화학요법 및 방사선 표준 치료의 림프구 정지 및 면역 조절 효과를 활용하여 T 세포 면역 요법의 항종양 효능을 향상시킬 수 있습니다. EGFRvIII 특이적 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포를 생성하고 교모세포종 표준 치료의 맥락에서 투여하는 방법을 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
Adoptive T cell immunotherapy는 악성 신경교종을 특이적으로 표적으로 삼고 제거하기 위한 유망한 전략을 제공합니다. T 세포는 신경교종 항원(CAR T 세포)에 특이적인 키메라 항원 수용체를 발현하도록 체외에서 조작할 수 있습니다. 양적으로 전달된 CAR T 세포의 확장과 기능은 표준 치료 화학 요법 및 방사선 요법의 림프구 정지 및 종양 제거 효과에 의해 강화될 수 있습니다. 신경교종 특이적 항원인 EGFRvIII를 표적으로 하는 CAR T 세포를 생성하고, 교모세포종 표준 치료의 쥐 모델과 결합할 때 그 효능을 평가하는 방법을 설명합니다. T 세포는 anti-EGFRvIII CAR 유전자를 포함하는 레트로바이러스 벡터로 transduction하여 조작됩니다. 종양을 가진 동물은 테모졸로마이드(temozolomide) 과정과 전뇌 방사선 조사에 의해 숙주 조건화(host conditioning)를 받으며, 이는 임상적 치료 표준을 모델링하기 위해 고안된 선량 요법입니다. 그런 다음 CAR T 세포는 프라이밍된 숙주에 정맥 주사로 전달됩니다. 이 방법은 표준 치료의 맥락에서 CAR T 세포의 항종양 효능을 평가하는 데 사용할 수 있습니다.
서론
교 아세포종 (GBM)은 가장 흔한 원발성 뇌종양이며 늘 치명적이다. 치료 화학 요법과 방사선 치료의 비 특정 표준과 함께 수술 적 절제에는이 병 1 명 적은 15 개월 실력 예후 결과, 악성 세포를 제거 할 수 없습니다. 대조적으로, 면역 요법은 특히 종양 세포를 표적으로하는 정확한 방법을 제공하고, 이에 부수적 인 독성 2-4의 위험 감소와 매우 효과적인 치료 플랫폼 역할을 할 가능성이있다. T 세포 항원 수용체 키메라 (자동차), 종양 면역을위한 다용도 전략을 제공 표현을 생체 공학적. 자동차 복잡한 전장 주요 조직 적합성 대신, 하나 이상의 세포 내 T 세포 신호 전달 분자 (들)과 항체의 세포 외 가변 영역을 융합시킴으로써 생성된다 (MHC)는 T 세포 수용체 5 -restricted. 항체와 같은 항원 인식 및 시상식이 모드반응성 항원 - 특이 T 세포는 MHC 인식의 부재하에 종양 항원에 반응 사실상 무한 항원 레퍼토리를 위해 적응 될 수있는 데에 대해 허용.
종양 항원에 대해 다양한 설계 CAR의 T 세포 병원 6-9 전임상 효능과 우수한 가능성을 보여 주었다. 구체적으로는, GBM의 맥락에서, CAR T 세포 플랫폼 타겟팅 표피 ....
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프로토콜
이 프로토콜은 쥐 10 10 7 CAR T 세포로 처리하여 각각의 실험 디자인에 기초한다. 이것은 108 CAR의 T 세포가 필요함을 의미한다; 수율은 생존의 손실을 계정에 5 × 10 7 -1 × 10 (8)에 의해 과대 평가되어야한다. 다음 프로토콜은 약 200 × 10 6 세포를 생성하기 위해 조정됩니다. 세포를 기존 KR158B 성상 세포종 또는 B16 흑색 종 세포주에서 개발 구일 설립 동계 EGFRvIII 양성 두개 내 종양 암컷 C57BL / 6 마우스에 정맥 내 투여한다. 부수적 CAR T 세포의 생성과, 담암 마우스 lymphodepletive TMZ 하였다 (60 mg / kg) 및 WBI (Gy를 16.5)의 임상 적 투여 량을 투여한다.
마우스는 유지 듀크 대학 의료 센터 (DUMC)에서 무균 조건에서 사육 하였다. 모든 동물 실험은 듀크 대학 기관에 의해 승인 된 프로토콜에 따라 수행 하였다알 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC).
담암 마우스에 테모 졸로 마이드 1. 관리
일 0-4 :
- 마우....
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결과
CAR T 세포 EGFRvIII CAR의 레트로 바이러스 벡터와 함께 형질 도입 (11)에 의해 생성된다. 이 벡터, MSGV1는 쥐의 줄기 세포 바이러스 (MSCV) 긴 터미널 반복, 확장 개그 지역 및 봉투 스플 라이스 사이트가 포함 된 SFGtcLuc_ITE4 벡터 (35)에서 개발 (스플 라이스 기증자, SD, 그리고 수용체 스플 라이스, SA), 바이러스 성되었다 포장 신호 (ψ). 쥐 CD8TM와 탠덤에서 인간의 안티 EGFRvIII 단일 체인 변수 단편 (scFv를) 139를 포함 EGFRvIII 자동차, CD28, 4-1BB 및 CD3ζ 세포 내 영역이, 하류 레트로 바이러스 벡터 NcoI 부위에 클로닝 하였다 (그림 3) .
형질 도입 후, CAR T 세포는 정량화 될 수 있으며, 유세포 phenotyped. EGFRvIII CAR T 세포 (SA / PE) 스트렙 타비 딘 - 피코 에리 트.......
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토론
여기에 설명 된 처리 타임 라인은 치료의 임상 표준 모델 및 차량 대체 요법에 대한 효과를 활용하도록 설계되었습니다. CAR T 세포의 투여 량, TMZ 요법 및 방사선 요법 투여는 생체 내에서 T 세포 활성, lymphodepletion, 및 종양 사멸에 강화하도록 변형 될 수있다. TMZ 섭생 호스트 myeloablation 적응 적 전송 및 셀 (30)의 증가 된 팽창을 수득 증가 될 수있다. 따라서 SOC의 암세포 살상 특성을 우회, - (6 Gy를 4) 단일 분수 전신 방사선 조사 (TBI) 또한, TMZ의 lymphodepletive 효과는 저용량에 의해 효과적으로 요약 할 수있다. 여기에 도포 된 방사선 요법의 60 Gy의 생물학적 등가 용량을 모방; 그러나, 분획 및 소수 투여 량의 수는 다른 임상 투여 (표 2)을 모방하기 위해 조정될 수있다. 중요한 것은,이 모델의 SOC는 외부 빔 방사선 종양 및 MA에 국소 적으로 전달하기보.......
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공개 사항
저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.
감사의 글
저자는 CAR 레트로바이러스 구조를 제공한 Laura Johnson 박사와 Richard Morgan 박사에게 감사를 표합니다. 저자는 또한 전뇌 방사선 조사를 위한 선량 측정에 도움을 준 Giao Ngyuen에게 감사를 표합니다. 이 작업은 NIH NCI 보조금 1R01CA177476-01의 지원을 받았습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| pCL-Eco 레트로바이러스 패키징 벡터 | Imgenex | 10045P | CAR 레트로바이러스 생성을 위한 도우미 벡터 |
| Concanavalin A | Sigma Aldrich | C2010 | T 세포 증식 및 바이러스 전달을 유도하는 비특이적 미토겐 |
| Retronectin | ClonTech/Takara | T100B | T 세포의 레트로바이러스 형질도입 |
| 촉진 Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668-019 | 형질주입 시약 |
| DMEM, 고포도당, 피루브산 | Life technologies | 11995-065 | HEK293 배양 매체 |
| RPMI 1640 | Life Technologies | 11875-093 | T 세포 배양 매체 |
| Opti-MEM I 환원 혈청 Medium | Life Technologies | 11058-021 | 형질주입 배지 |
| 200 mM L-글루타민 | Life Technologies | 25030-081 | T 세포 배양 배지 보충제 |
| 100 mM 나트륨 피루브산 | Life technologies | 11360-070 | T 세포 배양 배지 보충제 |
| 100X MEM 비필수 아미노산 용액 | Life technologies | 11140-050 | T 세포 배양 배지 보충제 |
| 55 mM 2-Mercaptoethanol | Life technologies | 21985-023 | 자유 라디칼을 제거하는 환원제 |
| 페니실린-스트렙토마이신(10,000 | 생명 기술 | 15140-122 | T 세포 배양 매체 보충제 |
| 겐타마이신 (50 mg/ml) | 생명 과학 기술 | 15750-060 | T 세포 배양 매체 보충제 |
| GemCell 미국 기원 태아 소 혈청 | 제미니 바이오 제품 | 100-500 | in vitro 세포 성장을 위한 성장 인자 및 영양소 제공 |
| 소 혈청 알부민 (BSA), 분획 V– 표준 등급 | Gemini Bio Products | 700-100P | 레트로넥틴 코팅된 플레이트에 레트로바이러스의 비특이적 결합 |
| 차단 Pharm Lyse (10x concentrate) | BD Biosciences | 555899 | 비장 세포 처리 중 적혈구 용해 |
| 70 μ m 멸균 세포 스트레이너 | Corning | 352350 | 장 세포 처리 중 큰 조직 입자를 걸러냅니다 |
| Poly-D-Lysine Corning 356469가 함유 된 100mm BioCoat 배양 접시 | HEK293 세포 접착을 촉진하여 transfection | ||
| [header] | |||
| Temozolomide | Best Pharmatech | N / A | 동결 건조 분말은 투여 당일에 준비됩니다. |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma Life Sciences | D2650 | 테모졸로마이드 |
| 식염수 | Hospira | IM 0132 (5/04) | 테모졸로마이드 및 케타민/자일라진용 용매 |
| Ketathesia HCl | Henry Schein Animal Health | 11695-0701-1 | 케타민 용액 |
| AnaSed | Lloyd Inc | N/A | 자일라진 멸균 용액 100 mg/ml |
참고문헌
- Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. N Engl J Med. 352 (10), 987-996 (2005).
- Kantoff, P., Higano, C., Shore, N., Berger, E., Small, E. Sipuleucel-T immunotherapy for castration-resistant prostate cancer. N ....
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재인쇄 및 허가
