당 기증자가 다른 세포 집단, 또는 컨트롤과 동일한 유전자형 중 하나를 식별하기 위해 호스트에서 다른 혈통 특정 형광 기자를 표현하는 동물이다.
  6. 한 페트리 70 % 알코올로 요리, 10 ml의 로스웰 파크 메모리얼 연구소 (RPMI) 미디어와 미디어에 적신 40 μm의 셀 스트레이너와 두 번째 접시를 입력합니다. RPMI 미디어와 15 ML 원뿔 튜브를 입력합니다. 얼음 요리와 튜브를 유지합니다.
  7. 기관의 지침에 따라 공동으로 2 질식을 공여 동물을 희생. 모든 모피가 젖었을 때까지 70 % 에탄올로 전체 동물을 담가 피부와 모피를 청소합니다.
  8. SK 제거중반 섹션 주위에 절단 완전히 다리 근육을 노출 뒷다리를 통해 피부를 당겨 동물의 하단에서의.
  9. 뼈 탈구 후 멸균 집게와 가위, 껍질을 사용하고 경골의 양쪽 끝에서 떨어져 근육을 잘라 무릎 관절에서 전방 overextension에 의한 경골를 제거합니다. 미디어를 포함하는 페트리 접시 내부의 셀 스트레이너로 전송 한 후 최대 30 초 동안 알코올로 페트리 접시에서 뼈를 놓습니다.
  10. 고관절 탈구 및 대퇴골에 붙어있는 근육을 벗겨, 알코올 대퇴골 짧게 배치 한 다음 그릇 안에 동일한 셀 스트레이너에 넣습니다.
  11. 조직 배양 후드에서, 뼈의 양 단부를 절단하고 뼈의 단부에 1 ml의 시린지에 21 게이지 바늘을 삽입 멸균 가위를 사용한다. 미디어 15 ML 원뿔에 골수를 플래시합니다. 나머지 뼈의 절차를 반복합니다.
  12. 3 ㎖ 주사기의 플런저의 뒷면을 사용하여, 분쇄 뼈 세포 만료페트리 접시에 여과기가 더 세포를 추출.
  13. 50 ML 원뿔 튜브의 상단에있는 필터를 놓고 15 ML 원뿔 관에서 흡인 세포와 미디어를 전송할 수 있습니다. 단일 세포 현탁액을 수득하기 위해 골수 호감 플런저의 후면을 사용한다. 15 ML 원뿔 튜브, 뼈 조각과 50 ML 원뿔 튜브에 미디어 30 mL를 셀 스트레이너를 씻으십시오.
  14. 펠릿 세포 500 XG에서 5 분 동안 세포를 원심 분리기.
  15. 암모늄 염화 칼륨 (ACK) 2 ㎖로 용해와 적혈구 2 분 동안 용해 완충액. 10 % 소 태아 혈청 함유 배지 10 mL로 용해 버퍼를 켄칭. 500 XG에 5 ~ 10 분간 원심 분리기 펠렛.
  16. 각각의 세척을 위해 펠릿 5 ~ 10 분 동안 500 XG에 원심 분리, 식염수에 두 번 RPMI 미디어 10ml에 한 번 세포를 씻으합니다.
  17. 식염수 200㎕를 3 × 106 세포의 최종 농도로 세포를 재현 탁.
  18. IRR에 꼬리 정맥 주사를 통해 전송 3 × 10 6 골수 세포adiated받는 사람 마우스.
  19. 받는 사람 케이지에 산성 액 (PH 3.0)을 놓고 마우스는 복구 할 수 있습니다.
    참고 : 이식 시술 후 10-14일 내에서 죽을 것이다 실패 마우스.
  20. 8주 후, 유동 세포 계측법 (도 2B-C)를 이용하여 말초 혈액 세포를 면역 검사하여 골수 재구성을 확인.

3. 지느러미 열 압박 손상

참고 : 적절한 키메라 동물이나 원하는 실험에 따라 수술을위한 이중 형질 전환 동물을 선택합니다. 어느 레이블이 거주 또는 골수 유래 세포와 동물은 이전 단계에서 작성되었습니다.

  1. 준비하고 rongeurs을 포함하여 수술 도구를 압력솥, 뒤몽 # 4 포셉, 홍채 가위를 들고 조직, 바늘 드라이버와 상처 클립 집게.
  2. 통증 조절을위한 마우스에 관리 할 약을 준비합니다. Bupernex와 마르케는 일반적으로 통증 조절을 위해 사용된다. 필요에 따라 적절한 약물을 사용차 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인했다.
  3. 4 % 이소 플루 란 마취를 유도하고 분당 60-100 호흡의 호흡 속도를 달성하기 위해 1 ~ 2 %의 이소 플루 란으로 유지한다. 마취하에 건조를 방지하고 발 핀치에 의한 응답의 부족을 확인하기 위해 동물의 눈에 눈 윤활제를 적용합니다. 가열 패드를 사용하여 온도를 유지하고 직장 프로브를 사용하여 온도를 모니터링한다.
  4. 대상 척수 수준에 비해 전기 면도기와 마우스의 뒷면을 면도하고 확인을 두 번 70 % 알코올 다음 포비돈 - 요오드와 지역을 세 번 채취. 멸균 드레이프에 동물을 배치하고 수술 부위를 시각화 할 수있는 적절한 위치에서 잘라 구멍이 다른 무균 드레이프와 동물을 커버한다. 수술 전반에 걸쳐 무균 커튼의 모든 도구를 유지한다.
  5. 동물의 뒷면에있는 근육을 노출 홍채 가위로 원하는 척수 수준에서 중간 선을 따라 피부를 잘라.
  6. DISS에서현미경을 돌출 한 칼라, 승모근 그들은 지느러미 척추 프로세스에 연결 정중선을 따라 넓은 등의 dorsi의 인대를 포함하여 등 근육을 절단하고, 척추를 노출합니다.
  7. 특정 척추의 얇은 판을 공개 척추의 지느러미와 가로 프로세스 사이의 회전 근육을 제거하는 것은 (이 경우 T11)을 제거한다. 이 과정 상에 마지막 비 부동 리브의 삽입에 의해 T11을 확인합니다.
  8. 제거 할 수있는 공정 위와 아래 공간에 rongeurs의 팁을 삽입하고 있는지 그렇지 않은 척추 부상을 입을 너무 깊은 척추 얇은 판 주위에 위치에 단단히 고정되어 있지만 수 있도록 약간 들어 올립니다. 한 번의 이동 닫기 rongeurs는 얇은 판을 제거합니다.
  9. 나머지 척추의 작은 부분을 제거하는 rongeurs를 사용하여 필요에 따라 후궁 절제술을 크게.
  10. 통치자에 대해 그들을 잡고 영구 마커로 표시하여 # 4 포셉의 끝에서 1mm를 측정한다. 분리 내기에 1mm를 측정통치자에 대한 집게를 잡고 두 타인을 싸우는와 집게의 샤프트를 통해 장소에 고무 집게 링을 움직여서 1mm에 팁의 최대 폭을 고정합니다.
  11. 척수에 액세스 할 수 포셉 타인에 대한 두 개의 삽입 점에서 경질을 통해 30 게이지 바늘을 삽입하여 작은 구멍을 만듭니다.
  12. 마크가 경질 이상 확인하고, 포셉의 측면에 표시 1mm의 깊이로 구멍을 통해 경질에 90 ° 각도로 집게 타인을 삽입합니다. 집게를 닫고 10 초 동안 누르고 꼬집어. 릴리스를 반복 집게 세 가지가 보유하고 총 두 번 더 짠다. 척수에서 집게를 제거합니다.
  13. 부상 사이트를 통해 생리 식염수 대신 흡수성 젤라틴 압축 스폰지의 조각을 만끽 해보세요.
  14. 실행중인 스티치를 사용하여, # 4 합성 비 흡수성 나일론 봉합사와 후궁 절제술을 통해 장소에 근육 적신 젤라틴 스폰지를 봉합.
  15. 5mm 상처 CLI를 사용하여 장소에 피부 클립PS.
  16. 근육 대전 근 근육에 10 μL 마르케 490 절개 사이트 주위에 식염수를 피하 ㎕의 5 μL Bupernex (0.1 ㎎ / ㎏)에서 (1.0 ㎎ / ㎏)을 주입한다.
  17. 동물이 따뜻한 패드에 복구하고 뒷다리의 움직임에 어려움 또는 마비의 징후를 모니터링 할 수 있습니다. 완전히 마취에서 회복 될 때까지 무인 또는 다른 동물의 존재에 동물을 두지 마십시오. 관찰 모터 적자를 표시하는 동물을 사용하지 마십시오.
    주 :이 크러쉬 병변 척수의 임의 레벨에서 수행 될 수 있지만, 사실상, T10-L4 호흡 및 클램프를 이용하여 신체의 움직임을 안정화에 대해 이미징 적은 기술적 도전을 제기. 클램프 위치는 흉부 수준에서 이미지에 갈비뼈 주위에 수정해야합니다.

4. 생체 내에 이미징

  1. 준비 및 조직, 바늘 D를 유지 뒤몽 # 4 포셉, 홍채 가위, 집게를 포함하여 수술 도구를 압력솥강 상처 클립.
  2. 이소 플루 란 이전 마우스를 마취. 4~5%에서 마취를 유도하고 분당 60 ~ 100 호흡의 호흡 속도와 발 핀치에 대한 응답의 부족을 유지하기 위해 필요에 따라 1 ~ 2 %로 유지한다. 가열 된 마우스 이미징 유지하지 호흡 속도를 연속적으로 모니터링하고 직장 프로브 동물 온도를 모니터링.
  3. 술 후 상처 베타 딘과 클립과 주변의 피부를 청소하고 제조 업체의 지침에 따라 상처 클립을 제거합니다. 상처 클립이 제거되면, 필요한 경우 나이 르와 머리를 제거하고 포비돈 요오드 70 % 알코올로 사이트를 다시 청소하십시오.
  4. 가위로 피부를 다시하는 것은-엽니 다. 근육에 남아있는 모든 봉합사를 제거하고 필요한 경우 가위로 절단, 집게와 떨어져 근육을 당겨.
  5. 척수의 위와 아래 라미 척추 하나 척추 레벨에 가로 돌기 측면의 위 근육을 절단함으로써 클램프 해부 현미경 포켓을 만들nectomy.
  6. 이러한 척추의 각 주위에 클램프를 놓고 조입니다. 척수에 도달하는 현미경 대물위한 공간을 허용하기 위해 필요에 따라 조정한다. 척수 이미징 플랫폼에 평행 있는지 확인하고, 이미징을위한 조직의 안정성을 유지한다. 호흡 이슈가 보이면, 촬상 필드의 움직임을 최소화하도록 적절하게 클램프 재조정.
  7. 파라 필름과 클램프를 커버.
  8. , 집게와 척수에서 흡수성 젤라틴 압축 스폰지를 제거 섬세 또한 가능한 한 수막 각지에서 많은 흉터 조직을 제거, 가능한 한 많은 조각을 따기. 필요한 경우 커버 식염수 새로운 스폰지와 척수를 노출.
    참고 : 출혈이 스폰지로 물이 새지 필요에 따라 소작하거나, 주변의 근육에서 발생하는 경우. 그러나, 소작와 척수를 건드리지 않도록주의 바랍니다. 소작 때 젖은 티슈 나 젤라틴 압축 스폰지의 조각 중 하나와 척수를 커버.
  9. 아 만들기L은 제 척수 홀더의 두 개의 클램프와 동물 측간 잘 구축 치과 아크릴을 사용하여 다음과 Vetbond 피부 및 조직을 봉합에 의해 침지 유체를 보유한다. 아크릴 치료 될 때까지 기다립니다.
  10. 인공 뇌척수액 (ACSF)와 잘 채우고 수술 사이트 주위에 출혈 어떤 다시 확인합니다.
  11. 선택적으로,이 시점에서 촬상 중에 혈관 강조 꼬리 정맥 주사에​​ 의한 정맥 혈관 형광 염료를 주입.
    참고 : 양자 점과 형광 표지 된 렉틴이 또한 유용 선박 염료를 제공하지만 70 kDa의 위의 형광 덱스 트란이 자주 사용된다. 150,000 WM TRITC 덱스 트란 50 μL은 전형적 정맥 내 주사된다.
  12. 생리 학적으로 중요한 면역 세포 운동성을 구하려면 마우스의 온도는 37 ° C로 유지되어야한다. 이미징 현미경으로 온도 제어 된 환경에 마우스를 이동하고 올바른 anes의 동물을 모니터링호흡 속도와 발 핀치에 의해 thesia 수준. 분당 100 호흡 - (60)의 호흡 속도를 달성하는 것을 목표로, 마취의 깊이를 결정하기 위해 촬영시 자주 동물을 모니터링합니다.
  13. 현미경의 접안 렌즈를 통해 영상 사이트를 찾습니다.
  14. 동적 촬상 데이터를 얻는 Z 스택 화상마다 30-60 초 걸릴 2- 광자 레이저 주사 현미경을 조정한다.
  15. 영상 세션이 완료되면 가열 상자에서 동물을 제거합니다.
  16. 척추 클램프를 풀고 클램프에서 마우스를 제거합니다. 클램프를 제거하는 동안 피부에서 잘 떨어져 아크릴을 당깁니다.
  17. 마우스가 다시 영상화 할 경우, 척수를 통해 식염수를 적신 젤라틴 압축 스폰지를 배치합니다. 수술 사이트를 통해 근육과 피부를 닫습니다. 마취에서 회복하는 동안 무인 동물을 떠나거나 다른 동물의 존재하지 않습니다. 동물이 복구 후 신경 학적 결손의 흔적을 표시하는 경우, 동물은 안락사해야합니다. 그렇지 않으면 안락사CO 2 챔버 내의 마우스 그것은 IACUC 승인 안락사 프로토콜에 따라 전에 마취에서 나온다.
  18. 제조업체의 지시에 따라 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 형광 이미지를 분석한다.

결과

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등의 열 호감 병변을 묘사 한 개략도는 그림 1A에 표시됩니다. 병변 후, 동물을 준비 클램프 척추관 (도 1b)를 이용하여 생체 내에 현미경 안정화. 등의 열 압박 손상 직후 촬영 된 이미지가 명확하게 식별 할 수있는 겸자 타인 삽입 점을 명확하게 보이는 직사각형의 병변을 보여줍니다. 부상 사이트에서 축삭은 전체 등의 열 (그림 1C)의 범위에 걸쳐 절단된다. 혈관의 무결성은 그대로 유지하고, 용기 염료 누설의 증거는 형광에 의해 검출되지 않았다. 주에 걸쳐서 동일한 병변 직렬 촬상을 수행하기 위해, 근육과 피부를 다시 후속 노광 후궁 절제술을 통해 봉합 될 수있다. 유사 병변의 형태는 나중에 포인트 (그림 1D, E)에서 볼 수있다. 오일 손상 후, 집게 삽입 사이트는 여전히 볼 수 있습니다 있지만, 병변 크기 D가 증가하기 시작했다염증에 의한 보조 부상 UE. 병변의 꼬리 끝의 축삭은 "축삭 dieback"이라는 과정을 통해 부상의 초기 사이트에서 후퇴했다. 병변의 주동이의 끝에서 축삭 Wallerian 같은 변성 (그림 1D, E)를 나타냈다. 일 5 부상 후 22 년 사이에, 병변의 크기는 안정. 도 1에 도시 된 바와 같이, 이러한 세포 (대 식세포 대 미세 아교 세포)의 ID가 제조에서 구별 될 수 없지만 동시에, CX3CR1 + 세포의 큰 유입, 및 이러한 시점 중 크러쉬 환부 주위 침윤을 알 수있다.

크러쉬 병변 미세 아교 세포 및 대 식세포 내에서의 동작을 구별하기 위해, 방사선 키메라 모델 (도 2a에 설명 된)을 사용 하였다. 먼저, CX3CR1 + / GFP 마우스의 골수 전구 세포는 비 형광 도너 CEL로 대체LS, 따라서 만 GFP + CNS 상주 미세 아교 세포는 형광 영상으로 볼 수 있습니다. 골수 재구성의 효율성 8주 골수 이식 (도 2B, C) ​​이후의 시험 말초 혈액 유동 세포 계측법에 의해 확인 될 수있다. 그림 2B, F4 / 80과 GFP 긍정적 인 대 식세포에서 파란색으로 강조하는 일부 GFP 부정적인 그러나 F4 / 80 긍정적 인 단핵 세포는 존재, CX3CR1 + / GFP → C57BL / 6 키메라 마우스에서 검출된다. 그림 2C, 아니 두 번 긍정적 인 F4 / 80 및 GFP 양성 세포에서 야생 형 골수 CX3CR1 + / GFP받는 사람의 골수를 교체 한 후 남아 있습니다. 부상하기 전에, 미세 아교 세포가 균일하게 휴식, 분지의 형태 (그림 2D)를 표시, 척수 내에서 배포됩니다. 팔일 손상 후, 몇 미세 아교와 환부 주위에 검출 할 수있다. 이러한 미세 아교 세포는 아메바 형태 (그림 2E)을 표시합니다. 둘째, 뼈비 형광 마우스의 골수 전구 세포 따라서 골수 CX3CR1 + 단핵구 / GFP의 형광으로 표시 식세포 (그림 2A)를 유도 렌더링, CX3CR1 + / GFP 마우스의 골수 세포로 대체됩니다. 부상 전에 만 GFP + 감지 세포는 골수 유래 지속적으로 정기적으로 (28) (그림 2 층)에 넘겨 것으로보고되고있다, 이는 주로 혈관 주위 있습니다. 압박 손상 후 CX3CR1 + / GFP 세포 병변 (도 2H-J)를 둘러싸는 혈관의 내측을 따라 볼 수 있고, 병변 중심 CX3CR1 + / GFP 식세포 (도 2G)를 침투로 채워진다.

지느러미 열 시간 경과 영상은 6 시간까지 수행 할 수 있습니다. 순환하는 세포에서 볼 수있는도 3에서는 부상 직후 비 키메라 CX3CR1 + / GFP 마우스 보여N 병변 코어쪽으로 혈관 밖으로 이동하고 부상 사이트 (도 3A, B, 기업 영화 1) 내에서 이동. 대 식세포 (; 기업 영화 한도 3A, B)에 의해 취해진 경로를 추적 할 수있는 셀을 식별하는 형광 강도를 이용하여 이미지 분석. 촬상 분석으로부터 유도 통계 병변에서의 대 식세포 평균 3.6 μm의 운동성 / 분 (도 3D) 표시이다. 부상, 축삭, 미세 아교 세포와 대 식세포 후 20 일이 아직도 영상의 영역을 보여 병변 내에서 검출 될 수에서 마지막으로, 시간 (보충 영화 2) 오랜 기간 동안 안정적이다.

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그림 1 : 창조와 지느러미 열 압박 손상의 순차적 영상. (A) 등쪽열 압박 손상은 관심 수준에서 척추의 등 제거 공정에 의해 수행된다. 겸자 떨어져 척수 1mm의 등 열에 삽입 된 후 보라색에 도시 병변을 생성 3 회 폐쇄된다. (B) 동물 후 척수로 위치되는 생체 내에 영상 안정성을 얻기 위해 클램프. (C) 손상 후 즉시, 겸자 삽입 사이트 (붉은 타원)과 직사각형 압박 손상 볼륨 (회색 박스)을 명확히 식별 할 수있다. 등쪽 뿌리 축삭은 (흰색 화살표)뿐만 아니라 환부 (가득 화살표 머리)의 꼬리 쪽 축삭 부상 끝을 알 수있다. (D) 오일 손상 후, 겸자 삽입 사이트 (붉은 타원 ), 병변 (회색 박스의 정도)는 여전히 쉽게 가시화 될 수있다. 병변은 초기 모욕 때문에 크기가 증가하고있다. Wallerian 같은 변성을받은 축삭은 additi의 병변 (오픈 화살표 머리)에 주동이 볼 수 있습니다등의 뿌리 (흰색 화살표) 부상 축색 돌기의 끝 (흰색 화살촉). (E) 이십이일 손상 후 축삭에에, 병변의 위치는 여전히 오일 이후 부상과 비슷한 크기와 식별합니다. 및 부상 사이트 주위에 CX3CR1 + 세포의 큰 번호를 확인합니다. 표지 된 특징 (D)와 동일하다. 모든 스케일 바는 200 μm의 =. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 2 : 키메라 마우스의 건설 등의 열 호감 병변에서 CNS 상주 미세 아교 세포 또는 골수 유래 대 식세포를 표현 CX3CR1 + / GFP를 추적 할 수 있습니다. (A) + CX3CR1 / GFP 하나 마일을 표현하는 키메라 마우스의 생성의 개략도croglia 또는 대 식세포. 우선, 네 YFP H-1 생쥐 조사 및 골수 대 식세포는 누구의 GFP + 아르 키메라 마우스의 결과 CX3CR1 + / GFP 마우스에서 분리 한 골수 세포로 재구성 하였다. 둘째, 네 -1- YFP H / CX3CR1 + / GFP 마우스는 조사 및 골수 누구 소교 GFP의 + 아르 키메라 마우스의 제조, 비 형광 마우스로부터 단리 골수 세포 재구성된다. (B) 데이터 유세포 예 조사 된 C57BL / 6받는 사람에 이식 CX3CR1 + / GFP 골수 기증자와 키메라 동물의 혈액에서 F4 / 80 + 및 CX3CR1 GFP + 세포. C57BL6와 키메라 동물의 F4 / 80 + 및 CX3CR1 GFP + 세포와 데이터 유동 세포 계측법의 파란색 영역을 강조 모두 GFP 및 F4 / 80에 대한 긍정적 인 CX3CR1 긍정적 인 기증자에서 파생 된 세포가 표시됩니다. (C) 예 기증자의 골수는 IR에 이식방사 CX3CR1 + / GFP받는 사람. 파란색 영역을 강조 내에 큰 긍정적 인 CX3CR1 + / GFP 및 F4 / 80 세포의 부족합니다. (D) 첫번째 키 메릭 방식에서 마우스의 생체 내에 두 광자 현미경 스냅 샷, 등쪽에서 분지 형태와 GFP + 미세 아교 세포를 보여주는 열 (화살표 머리). 이 세포는 후근과 등의 열에서 축삭 (노란색) 산재되어있다. 스케일 바 = 100 μm의. (E)에서 동일한 마우스의 생체 내에 영상 (B) 팔일 등의 열 손상이 프로세스 (화살표 머리) 부족 크고 아메바 모양의 세포 기관과 몇 CX3CR1 + 미세 아교 세포를 계시 한 후. CNS 실질 내 부족한 GFP + 식세포를 보여주는 스케일 바의 두 번째 키메라 방식에서 마우스 = 100 μm의. (F) 스냅 샷 (A),,. 100 ㎛. 팔일 등의 열 손상 후 (G) (F)에서 동일한 마우스의 생체 내에 영상이 알을 계시 = 스케일 바및 병변 주위 식세포의 아게 유입. 스케일 바 = 100 μm의. (H) 손상되지 않은 동물의 혈관과 접촉 CX3CR1 + 혈액 유래 세포의 높은 배율 사진. 스케일 바 = 30 μm의. 용기 내부에서 본 용기에 접촉 CX3CR1 셀 (I) 재구성. 스케일 바 = 30 μm의. (J) 선박과 접촉 CX3CR1 세포의 재건, 선박의 외부에서 볼. 스케일 바 = 20 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 3 :. 즉시 지느러미 열 압착 후 비 키메라 CX3CR1 + / GFP 마우스의 대표적인 셀 추적 데이터부상. (A) 즉시 지느러미 열 압박 손상 후 CX3CR1 + 미세 아교 세포 및 보충 영화 1 대 식세포 주위 손상된 축색 돌기 (노란색)의 스냅 샷. (B) (회색) 경로 (A)에 CX3CR1 + 세포에 의해 촬영 (110) 동안 분의 intravital 이미징 세션. (C) (B)에서 트랙의 시간 코드 표현입니다. 시간 표시 줄에 같이 트랙은 전체 110분 영화 내에서 자신의 시간을 기준으로 색상이 지정되어 있습니다. CX3CR1 + 세포의 전반적인 운동성의 (D) 히스토그램. 모든 스케일 바는 30 μm의입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

보충 영화 1 : 즉시 더블 이형의 지느러미 열 압박 손상 후 대표 생체 내에 영화 네-1 YFP / + GFP / + 마우스. 생체 내에 척추 영상은 T11 수준에서 지느러미 열 압박 손상 후 즉시 시행 하였다. 오른쪽 패널은 CX3CR1 +의 미세 아교 세포와 대 식세포의 이동을 보여줍니다. 세포 운동의 경로는 왼쪽 패널에 흰색 트랙으로 표시됩니다. 부상은 왼쪽 상단에 있습니다. CX3CR1 + 세포는이 트랙을 따라 부상의 사이트로 이동 볼 수 있습니다. 축삭은 노란색으로 표시됩니다. 스케일 바는 40 μm의 =. 총 시간 : 110 분. 재생 속도 : 300 배.

보충 영화 2 :. 이중 이질 네-1 YFP / + / CX3CR1 GFP / + 마우스의 등쪽 열 호감 병변 후 20 일에 대표 생체 내에 영화 여기에 표시됨 22 일 초기 지느러미 열 압착 한 후 마우스에서 촬영을 대표하는 영화입니다 척추 수준 T11에서 부상. INJURY는 프레임의 오른쪽 상단에 있습니다. 축삭은 (노란색) 상승은 rostrally 오른쪽 하단에 표시됩니다. 등의 혈관과 혈관은 (적색) TRITC - 덱스 트란으로 표시됩니다. 바로 부상 후에 비해 느린 속도로 병변 이동 내 CX3CR1는 + 세포. 스케일 바는 50 μm의 =. 총 시간 : 90 분. 재생 속도 : 600X.

토론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

실시간으로 병리 계속되는 동안 그 나라의 조직 구획에서 다른 종류의 세포 이미징 상호 작용은 큰 관심을 생성했다. CNS, 세포 - 세포 접촉의 밀도가 네트워크 내에서 인접 세포와 신호가 정상적인 기능과 중추 신경계의 병리를 이해하는 데 필수적이다. 여기서는 척수 기계적 병변 내 세포 이동의 관찰이 광자 레이저 스캐닝 현미경의 사용을 설명했다. 수술 및 조직 준비의 품질뿐만 아니라, 조직의 기계적 안정성이 성공적으로 시간 경과 현미경, 동 잡음 호흡에서 척수 특히 절연을위한 가장 중요하다. 안정성은 동물의 심장 박동 또는 호흡에 대응 해부 현미경 척수의 이동 찾음으로써 평가 될 수있다. 수술을 수행하고 또한 영상을 시작하기 직전에있는 동안 안정성을 모두 평가해야한다. 애니 마 경우L은 조정 척수 클램프의 배치 및 견고 함을 유지해야한다 안정하지 않다. 골수 키메라 접근 방식과 결합 된 세포 형 특정 형광 기자 마우스 모델은 미세 아교 세포와 축삭 대 단핵구 세포의 식별을 허용했다. 이전의 연구는 혈액 유래 단핵구가 아니라 미세 아교 세포가 여기에 (43)에 설명 된 방법을 사용하여 외상 후 보조 축삭 손상에 대한 책임이 있음을 밝혀졌다. 덱스 트란 공액 용기 염료 모두 랜드 마크를 제공하고 용기 무결성 침해를 식별하기 위해 용기의 식별을 허용한다. 적절한 형광 리포터 마우스 모델의 선택은 목적하는 세포 유형의 적절한 식별이 묘화 될 수있게하는 것이 중요하다.

수행되는 연구에 적합한 형광 마우스 모델의 개발은 또한 실험의 성공에 매우 중요하다. CX3CR1 + / GFP의 두 식세포 집단을 구별 CNS의 세포는 전통적으로 어려웠다. 여기에 도시 된 바와 같이, 일반적인 면역 학적 기법, 조사 키메라는 골수 유래 대 식세포로부터 무선 내성, CNS 상주 미세 아교 세포를 구별하는데 이용 될 수있다. 조사 절차는 세포 표현형을 혈액 뇌 장벽을 손상 변경할 가능성이 있으므로이 모델의 사용은 신중하게 고려되어야한다. 이러한 변화의 정도는 조사량뿐만 아니라 회복 기간의 지속 기간과 상이하고, 다른 모델의 염증에 미치는 영향은 충분히 연구되지 ​​않았다. CNS 혈액 뇌 장벽에 대한 조사의 효과를 조사하는 동안 머리를 차단함으로써 최소화 될 수 있고, 이것은 척수 직접 52 차폐되어 있지 않은 경우에도, 조사 후 척수 세포의 침윤을 감소시키는 것으로 밝혀졌다. 여기서 우리는 키메라의 생성 결과로서 정상 상태에서 CNS 내로 침윤 세포의 수는 대조 마비 무의미한 것을 관찰병변을 입력 셀 ER. 고려해야 할 다른 대안 모델은 약물 유발 키메라 52 parabiotic 마우스 모델 (53)을 포함한다.

여기서 우리는 두 광자 현미경을 사용하여 이미지를 쉽게 척수의 등 백질에 병변 결과, 특정 간단하고 재현성있는 작은 손상 모델을 제시 하였다. 이 방법은 문헌에 보완 고정 조직 분석 16,18,43,48,54와 결합 된 지느러미 열에서 축삭 dieback의 정도를 분석하는 정량 병변을 제공합니다. 이 모델에서, 동물들은 최소한의 적자를 표시하고 손상 후 특별한 치료를 필요로하지 않습니다. 여기에서 설명하는 등의 열 압박 손상 및 이미징 기술을 이용하여 미래 연구는 척수 손상에 대한 치료의 효과를 평가하기 위해 강력한 검사 도구가 될 수 있습니다. 이러한 치료는 소분자 억제제, 약물, 세포 제제, 조직 이식 및 조합 치료를 포함 할 수있다의. 대식 세포, 미세 아교 세포와 신경 세포 사이의 상호 작용은 또한 다발 경화증, 종양, 수막염 및 근 위축성 측삭 경화증 척수 다른 질환 모델에서 역할을 수행 할 가능성이 있으며,이 기술은 또한 이들 질환의 연구에 유용 할 수있다 .

공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

다음 기관이 이 연구를 위해 중요한 자금 지원을 제공했습니다: MSTP T32 GM007250 (T.A.E.), 5T32EB7509 (D.S.B.), NCI R01 CA154656 (A.Y.H.), Dana Foundation (A.Y.H.), St. Baldrick's Foundation (A.Y.H.), Alex's Lemonade Stand Foundation (A.Y.H.), Gabrielle's Angel Foundation (A.Y.H.), Hyundai Hope-on-Wheels Program (A.Y.H.). 저자는 Jerry Silver와 Sarah Busch가 DCC(Dorsal Column Crush) 부상을 배우는 데 없어서는 안 될 도움에 감사하고 있습니다. 저자는 또한 유전형 분석에 대한 기술적 도움을 준 Jingquang You, Elisabeth Hare 및 Hongmei Hu와 척추 안정화 장치를 장착한 Ross Anderson에게 감사를 표합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
CX3CR1 GFP 마우스잭슨 연구소5582
Thy-1 YFP H 마우스잭슨 연구소3782
마우스 파이 케이지Braintree ScientificMPC 2 세트
60 mm2 페트리 접시Corning430166골수 분리용
Falcon 40 μ m 세포 필터Fisher Scientific08-771-1골수 분리용
1 x 15 ml 및 1 x 50 ml 원뿔형 튜브Fisher Scientific골수 분리용
21 게이지 바늘BD305177골수 분리용
1 ml 주사기BD309628골수 분리용
ACK 용해 버퍼GibcoA10492-01뼈용 골수 분리
HBSSCorning Cellgro21-022-CV골수 분리용
RPMI 매체SigmaR8758골수 분리용
F4/80 항체Ebioscience12-4801 PE키메라의 FACS 검증용
30 게이지 인슐린 주사기BD328280꼬리 정맥 주입용
척수 클램프NarshingeSTS-A이미징 용
Ortho-Jet 치과 아크릴 파우더Lang DentalREF1320이미징
용 Ortho-Jet 치과 아크릴 액체Lang DentalREF1404이미징
용 젤폼 젤라틴 스폰지Pfizer9034201이미징
용 4-0 Ethilon 봉합사Ethilon1667G수술
용 반사 클립, 7mmKent ScientificINS750344수술용. 사용 전 살균
아이리스 가위파인 사이언스 도구14061-09수술용
45/5 집게, Dumoxel파인 사이언스 도구11251-35수술용
롱거파인 사이언스 도구16021-14수술용
30 게이지 바늘BD305106경막 집게에 접근 구멍을 만들기 위해
Dumont #4 생물학 팁Dumont11242-40수술용
바늘 드라이버정밀 과학 도구12002-12수술용
Michel Wound Clip ForcepsKent ScientificINS700753수술용
상처 클립 제거제Fine Science Tools12033-00수술용
겸자용 O-링Fine Science Tools11200-00수술용 #4 겸자가 제공되는 경우가 많습니다. 별도로 주문
수술 용무선 충전식 동물 트리머Wahl시리즈 8900
Vetbond3M1469SB수술
용 베타 딘 용액 (10 % 프로비 딘 - 요오드 국소 용액)Purdue Products LPNDC 67618-150-08수술 Nair
헤어 리무버 로션교회 & 드와이트 주식회사NRSL-22329-05수술용
IsofluraneButler ScheinNDC 11695-6776-2약물 – 수술용
MarcaineHenry ScheinNDC 0409-1587-50약물 – 수술용 1.0 mg/kg 피하 투여
BupernexHenry Schein121-7793약물 – 수술용 부프레노르핀 0.1 mg/kg
aCSFSigma의 화학물질119 mM NaCl
26.2 mM NaHCO3
2.5 mM KCl
1 mM NaH2PO4
1.3 mM MgCl2
10 mM 포도당		수술용
Cold Spring Harbor 프로토콜
TRITC-dextran 150,000 MWSigmaT1287혈관 구조를 라벨링하기 위한 정맥 투여용
:

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