병아리 융모대질막(CAM)은 면역결핍이며 혈관화가 심하여 종양 성장 및 혈관 신생의 자연스러운 생체 내 모델입니다. 이 프로토콜에서는 CAM 분석을 사용하여 3차원, 혈관화된 간세포 암종(HCC) 종양을 성장시키는 신뢰할 수 있는 방법을 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
병아리 융모 막 (CAM)는 CAM이 종양 이식을위한 이상적인 시스템을 만들고, 자연 면역 결핍 높은 혈관입니다 수정 후 7 일째에 의해 개발을 시작하여 하루 (12)에 의해 성숙. 또한, CAM은 그것을 종양 침윤과 전이를 연구하는 매력적인 모델을 만드는 등 피브로넥틴, 라미닌, 콜라겐, 인테그린 알파 (V) 베타 3, 및 MMP-2와 같은 세포 외 기질 단백질을 포함하고 있습니다. 과학자들은 긴 혈관 신생의 모델로서 사용하여 CAM의 생리 학적 장점을 가지고있다. 최근 CAM 검정 기본 체외 일 더 복잡한 동물 암 모델을 절충 각종 암 이종 이식 생체 내 모델 시스템으로 동작하도록 변형되었다. CAM 분석은 비용과 시간이 효과적이다 중요한 생물학적 시스템에서 종양 성장, 항 종양 치료 및 종양 친 분자 경로의 연구 허용한다. 여기서, 우리는 CAM의 젠의 개발을 기술최대 93 %의 배아 생존율하고 신뢰할 수있는 종양과 간세포 암 (HCC)의 ograft 모델은 세 가지 차원, 혈관 종양의 성장을 선도 걸릴.
서론
간세포 암종 (HCC)은 세계에서 1 암 사망률 제 3 주요 원인이다. 현재 간암 환자의 30 %가 잠재적으로 치료 수술 치료 (2)을받을 수 있으며, 전신 항암 화학 요법은 3 효과가 없습니다. 따라서, 새로운 간암 치료 용 임상 가압 충족해야하고, 새로운 에이전트의 효율적인 시험에 적합한 모델 시스템의 개발이있다. 병아리 융모 막 (CAM) 시험은 생체 내에서 잠재적 인 항암 약물을 시험의 재현성, 비용 효율적이고 빠른 중간 처리 방법을 제공한다.
CAM 혈관 형성 검정은 4를 연구하기 위해 광범위하게 사용되고있다. 또한 성공적 5 아교 모세포종, 췌장암 6 흑색 7-9, 10-11 및 골육종을 포함한 암의 종양 이종 이식 모델로 개발되었다. 모두 비켜 (12)과 전 비켜에서13 기술은 프로토콜과 프로토콜에 다양한 세부 사항, 문헌에 이용되어왔다. 50 % 11 ~ 14 - 캠 이종 이식 모델에 하나의 주요 과제는 25에 이르기까지 출판 된 병아리 배아 사망률, 계란의 조작 ....
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프로토콜
1. 계란 부화
- 팔일 된 무균 유정란을 얻습니다.
- 계란 트레이, 위쪽으로 향하게 스탬프 끝을 회전에 알을 놓고 계란 인큐베이터 내부의 회전 트레이를 배치합니다. 36 ° C에서 48 시간 50 %의 습도 알을 품어.
2. CAM을 삭제하고 계란 열기
- 인큐베이터에서 계란을 수집합니다. 달걀 랙에 넣어 달걀, 최대 측면을 각인하고, 층류 후드에 가져다.
- 룸과 후드 등을 끕니다.
- CAM의 혈관뿐만 아니라 공기 주머니를 노출 계란 캔 들러 가볍게 계란의 스탬프 끝을 잡고.
참고 : 계란 캔 들러가 개발 배아 및 관련 공기 주머니와 혈관을 시각화하는 데 사용되는 광원이다. - 두 개의 주요 혈관 사이에 연필 표시를합니다.
- 불을 켜고 PE에서 공기 주머니 (스탬프 끝) 위의 계란의 팁과 하나의 구멍에 하나의 구멍을 만들기 위해 멸균 고정 핀을 사용ncil 마크. 푸시 핀을 통해 모든 방법을 밀어하지 마십시오 3mm 주위에 구멍이 깊은 일반적으로 충분합니다.
- 불을 끄십시오. 공기 주머니 위의 구멍에 꽉 열린 끝을 눌러 안전 전구를 짠다. CAM은 연필 마크에서 멀리 쉘에서 드롭하는 원인,....
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결과
프로토콜의 주요 단계의 대표 사진이 여기에 표시됩니다. 그림 1A는 배아, 공기 주머니와 CAM의 혈관을 시각화하기 위해 캔 들러의 사용을 보여줍니다. 그림 1B-1c는 만들어 CAM을 삭제하는 과정을 보여 두 개의 구멍 후 안전 전구를 사용하여 부압을인가하고,도 1d는 성공적 연필 마크 구멍 하에서 큰 기포로 CAM 떨어 나타낸다.도 1E 및도 1F는 필요한 있도록 드레 멜 회전 공구의 사용을 보여 공기 거품과 내에서 노출 된 혈관 캠 셸에서 열린 창 위의 껍질에 상처.
입체, 종양 혈관 성공적 인간 간암 세포주 HUH7 (도 2A-2B)과 PLC / PRF / 5 (도 2C-2D)를 사용하여 배양 하였다. HUH7와 PLC / PRF / 5 세포에서 성장 종양 안녕하세요stologically .......
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토론
이 프로토콜의 몇 가지 주요 단계는 대부분 개선 된 배아의 생존뿐만 아니라 종양 성장의 신뢰성 증가를 차지하고있다. 공기 주머니에 흡입을 적용하여 멀리 쉘에서 CAM을 삭제하면 (계란, 무딘 절개 등으로부터 알부민을 제거하기 위해 바늘을 사용) 기존의 방법보다 덜 침습적입니다. 이 방법에 필요한 두 개의 작은 구멍을 만들기 위해 멸균 푸시 핀을 사용하는 프로토콜의 가장 어려운 부분이다. 너무 많은 힘을 사용하면 푸시 핀 오버 침투를 통해 CAM과 혈관에 손상을 줄 수 있습니다 또는 균열 또는 계란을 파괴 될 수 있습니다. 체험 연습 푸시 핀을 사용하여 캠을 떨어 뜨리고에서 첫 번째 시도 중에 실수를 최소화 할 수 있습니다 비 수정 된, 식료품-구입 계란에 작은 구멍을 확인합니다. 또, 에탄올 또는 셸을 청소하는 다른 살균제 용액의 사용은 배아 생존율을 감소하고, 피해야한다. 마지막으로, 멸균 실리콘 링을 사용하면 ℃로# 8220; "가축 종양의 높은 비율로 종양의 성장에 도움을 파종하고 기여 후 하나의 특정 위치에.......
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공개 사항
A.S. 연구자가 시작한 임상 시험을 지원하기 위해 Advaxis Pharmaceutical 회사로부터 자금을 지원합니다.
감사의 글
A.S.는 미국 국립보건원(NIH), 미국 국립치과 및 두개안면 연구소(5R03DE021741-02) 및 미국 국립 암 연구소(1K08CA154963-01A1)의 보조금으로 부분적으로 지원되었습니다.
Howard Hughes Medical Institute는 HHMI Medical Research Fellows Program을 통해 M.L.을 위한 자금을 제공했습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 프리미엄 배양 계란 | Charles River | N/A | http://www.criver.com/files/pdfs/avian/av_c_spf_egg_price_list.aspx |
| 계란 인큐베이터 | GQF | Hova-Bator 2362N | |
| 회전식 계란 트레이 | GQF | 1611 자동 계란 터너 | |
| 계란 캔들러 | Lyon | Hi-Power 950-070 | |
| Dremel 100 회전 공구(15/16 절단 휠 포함 | Dremel | 100-N/7 | |
| 멸균 집게, 푸시핀, 해부 가위, 스카치 테이프 | |||
| Matrigel | BD Biosciences | 356234 | |
| 극저온 바이알, 실리콘 와셔가 있는 외부 스레드 | Corning | 430659 | |
| Clostridium histolyticum | Sigma | C9891 |
참고문헌
- Sangiovanni, A., et al. Increased survival of cirrhotic patients with a hepatocellular carcinoma detected during surveillance. Gastroenterology. 126 (4), 1005-1014 (2004).
- Lopez, P. M., Villanueva, A., Llovet, J. M.
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재인쇄 및 허가
