여기서, 우리는 지속적으로 셀 기판 임피던스와 생균 영상 분석에 의해 비 침습성 방식으로 높은 시간 해상도를 가진 세포 부착 및 디 - 접착 공정을 정량화하는 프로토콜을 제시한다. 이러한 접근은 매트릭스 수정 및 접착 의존성 시그널링 이벤트들이 시간적인 관계에 의해 트리거 세포 접착 / 디 접착 공정의 역학을 보여준다.
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방법 논문
매트릭스 수정에 의해 유도 된 세포 접착 및 탈 부착의 실시간 변화를 측정 셀 기판 임피던스와 라이브 세포 이미징을 사용하여
이 논문에서
요약
초록
셀 매트릭스 접착 세포 형태를 제어 및 시그널링에 중요한 역할을한다. 세포 접착 매트릭스 (예, 마이 엘 로퍼 옥시 다제 및 다른 매트릭스 - 수정 산화제 / 염증 동안 방출 효소)를 방해 자극 질환의 수가 세포 기능, 표현형과 생존의 병리학 적 변화를 유발에 관여된다. 여기서는 (병리 생리 매트릭스 수정 자극으로 내피 세포 및 마이 엘 로퍼 옥시 다제를 사용하여) 셀 기판 임피던스와 생균 촬상 접근 용이 정확하게 세포 부착 및 매트릭스 변형에 의해 유도 된 디 밀착성 실시간 변화를 정량화하기 위해 이용 될 수있는 방법을 설명하는 높은 시간 해상도와 비 침습적 방법. xCELLigence 셀 기판 임피던스 시스템은 연속적으로 금 미세 전극 배열상에서 성장한 세포에서 세포 - 기판 계면에서 임피던스를 측정함으로써 세포 매트릭스의 접착 면적을 정량화한다. 의 이미지 분석 시간 경과 differen간섭은 최초 콘트라스트 영화 셀 매트릭스의 접촉 면적의 변화를 나타내는, 시간이 지남에 따라 각 셀의 투영 면적의 변화를 정량화한다. 두 기술은 정확하게 세포 접착 및 탈 부착 프로세스에 급격한 변화를 정량화. 미세 바이오 센서 어레이에 관한 셀 기판 임피던스는 견고한 높은 처리량 측정 용 플랫폼을 제공한다. 라이브 세포 이미징은 세포 기질 임피던스 측정에 의해 정량 형태 학적 변화의 특성과 역학에 대한 추가 세부 사항을 제공 분석한다. 이러한 접근법은 상보 세포 내 세포 외 기질 성분의 myeloperoxidase가 촉매 작용 산화가 빠르게 변형 세포 부착, 형태 변화 및 내피 세포에서 트리거 시그널링 방법에 유용한 새로운 통찰력을 제공한다. 이러한 접근은 다른 매트릭스 수정 자극 및 관련 자기편 세포 (예를 들면, 상피 세포)에 대한 응답으로 세포 접착 역학 연구를위한 적용 할 수 있습니다.
서론
세포와 그 주변의 세포 외 기질 간의 안정적인 접착 접촉은 조직의 항상성의 유지 보수를 위해 필요합니다. 예를 들어, 혈관 내 피하 매트릭스 내피 세포 유착은 내피 층의 무결성 및 규제 반투과성 한 혈관 장벽으로서의 기능 항상성을 유지하는데 중요한 역할을한다. 액틴 세포 골격 기계적 중앙 관한 액토 마이 오신의 인장력에 저항하여 세포막의 위치를 결정하는데 중요한 역할을하는 세포 - 매트릭스 계면에서 세포 - 매트릭스 부착 및 접착제 접점 부위에서 매트릭스 분자 접착에 결합된다. 반드시 세포 - 매트릭스 계면에서의 힘의 균형이 급속히 인 사건 변경 셀 매트릭스 밀착성을 변경 세포 외 자극은 "외기 시그널링"의 전달의 결과로, 메카 성 신호 전달 단백질에 의해 "감지". 이 크로스 토크 내기싸우는 세포 및 주변 세포 외 기질은 세포의 모양, 운동성, 함수, 증식 및 생존을 조절이 중요한 역할을한다.
다양한 병태 생리적 과정 (배아 발달, 염증, 상처 복구 및 암전)은 매트릭스 - 산화제 분해 및 / 또는 효소에 의해 3,4- 접착제 매트릭스 기판의 동적 리모델링을 특징으로한다. 예를 들어, 혈관 내 피하 기질 단백질을 접착 (예를 들어, 피브로넥틴은) 때문에 반응 ....
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프로토콜
1. 일반 내피 세포 배양
- 문화 소 대동맥 내피 세포 젤라틴 코팅 조직 배양 플라스크에 (통로 4-9) (코트 조직 문화 표면을 실온에서 15 분 동안 PBS에서 / V 젤라틴 w 0.1 %)와 EGM-2 총알 EGM-2 미디어 ( 5 % 소 태아 혈청, 성장 인자 및 하이드로 코르티손을 제외하고 제조업체에서 제공하는 모든 보조제)를 포함하는 키트.
- / PBS에서 EDTA V 37 ° C에서 w 0.05 % w / v 인 트립신 / 0.02 %로 처리하여 수확 세포 : 세포가 거의 합류 아르 (4 분할 약 삼일 포스트 파종 한 후). 대부분의 세포가 분리 한 후, 트립신 다음 원심 분리기 (100 XG, 5 분)을 해소하기 위해 전체 EGM-2 미디어를 추가 할 수 있습니다.
- 이 기판에 설립 부착 (실험 2 : 3 절)와 내피 세포의 후속 탈 부착 : 피브로넥틴에 내피 세포의 드 노보 부착에 관한 연구 (제 2 실험 1)에 대한 세포를 준비합니다.
- 세척 수확일단 무 혈청 배지 199 / V 소 혈청 알부민 (BSA)과 다시 원심 분리기 (100 XG, 5 분) 1 W %를 함유하는 세포와.
- w 혈청 배지 (199) 함유 1 %에서 셀을 다시 중지 / BSA V에서 2.5 × 1....
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결과
기본 상 MPO 매개 피브로넥틴 산화 (실험 2) 내피 세포 현탁액. 시딩에 대한 응답으로 최대한의 세포 부착 및 확산에 MPO (무료) 피브로넥틴 또는 MPO-베어링 피브로넥틴 결과에 피브로넥틴에서 내피 세포의 탈 부착의 실시간 정량 2 시간 내에, 세포 기질 임피던스 측정 (도 3a) 세포에서 지수 값 plateauing 것으로 판단. MPO 매개 피브로넥틴의 산화 실험 1에 설명 된 프로토콜에 따라 수행 실험에서 세포 파종 이전에 개시 될 때 세포 부착 및 확산이 초기 단계는 현저하게 감소 (데이터가 표시되지; 세부 사항 (9)를 참조하십시오). 최대 세포 부착 네이티브 또는 MPO 함유 피브로넥틴에 확립되면, MPO - 촉매의 HOCl 의해 매개 피브로넥틴 산화 타겟팅 (MPO의 공동 기판 H의 첨가에 의해 개시를 2 O 2) Sur에서 급격.......
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토론
세포 부착 및 매트릭스 탈 접착 공정은 셀 기판 임피던스와 생균 분석 이미징을 사용하여 높은 시간 해상도와 실시간으로 정확하게 정량 할 수있다. 종점이 불량 시간 해상도를 제공 세포 부착, 이러한 분석을 통해 실시간 방식은 중요한 이점을 제공한다. 정확하게 높은 시간 해상도와 빠른 탈 부착 반응을 정량화하여, 이러한 분석은에 중요한 통찰력을 제공 할 수있는 방법 형태 응답 행렬 수정에 규제 방법과 병행하여 관련 생화학 적 분석에서 측정 된 접착 의존성 세포 신호 전달에 그들이 영향 (예를 들면, 웨스턴 블로 팅).
최근 연구에서, 이러한 방식은 내피 세포의 탈 부착을 트리거하는 피하 행렬의 MPO - 매개 산화 신규 역할을 계시하는데 사용하고 있었다 : (ⅰ) 탈 부착 율은 사전에 결정적으로 의존하는 것을 기존의 액토 마이 오신수축 (참조,도 3B 및 3C) 및 (ii) 세포 - 매트릭스 접착의 손실이 Src에 의존 paxilli.......
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공개 사항
저자는 수 있도록 공개 전혀 없습니다.
감사의 글
이 연구는 NHMRC(National Health and Medical Research Council) SRT(Project Grant 568721)와 부분적으로 UNSW 의학부 교수 연구 보조금(MDR)의 지원을 받았습니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 96 웰 골드 세포-기질 임피던스 미세전극 어레이 | ACEA Biosciences / Roche | E-Plate 96 | 일회용 플레이트는 xCELLigence 시스템에서 세포 기반 분석을 수행하는 데 사용됩니다. |
| 블레비스타틴 | Sigma | B0560 | 비근육 미오신 II |
| 소 대동맥 내피 세포의 선택적 억제제, 동결 보존 | Lonza | BW-6001 | |
| 소 혈청 알부민 | 시그마 | 05470 | |
| EGM-2 BulletKit | Lonza | CC-3162 | 내피 세포 성장 매체 키트 |
| Fibronectin, 동결 건조 분말 | Sigma | F-4759 | 소 플라즈마 |
| 불소 35mm 유리 바닥 세포 배양 접시 | World Precision Instruments | FD35-100 | 소 피부의 젤라틴 이미징을 위한 광학 품질의 유리 바닥이 있는 세포 피부 |
| Sigma | G9391 | 세포 배양 하층, | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Life Technologies | 14025076 | |
| 과산화수소 | Merck | 107298 | |
| Medium-199 | Life Technologies | 11150-059 | 혈청 세포 배지 |
| 메티오닌 | Sigma | M9500 | myeloperoxidase |
| Myeloperoxidase, Human Polymorphonuclear Leukocytes | Millipore | ||
| RTCA MP Instrument / xCELLigence cell substrate impedance system | ACEA Biosciences / Roche Relica | Analyzer, RTCA (Multiple Plate) MP Station 및 RTCA Control Unit | |
| Trypsin-EDTA (0.5%) | Gibco | 로 구성되어 있습니다.15400-054 |
참고문헌
- Wu, M. H. Endothelial focal adhesions and barrier function. J Physiol. 569, 359-366 (2005).
- Geiger, B., Yamada, K. M. Molecular architecture and function of matrix adhesions. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3, (2011).
- Rees, M. D., Kennett, E. C., Whitelock, J.....
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재인쇄 및 허가
