이 프로토콜의 목표는 COPD의 쥐 모델에서 만성 폐 병리학을 정량화하는 자동화된 방법을 제공하는 것입니다. 이 프로토콜에는 생쥐를 담배 연기(CS)에 노출시키고, 폐 기능을 측정하고, 폐를 팽창시키고, 형태 측정 방법을 사용하여 생쥐의 폐기종 및 소기도 재형성을 측정하는 것이 포함됩니다.
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이 논문에서
요약
초록
COPD는 2020년까지 전 세계에서 세 번째로 흔한 사망 원인이 될 것으로 예상됩니다(1). COPD의 동물 모델은 질병 진행에 기여하는 분자를 식별하고 COPD에 대한 새로운 치료법의 효능을 테스트하는 데 사용됩니다. 연구자들은 설치류, 기니피그, 토끼, 개 등 다양한 종을 사용하는 여러 COPD 모델을 사용합니다(2). 그러나 가장 널리 사용되는 모델은 쥐가 담배 연기에 노출되는 모델입니다. 생쥐는 COPD를 모델링하는 데 특히 유용한 종인데, 그 이유는 생쥐의 게놈을 쉽게 조작하여 개별 단백질이 결핍되거나 과도하게 발현되는 동물을 생성할 수 있기 때문입니다. 담배 연기에 노출된 유전자 표적 쥐에 대한 연구는 COPD(3-5)의 다양한 폐 병리학에 대한 개별 분자의 기여에 대한 귀중한 정보를 제공했습니다. 대부분의 연구는 COPD의 특징인 기류 방해에 기여하는 폐기종 발달과 관련된 경로에 초점을 맞추었습니다. 그러나 소기도 섬유증도 인간 COPD 환자의 공기 흐름 방해에 크게 기여하지만(6), 연기에 노출된 동물에서 이 병변의 발병 기전에 대해서는 알려진 바가 훨씬 적습니다. 이러한 지식 격차를 해소하기 위해 이 프로토콜은 연기에 노출된 마우스의 폐기종 발달과 소기도 섬유증을 모두 정량화합니다. 이 프로토콜은 전신 노출 기술을 사용하여 생쥐를 CS에 노출시킨 다음 생쥐의 호흡 역학을 측정하고 생쥐의 폐를 표준 압력으로 팽창시키고 폐를 포르말린으로 고정합니다. 그런 다음 연구자는 평균 폐포 줄 길이를 측정하기 위한 Gill's stain(폐기종 중증도의 판독값) 또는 Masson의 trichrome stain으로 폐 단면을 염색하여 소기도 주변의 세포외 기질(ECM) 단백질의 침착을 측정합니다(소기도 섬유증의 판독값). 이 두 가지 폐 병리학에 대한 분자 경로의 영향에 대한 연구는 COPD의 발병 기전에 대한 더 나은 이해로 이어질 것입니다.
서론
어떤 모델이 완벽하게 인간의 질병 (2)의 모든 기능을 복제 할 수 없기 때문 만성 폐쇄성 폐 질환을 연구하는 동물 모델의 사용은 도전이다. 대부분의 연구자들은 때문에 폐 생리학, 병리학, 유전학, 대사 산물의 생쥐와 인간 사이의 유사성 만성 폐쇄성 폐 질환을 모델링하기 위해 마우스를 사용합니다. 또한, 마우스는 공부를 상대적으로 저렴하고, 폐기종 및 작은기도 개형 모두 CS 노출 (5,7-9) 6 개월 이내에 개발할 수 있습니다.
담배 연기에 의한 COPD : 여러 가지 방법이 쥐에서 만성 폐쇄성 폐 질환을 유발 할 수 있습니다. 대부분의 연구자들은 인간의 만성 폐쇄성 폐 질환의 주요 병인 인자 CS에 쥐를 노출. 6 개월 CS 노출 폐기종 마우스에서 작은기도 개형 (SAR)의 발전을 초래하지만, 유도되는 질환의 중증도 공부 뮤린 균주에 따라 다양하다. AKR / J 생쥐 extremel 반면 예를 들어, 마우스는 NZWLacZ CS - 유도 기종의 개발에 강한민감한 Y (10). 대부분의 연구자들은 많은 유전자 타겟 마우스이 변형에서 사용할 수있는 CS 노출 모델의 C57BL / 6 변형 쥐를 연구한다. CS 노출, 폐기종 및 작은기도의 섬유화 6....
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프로토콜
이 프로토콜은 완료 25주 ~합니다. 프로토콜 24 주 동안 공기 또는 연기에 쥐를 노출. 연기 노출이 끝나면, 프로토콜 대책 마우스에서 폐 기능 및 폐, 일정한 팽창 압력으로 고정하고, 같은 날에 제거된다. 추가의 시간 (2-4일 동물의 수에 따라 연구), 임베드 절단 및 폐 구간 (2-3 일간) 및 캡처 얼룩과 이미지를 분석하기위한 연구가 필요하다. 이 프로토콜은 또한 마우스에서 연령에 따른 공역 확대를 측정하는데 사용될 수있다.
이 프로토콜에 설명 된 모든 절차는 기관 동물 관리 및 사용 브리검에서위원회와 여성 병원 / 하버드 의과 대학에 의해 승인되었습니다.
1. 전신 담배 연기 노출
- 흄 후드에 설치된 전신 흡연 노출 장치 (그림 1 참조)에서 담배를 쥐를 노출.
참고 :이 장치는 자동으로 바퀴, 난에 대한 연구 담배를로드담배 ights 및 사이드 스트림 연기 수집 챔버에서 사이드 스트림 연기를 수집하고, 담배를 토출. 기계는 메인 스트림 및 사이드 스트림 연기의 혼합물을 생성하기 위해 펌프에 의해 담배에서 추출 주류 연기와 사이드 스트림 연기를 결합합니다. 혼합 및 희석 챔버 내의 팬을 주위 공기와 혼합 연기 및 노출 챔버로 연기를 구동한다. - 노출 챔버에서 제거 케이지 뚜껑....
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결과
이 프로토콜은 CS에 대한 마우스의 전신 노출로 시작합니다. 적절한 감시 장치의 감시 및 TPM의 유지 일관된 연기 노출 (도 1)을 보장 센다. 연구자가 팽창 장치를 이용하여 폐 인플레이션 기술 관행한다는 것이 중요
이 프로토콜은 CS에 대한 마우스의 전신 노출로 시작합니다. 적절한 감시 장치의 감시 및 TPM의 유지 일관된 연기 노출 (도 1)을 보장 센다. 이는 연구자 관행 신중 팽창 장치 (도 2)를 이용하여 폐 인플레이션 기술 공역 확대의 정확한 분석을 위해 잘 팽창 폐 섹션을 획득하기 위해 팽창 후에 폐를 제거하는 것이 중요하다. 그림 3b는 제대로 팽창 폐를 보여줍니다 반면에 그림 3a는 잘 비정상적으로 폐를 보여줍니다. 도 3c는 이진화의 팽창에 대비 폐 구역의 이미지를 도시폐포 공간에서 TEP (대 식세포 흰색 페인트, 선박 및 기관지가 생성 검은 페인트. 임계 단계는 .......
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토론
대부분의 연구자들은 마우스를 사용하여 인간 질병에 존재하는 COPD(공역 확대, SAR 및 폐 순응도 증가)의 주요 만성 폐 병리 및 비정상적인 폐 생리학을 모델링합니다. 이러한 만성 질환 과정에서 관심 분자의 활성을 종합적으로 평가하기 위해서는 마우스에서 폐기종 발생 및 SAR 모두에 대한 관심 분자의 영향을 평가하기 위한 포괄적인 접근 방식이 필요합니다.
이 프로토콜에는 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 첫째, 담배 연기에 노출되는 동안 타르 제품이 장치에 침전되어 폐 질환을 유발하기에 충분하지 않은 CS 노출을 초래할 수 있으므로 적어도 일주일에 한 번 기계를 청소하는 것이 필수적입니다. 둘째, 공대 확대를 정확하게 측정하기 위해서는 폐를 잘 팽창시키는 것이 필수적입니다. 흉부에서 폐를 제거하는 동안 폐에 흠집이 생기면 엽이 수축되어 공역 크기가 과소평가됩니다. 따라서 폐를 보호하려면 가위 끝이 보일 때만 조직을 절단하십시오. 셋째, 폐기종 발생의 정확한 분석을 위해.......
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공개 사항
우리는 공개할 이해 상충이 없습니다.
감사의 글
우리는이 문서에 대한 공로 프란체스카 Polverino MD, 브리검에서 연구 위원과 여성 병원을 감사드립니다, 또한 모니카 야오, BS, 케이트 라이 델, 쥐의 사육 및 담배 연기에 쥐를 노출 그들의 도움 BS.
이 작품은 보건 서비스, 국립 심장, 폐, 혈액 연구소 보조금 HL111835, HL105339, HL114501, 승무원 의학 연구소 그랜트 # CIA123046, 브리검 여성 병원 - 러브 레이스 호흡기 연구소 컨소시엄, 그리고 캠브리지 NIHR 바이오 메디컬에 의해 지원되었다 연구 센터.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 전신 연기 노출 장치 | Teague Enterprise | TE-10z | 만성 연기 노출은 마우스에서 만성 폐 질환을 유발합니다 |
| 연구 담배 | 켄터키 대학교 | 3R4F 참조 담배 | |
| Pallflex ® 공기 모니터링 필터, Emfab 필터 TX40HI20WW, 25mm | Pall Corporation | 7219 | TPM 측정용 |
| 25mm 필터 홀더 | Pall Corporation | ||
| 필터 샘플러 | Intermatic | Metal T100 | |
| 가스 계량기 | AEM | 가스 계량기 G1.6; G2.5; G4 | |
| 기관 캐뉼라 마우스 18 게이지 | Labinvention | 폐 기능 분석 | |
| 기계 인공호흡기 | Scireq | FlexiVent | |
| Gill의 헤마톡실린 용액 | Sigma-Aldrich | GSH316 | 아가미 염색의 경우 흄 후드 |
| Hematoxylin 용액에서 작업, Harris 수정 | Sigma-Aldrich | HHS16 | |
| Cytoseal-60 | Thermo Scientific | 8310-16 | |
| Micro-Slide-Field-Finder | Andwin Scientific INC | 50-949-582 | 폐기종 분석용 |
| Scion Image Program | Scion Corporation | ||
| Mason의 삼색 염색 | Sigma-Aldrich | HT15 | 소기도 섬유증 분석용 |
| MetaMorp 오프라인 버전 7.0 | Molecullar Devices LLC | 31032 |
참고문헌
- Murray, C. J., Lopez, A. D. Measuring the global burden of disease. N. Engl. J Med. 369, 448-457 (2013).
- Wright, J. L., Cosio, M., Churg, A. Animal models of chronic obstructive pulmonary disease. Am. J Physiol Lung Cell Mol. Physiol. 295, 1-15 (2008).
- Hautama....
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재인쇄 및 허가
