mRNA의 붕괴 요금의 측정에<em&gt; 사카로 미세스 세 레비 시아</em사용&gt;<em&gt; rpb1-1</em&gt; 균주

요약

특정의 mRNA의 정상 수준은 mRNA의 합성과 부패의 속도에 의해 결정된다. 전체 게놈 mRNA의 분해율 또는 특정의 mRNA 붕괴 속도는 mRNA의 반감기를 측정함으로써 측정 할 수있다. 이 프로토콜은 사카로 미세스 세 레비 시아에서 mRNA의 붕괴 속도의 측정에 초점을 맞추고있다.

초록

mRNA의 정상 상태 수준은 환경 조건에 따라 달라집니다. mRNA를 정상 상태 축적 레벨의 규정은 단백질의 정확한 양이 특정 셀의 성장 조건에 대해 합성되는 것을 보장한다. mRNA의 붕괴 속도를 측정하기위한 한 가지 방법은 전사를 억제이어서 이미 존재하는 mRNA를 소실을 모니터링. mRNA의 붕괴 속도는 정량화 될 수 있으며, 정확한 반감기는 여러 기술을 이용하여 결정될 수있다. S.에서 cerevisiae의, 반감기가 개발 된 mRNA의 측정 및 RNA 중합 효소 II, rpb1-1의 온도에 민감한 대립 유전자 항구 균주를 사용하여 mRNA의 전사를 억제 포함 프로토콜을 지원합니다. 조절 성 프로모터의 제어하에 mRNA를을 이용하여 반감기는 대안 thiolutin 또는 1,10- 페난 트롤 린, 또는 전사와 전사 억제제를 포함 mRNA의 억제를 측정하기위한 다른 기술,이러한 갈락토스 유도 성 프로모터와 TET 오프 시스템으로. 여기서 우리는 S.의 측정을 설명 RNA 중합 효소 II의 온도에 민감한 대립 유전자를 사용하여 cerevisiae의 mRNA의 붕괴 속도. 이 기술은 개인의 mRNA 또는 게놈의 전체 mRNA의 붕괴 속도를 측정하는데 사용될 수있다.

서론

전사 및 특정 mRNA를 붕괴는 유전자 발현의 중요한 결정 요인이다. 합성 및 특정의 mRNA의 붕괴 속도는 특정 mRNA를 정상 상태 수준을 결정합니다. 의 mRNA의 정상 상태 수준의 mRNA의 풍요 로움을 지배하고 단백질 합성에 사용할 수 있습니다 얼마나 많은 각각의 mRNA를 결정합니다. mRNA의 반감기의 측정의 mRNA 붕괴 속도를 결정하기 위해 광범위하게 사용된다. mRNA의, mRNA와 환경 조건에 의해 암호화 된 단백질의 기능의 기능에 관련된 다른 속도 특정 mRNA를 붕괴. mRNA의 붕괴 속도를 판단하기 위해 이용 된 기술에 따라서, 감소율 측정은 전역 적 또는 개별 사체에 대해 결정될 수있다. 효모 S.에서 cerevisiae에 가장 일반적으로 전체 mRNA의 붕괴 속도를 측정하는데 사용되는 기술은 RNA 중합 효소 II 화학 transc의 온도 민감성 대립 유전자를 보유하는 효모 균주를 이용하는 것을 포함이러한 thiolutin 1,10- 페난 트롤 린 ^1-5 riptional ^억제제. 이러한 방법은 또한 개개의 mRNA 붕괴 속도 ^4를 측정하는데 이용 될 수있다. 다른 방법은 mRNA의 붕괴 속도를 측정하는데 이용 될 수있다. 이러한 방법은 정상 상태 표시 또는 유일한 선택 조건에서 발현되는....

프로토콜

효모 세포의 1. 성장

1. mRNA의 붕괴 속도 측정을 위해 활용 될 수있는 적절한 효모 균주를 선택합니다. RNA 중합 효소 II의 온도에 민감한 대립 유전자를 사용하여 전사를 억제하기 위해, rpb1-1 돌연변이 ^일을 품고 효모를 사용합니다. 이미 하나를 가지고이 실험실에서 효모 균주를 얻거나 특정 유전 적 배경이 ⁹ 필요한 경우 표준 기술을 사용하여 실험실에서 생성.
2. 표준 절차 ^(10)를 사용하여 효모 미디어를 준비, 멸균 기술을 사용. 어떤 선택이 필요하지 않은 경우, 이러한 YPD으로 리치 미디어를 준비합니다. 및 선택 플라스미드로 형질 전환 된 효모 세포가 필요할 경우 선택적으로, 선택 배지를 준비한다. 미디어를 압력솥.
3. 이 효모의 허용 온도 28 ° C에서 효모 세포를 성장. 두 단계로이 작업을 수행합니다 :
   1. 제 들면 O / N은 ​​포화 성장 배지 5ml에 효모 세포 성장.
   2. 둘째 날의 끝에서 두 번째 O / N을 설정한다. 제 O / N의 경우, 제 O 발 / N 100 μL 1 ㎖, 2 ㎖의 이상 범위의 성장 배지 (100~150 ㎖ 중에 효모 세포 상이한 양의 접종에 따라 효모 세포가 될 필요가있을 때 ) 다음날 수....

결과

RNA와 노던 블로 팅을 추출하면서 정확하게 mRNA의 붕괴 속도를 측정하는이 프로토콜의 능력은 기술 된 RNase 자유로운 전사의 억제, 적절한 시점에서 효모 세포 수확, 및 이용에 따라 달라진다. 각각 불안정하고 안정적​​인 것으로 알려진 두 개의 제어의 mRNA에 대한 프로빙 실험을했다 확신을 제공합니다. 예를 들어, 이는 앤 mRNA를 미리 CYH2 모두를 검출 프로브로 프로빙함으로써 달성 될 수의 mRNA.도 2B는 전사 억제 후 상이한 시점에서 야생형과 NMD 돌연변이 효모 균주 CYH2 프리 mRNA를 소실을 보여준다 . CYH2 사전의 mRNA는 작동하지 NMD 통로 (upf1)와 효모 세포에 기능 NMD 통로 (UPF1) 상대적으로 빠른 효모 세포에서 분해된다.

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토론

mRNA의 합성과 새로운 합성의 부재 하에서 mRNA의 회전율을 모니터링 억제 자주 mRNA의 붕괴 속도를 측정하는데 사용되는 방법이다. S.에서 cerevisiae를는 RNA 중합 효소 II의 온도 민감성 대립 유전자를 사용하여 전사를 억제함으로써 mRNA의 붕괴 속도의 측정은 가장 자주 사용되는 방법 중 하나이다. 이 방법은 구체적으로는 RNA 중합 효소 II를 억제한다. 이 기술을 사용하여 mRNA의 붕괴 속도의 결정을위한 가장 중요한 단계는 다음과 같습니다 1) 효모 세포를 수확하기 전에, 그 전사가 39 ° C에서 문화를 유지하여 차단 된 보장; 2) 프로토콜의 RNA 추출 및 RNA 젤 전기 영동 단계 동안의 RNase없는 기술을 보장하기; 정규화 실험 치료가 예상대로 작동하는지로드 된 RNA의 같은 양을 확인하고 3) 제어 RNA를 사용; 4)의 재현성을 위해 3 회 이상 mRNA의 감쇠율 측정을 반복반감기 측정의 정확도 D.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
고속 원심분리기	Eppendorf	22628169
Mini Centrifuge	Fisher Scientific	05-090-100
Genescreen Plus 멤브레인	PerkinElmer	50-905-0169
혼성화 오븐	Fisher Scientific	95-0030-01
나노드롭 분광 광도계	Thermo Scientific	ND-8000
인광 스크린	GE Healthcare Life Sciences	28-9564-78
태풍 인광분석기	GE Healthcare Life Sciences	29004080
UV cross-linker	GE Healthcare Life Sciences	80-6222-31	대안적으로, 멤브레인은 80°도로 설정된 오븐에서 구워질 수 있습니다. 1시간 동안
NorthernMax 사전 혼성화/혼성화 완충액	Life Technologies	AM8677
rpb1-1 돌연변이를		균주 효모 균주는 실험실에서 얻거나 특정 배경

보유한 효모 으로 만들 수 있습니다.