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방법 논문

대 식세포 콜레스테롤 고갈과의 식균 작용에 미치는 영향

12.4K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/52432

⸱

2014년 12월 19일

 ,  ,  , 
1Department of Molecular Genetics and Microbiology, Stony Brook University

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

이 기사에서는 Cryptococcus neoformans에 대식세포를 감염시키는 프로토콜에 대해 설명합니다. 또한 대식세포에서 스테롤을 고갈시키는 방법에 대해서도 설명합니다. 이러한 프로토콜은 체외 진균 감염을 연구하고 이러한 감염에서 스테롤의 역할을 조사하기 위한 지침을 제공합니다.

초록

크립토는 속 크립토의 병원성 곰팡이에 의해 발생 생명을 위협하는 감염입니다. 감염 깊은 폐에 복제 할 수 포자의 흡입에 발생합니다. 크립토 식세포의 탐식 수막뇌염 치명적인 질병을 일으키는 중추 신경계로 확산 할 수있는 방법 중 하나이다. 따라서, 크립토 식세포 간의 관계에 대한 연구는 감염의 진행을 이해하는 것이 중요하다. 본 연구는 C.에 의해 대식 세포 감염을 연구하는 단계별 프로토콜을 설명합니다 체외에서 콕 쿠스 네오 포르 만. 이 프로토콜을 이용하여, 호스트 - 호스트 상호 작용에 대한 병원체 스테롤 역할이 검토되고있다. 상이한 농도의 메틸 - 시클로 덱스트린 (MCD)는 뮤린 세망 육종 식세포 같은 세포주 J774A.1에서 콜레스테롤을 고갈하는데 사용되었다. 콜레스테롤 고갈을 확인하고 시판 availabl를 사용하여 두 정량전자 콜레스테롤 정량 키트 및 박층 크로마토 그래피. 콜레스테롤 세포 고갈 Lipopolysacharide (LPS) 및 인터페론 감마 (IFNγ)를 사용하여 (1)의 활성화 및 이펙터 대 표적 비율 항체 - 옵 소닌 크립토 콕 쿠스 네오 포르 만 스 야생형 H99 세포를 감염시켰다 1. 감염된 세포는 C.와 배양 2 시간 후 관찰 하였다 콕 쿠스 네오 포르 만 그들의 균성 지수를 계산 하였다. 콜레스테롤 고갈 식세포 인덱스 상당한 감소 결과. 제시된 프로토콜은 실험실 환경에서 악성 프로세스의 개시를 모방하고 감염성 숙주에 지질 조성물의 역할을 연구하기에 편리한 방법을 제공한다.

서론

탐식 세포 외 실체가 숙주 세포에 의해 내재화되는 과정입니다. 또한 병원균에 대한 방어 면역 체계의 병기 키 무기이지만, 프로세스는 종종 내재화 및 본체 (1) 전체에 확산을 허용하도록 병원균 전복 될 수있다. 탐식 숙주 세포의 세포 골격 재 배열을 통한 부착과 말림을 초래할 여러 시그널링 이벤트에 의해 매개된다. '전문'식세포는 첨부 파일과 병원균을 삼켜과 phagosome 2를 형성 멜리의 형성에 대한 신호를 침입 병원균의 표면에 opsonins로 인식하고 결합 할 수 있습니다. 소위 '전문가'식세포 중 대 식세포이다. 대 식세포는 대부분의, 추구와 질병의 원인이 에이전트를 제거, 손상된 조직을 복구 및 염증을 매개하는 등 보호 기능을 수행 고도로 전문화 된 세포이다식균 작용 1,2의 과정을 통해 이들.

크립토 콕 쿠스 네오 포르 만은 크립토로 알려진 심각한 질병을 일으키는 병원성 효모의 종입니다. 크립토 포자는 호스트에 의해 흡입 일반적으로 무증상 폐 ​​감염이 발생할 수 있습니다. 노광이 매우 만연이라고 사료된다; 조사 된 모든 사람들은 크립토 다당류 glucuronoxylomannan 및 다른 연구에 대한 항체를 가지고 있다는 클리닉 브롱스 레바논 병원 센터에서 발견 된 소아 감염성 질환 61 어린이의 샘플은 모두 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV) 감염되지 않은 감염된 성인 3 유병률을 보여 주었다 4. 폐포 대 식세포가 성공적으로 명확 병원체 폐 감염에 대부분의 경우 응답의 첫 번째 줄입니다. 그러나, 면역 개인 (예를 들면, HIV 및 AIDS 환자)에 효모는 대 식세포 내에서 생존 할 수있다. 이들에이 경우, 대 식세포는 병원체의 복제 틈새의 역할을 할 수 있으며 5 치명적인 질병해진다 중추 신경계 (CNS)의 보급에 용이하게 할 수있다 - 8. 11 - 그것은 식세포 심지어 "트로이 목마"모델 3,9- 통해 혈액 뇌 장벽을 통과하는 효모 돕는 수막에 직접 효모를 전달할 수 있다고 생각된다. 따라서, 탐식 과정과 특히 크립토 감염에 영향을 끼치는 요인을 이해하는 것이 중요하다.

15 - 다른 병원체 시스템의 이전 작업은 식균 작용 (12)에 중요한 역할을 갖는 것으로 콜레스테롤에 의해 형성 콜레스테롤과 지질 뗏목을 가리 킵니다. 콜레스테롤은 포유 동물 세포에 가장 풍부한 지질 종 및 25 포함 - 포유류 세포 막 (16)의 50 %. 그것은 BIOP를 변조하는 역할을하는 것으로 밝혀졌다자신의 강성 (17)을 변경하여 막 A. 물리적 특성. 콜레스테롤과 스핑 고리 피드 함께 지질 뗏목으로 알려진 막 내 지질 마이크로 도메인을 형성한다. 18 - 지질 래프트은 카베 올래의 형성뿐만 아니라, 신호 (16)의 특정 유형에 대한 격리 영역을 제공하는데 관여하는 것으로 밝혀졌다. 그들의 작은 크기 때문에, 이것은 생체 내에서의 지질 래프트를 연구하기가 어렵다. 지질 래프트의 역할을 연구하기위한 유용한 방법은 성분을 변경하는 것이다. β 메틸 시클로 덱스트린 (MβCD)는 포유류 막으로부터 콜레스테롤을 고갈 밝혀졌다 일반적 지질 래프트 (18)의 역할을 연구하기 위해 사용되는 화합물이다.

이러한 프로토콜에서는, 숙주 세포 막으로부터 콜레스테롤을 고갈 및 C.를 탐식하는 숙주 세포의 능력 고갈의 효과를 정량화하는 방법을 제시 체외에서 콕 쿠스 네오 포르 만. 이 절차는 세포 배양 techniq 이용한다감염 모델로 세포주 (J774A.1) 같은 불멸의 대 식세포에 단말. 콜레스테롤 고갈 스테롤의 크기에 특정 소수성 코어를 가지고 있으며, 콜레스테롤 막 (19) 밖으로 묘화하는 싱크 역할을 할 수 MβCD에 노출에 의해 이루어졌다. 콜레스테롤 고갈 정량적 시판 키트를 사용하고 질적으로 박층 크로마토 그래피 (TLC) (20) 다음에 수정 된 후 Bligh-다이어 지질을 추출하여 측정 하였다. . (23) - 탐식은 대 식세포를 활성화하기위한 인터페론 γ 및 리포 폴리 사카 라이드의 칵테일 혼합 옵 소닌 효모의 문화 세포주를 감염에 의해 측정 된 크립토는 glucuronoxylomannan (GXM) 항체 (21)를 사용하여 옵 소닌했다. 염색 현미경 실험은 식균 작용의 정도를 평가하기 위해 세포를 시각화 및 포식성 지수 계산을 허용했다. 이 프로토콜 D, 함께 촬영생리적 과정 지질 조성의 변화를 통합 기본적인 방법 escribes.

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프로토콜

MβCD와 J774A.1 세포의 1. 콜레스테롤 고갈

  1. 멸균 생물 안전성 캐비닛, 시드 105 J774A.1 식세포 유사 세포 웰 당 10 % 소 태아 혈청 (FBS)이 보충 된 둘 베코 변형 이글 중간 (DMEM) 200㎕의 1 %에서 96 웰 세포 배양 접시에 페니실린 / 스트렙토 마이신 (P / S). 37 ° C에서 품어 5 % CO 2 O / N.
  2. 세포 단일 층에서 미디어를 제거하고 여과 또는 멸균 된 1 배 인산 완충 식염수 (PBS)로 두 번 세포를 씻으십시오.
  3. 제어로 원하는 농도 (10 PBS에서 MM 또는 30 mM의) 또는 1X PBS에서 MβCD 솔루션의 200 μl를 추가하고 진탕 37 ° C에서 30 분 동안 배양한다. 즉시 절차에 따라 시판 키트와 함께 정량 분석​​을 실온에서 뜨는 및 예약을 제거합니다.
  4. 1X PBS 또는 혈청 무료 DMEM으로 세포를 2 ~ 3 배를 씻고 pipetti에 의한 감염이나 세포를 Lyse 계속박층 크로마토 그래피 또는 키트와 분석을위한 탈 H 2 O와 2 ~ 3 배 겨.
    참고 : 시판 콜레스테롤 정량 키트를 사용할 수있는 콜레스테롤 고갈 이어. 자세한 내용은 자료 섹션을 참조하십시오. 작성된 제조업체의 지침을 따르십시오.

박층 크로마토 그래피에 의한 콜레스테롤 내용 2. 관측 (TLC)

  1. 석유 에테르 용액을 아세톤으로 2 회 및 한 번 탱크 TLC 세탁 : 디 에틸 에테르 : 아세트산 (65 : 30 : 1, 부피 기준). (부피 기준으로 1~65 : 30) 용액 및 / N을 O두고 아세트산 : 디 에틸 에테르 : 석유 에테르로 적신 탱크.
    참고 : 유기 용매는 항상 증기 흡입을 방지하기 위해 흄 후드를 사용해야합니다. 장갑 및 실험실 코트는 항상 착용해야합니다. 아세트산은 강산과주의를 요합니다.
  2. 6 잘 가전에 잘 당 멸균 바이오 안전성 캐비닛에, 씨 (10) 6 J774A.1 대식 세포와 같은 세포10 % FBS와 1 % P / S가 보충 된 DMEM 따뜻한 5 ㎖의 부피 LL 배양 플레이트. 5 %, 37 ° C에서 품어 CO 2 O / N.
  3. 1.4 더 잘 크기를 고려하여 적용 할 수있는 200 ㎕를 1 ml의 대체 - 단계 1.2에 따라 콜레스테롤의 대 식세포를 고갈.
  4. , 각 웰에 트립신 - EDTA의 500 μl를 추가, 37 ℃에서 3 분 동안 품어 부드럽게 세포 스크레이퍼와 세포를 긁어.
  5. 미세 원심 분리 튜브로 옮기고, 10 % FBS와 1 % P / S가 보충 된 DMEM 따뜻한의 추가 500 μL를 추가한다.
  6. 300 XG에서 5 분 동안 세포를 스핀 상층 액을 제거합니다.
  7. 세포 펠렛에 10 % FBS와 1 % P / S가 보충 된 DMEM 따뜻한의 추가 500 μl를 첨가하고, 피펫 팅 상하로 재현 탁 신중.
  8. 세포의 10 μl를 제거하고 혈구에 세포를 계산합니다. 각 샘플로부터의 세포 농도를 정상화 유리관 셀들의 동일한 수를 추가한다.
    참고 :이 단계에서, 한 5 월최종 지질 농축 된 추출물을 수득 동일한 치료군에서 세포를 결합하도록 선택.
  9. 원심 분리기 세포 미디어 RT에서 5 분 300 XG에 제거합니다.
  10. 메탄올과 소용돌이 2 ㎖를 추가합니다. 그런 다음, 클로로포름과 소용돌이 1 ㎖를 추가합니다. 단상에서 확인 솔루션을 만들기 위해 위상 상태를 확인합니다.
    참고 : 튜브가 4 ° CO / N에 저장할 수 있습니다.
  11. 실온에서 10 분 동안 1,700 XG에 원심 분리기 새로운 튜브에 뜨는을 전송
  12. dH보다 2 O 1 ml의 클로로포름과의 추가 1 ML을 추가 두 번 30 초 동안 소용돌이. 실온에서 5 분 동안 1,700 XG에 원심 분리기.
  13. 민감한 균형 유리관을 달아 공지 중량의 유리관에 하층을 전송할 유리 파스퇴르 피펫을 사용한다.
  14. 건조 (약 2 시간)까지 원심 증발기에서 지질을 건조시킵니다. 건조 지질와 튜브의 무게를 측정하고 건조 지질 무게를 계산한다.
    주 : 건식 지질 TLC를 수행 할 준비가 될 때까지 -20 ° C에 저장 될 수있다.
  15. (- 50 μL 일반적으로 20)와 실리카 TLC 판에 희석 된 지질의 부하 20 μL 지질의 농도를 정상화하는 데 충분한 클로로포름에 건조 지질을 희석. 부하 (20)를 표준으로 클로로포름 20 μL 희석 μg의 콜레스테롤.
  16. 포화 TLC 탱크로 건조 TLC 판을 추가하고 플레이트 에지 전에 1cm까지 마이그레이션 할 용매 수 있습니다. 탱크에서 TLC 플레이트를 제거하고 약 5 분을 건조 할 수 있습니다.
  17. 마이그레이션을 확인하기 위해 요오드 증기 탱크에 배치하여 지질을 시각화. 제거 및 관광 명소가 약 10 페이드 할 수 - 후드 15 분.
    참고 : 요오드 흡입의 위험이다. 항상 흄 후드를 사용합니다.
  18. 탈 H 2 O 60 ㎖, 황산 4 ㎖, 망간 클로라이드 630 mg을 메탄올 60 ㎖에 결합하여 중성 지질 염색 용액을 준비한다.
  19. 조심스럽게 천천히 트레이에 중성 지질 염색 액에 TLC 판을 찍어 실리카 리터를 벗기없이 제거이어.
    참고 : 중성 지질 염색 액을 여러 번 재사용 할 수있는 등 용지함에서 용지를 검색 할 수 있으며, 나중에 사용하기 위해 병에 다시 배치.
  20. 모든 거품이 사라질 때까지 판 실온에서 후드 아래에 건조하도록 허용합니다. 원하는 색상에 열 블록 160 ° C로 설정하고 문자에 TLC 판을 가열한다.
    주 : 안과 같은 공공 LS 농도계 프로그램 지질 샘플과 비교 까맣게 대역을 정량화하는데 사용될 수있다.

C.와 대 식세포의 3. 감염 콕 쿠스 네오 포르 만 스 (H99)

  1. 멸균 생물 안전성 캐비닛, DMEM 웰에 200㎕를 96 웰 세포 배양 플레이트에 시드 (10)가 당 5 대 식세포 유사 세포는 10 % FBS와 1 % P / S가 보충. 37 ° C, 5 % CO 2, 5 % CO 2 O / N에서 인큐베이션.
    참고 : 감염도 유리 수행 할 수 있습니다 쉽게 이미징을위한 공 초점 요리를 바닥; 모든 금액은 동일하게 유지됩니다.
  2. C.의 문화를 성장 콕 쿠스 네오 포르 만 스 (H99)강타 판에서 얻은 하나의 식민지로 YNB 10 ㎖를 접종하고 진탕 30 ° C에서 / O N 그것을 배양하여.
  3. 씻고 C.를 계산 콕 쿠스 네오 포르 만 스 (H99) 세포.
    1. 원심 분리기 C. 4 ℃에서 10 분 동안 1,700 XG에 콕 쿠스 네오 포르 만 스 O / N 문화.
    2. 용지를 제거하고 폐기합니다. 1X PBS의 5 ml의 세포를 씻으십시오. 4 ℃에서 10 분 동안 1,700 XG에 원심 분리기.
    3. PBS를 제거하고 여과 1X PBS 5 ㎖로 세척한다. 4 ℃에서 10 분 동안 1,700 XG에 원심 분리기. 이 단계 2 번 이상 반복합니다.
    4. PBS를 제거하고 1X PBS 5ml에 재현 탁.
    5. 세척 문화의 500 희석 : PBS의 일련의 희석은 1를 획득 할 수 있습니다.
      1. 1:10 희석을 얻기 위해 1X PBS 900 ㎕를 원래 시료 100 μl를 추가합니다.
      2. (100) 희석 : 1을 얻기 위해 1X PBS 900 ㎕를 1:10으로 희석 시료 100 μl를 추가합니다.
      3. 500 diluti : 1을 얻기 위해 1X PBS 800 μL에 100 희석 샘플 : 1의 200 μl를 추가에
    6. (1)의 10 μL 가라 : 500 희석하고 세포의 수를 계산하는 데에 혈구 계산.
  4. C.를 대 식세포를 활성화하고 opsonizing 위해 일하는 솔루션을 준비합니다 콕 쿠스 네오 포르 만.
    1. 990 μl의 10 μl를 추가하여 원액에서 LPS와 IFNγ의 100 배 희석.
      참고 : LPS와 IFNγ는 식세포 흡수를 향상시키기 위해 사용되지만 식균 작용이 필요하지 않습니다. 대 식세포의 살 진균 활성에 관심이있는 경우, 감염에 앞서 진탕하면서 37 ℃에서 활성화 O / N을 수행한다.
    2. 샘플 당 희석 된 7.5 ㎕의 LPS, IFNγ 희석의 1.25 μL, GXM 항체 1.25 μL 및 C.의 체적을 결합 1.25 × 10 5 세포를 제공 콕 쿠스 네오 포르 만의 문화. 10 % FBS와 1 % P / S가 보충 된 DMEM와 샘플의 수를 곱한 250 μL 최대 용적을 가지고.
    3. 소용돌이와 진탕 37 ° C에서 20 분 동안 솔루션을 품어.
      참고 :옵 소닌 단계와 동시에 수행 할 수 있습니다 - 콜레스테롤 고갈 (1.4 1.2 단계). 옵 소닌 세포가 최적 단계 3.4.3 배양 한 다음 20 분보다 더 이상 사용해야 같이 작업 솔루션을 결합하기 전에 대식 세포를 치료해야합니다.
  5. 대 식세포를 감염
    1. 세척 대 식세포 두 번 혈청 무료 DMEM와 옵 소닌 C. 200 μl를 추가 콕 쿠스 네오 포르 만이 아니라 각 솔루션을 작동합니다.
    2. 37 ° C에서 2 시간 동안 품어.
  6. 수정 및 얼룩 세포
    1. 용지를 제거하고 DMEM으로 세포를 제거하는 과정을 2 회 반복한다.
    2. 공기는 10 분 동안 세포 단일 층을 건조하고 세포를 해결하기 위해 얼음 냉 메탄올 200 μL를 추가합니다.
    3. 실온에서 15 분 동안 품어 남아있는 메탄올을 제거합니다.
    4. 10 배 김사 200 μl를 추가하고 RT에서 5 분 동안 품어.
    5. 오프 캡을 탈 이온수 건조 O / N로 3 회 - 2 씻으십시오.
      참고 : 이미징은 주 followi에 다음날 수행 또는 최대 수NG 염색.
  7. 시각화 및 개수
    1. 현미경을 사용하여, (물론 당 150 카운트 같은 치료의 2가있는 경우) 데이터 포인트 당 300 세포를 계산하고 침몰 크립토 셀의 감염된 대 식세포의 수와 번호를 적어 둡니다.
      참고 : 상태별로 데이터 포인트 사용 당 2 판을 샘플링도 확인 판에 3 비 중첩 영역을 선택하고 영역 당 50 셀을 계산합니다.
    2. C.의 평균 숫자로 감염된 대 식세포의 비율을 곱하여 계산 균성 인덱스 대 식세포 당 콕 쿠스 네오 포르 만. 1X PBS의 비율이 제어 처리로 값을 표현함으로써 식세포 인덱스를 정상화. 여러 실험 후 평균값과 식세포 지수 경향을 결정하기 평균의 표준 편차를 계산한다. 의미를 결정하기 위해 학생 t-test를 사용합니다.
    3. 1000 배 또는 400 배의 배율로 세포의 현미경 사진을 가져 가라.

4. 트리 판 블루 분석

  1. 멸균 생물 안전성 캐비닛, 시드 106 식세포 유사 세포 당 웰의 체적 6- 웰 세포 배양 접시에 5, 10 % 소 태아 혈청과 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신이 보충 된 둘 베코 최소 필수 배지 (DMEM) ml의 . 5 %, 37 ° C에서 품어 CO 2 O / N.
  2. 물론 더 큰 크기를 고려하여 해당되는 200 μL가 2 ㎖에 대입 1.4 - 1.2 단계를 수행하여 콜레스테롤 식세포를 고갈.
    참고 : 1X PBS뿐만 아니라 치료 전에 긁어 제어로 처리하는 컨트롤을 포함해야합니다.
  3. 각 웰에 1X PBS의 500 μl를 추가하고 부드럽게 세포 스크레이퍼와 세포를 긁어. 미세 원심 튜브에 전송하고 부드럽게 피펫 아래로 세포를 일시 중지합니다.
  4. 4 % 트리 판 블루의 1 μL와 세포와 얼룩의 10 μl를 제거합니다.
  5. 혈구에 세포를 계산하고 다음 식을 이용하여 생존을 계산 : % 생존 = [1 - (블루 세포 / 총 세포)]치료했다 컨트롤에 X 100 표준화 값. 여러 실험 후 평균값과 생존의 경향을 결정하는 표준 편차를 계산한다. 의미를 결정하기 위해 학생 t-test를 사용합니다.

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결과

콜레스테롤 고갈

1X PBS 대조군에 비해 Amplex 레드 콜레스테롤 분석 키트 제조업체의 지침에 따라 프로토콜의 단계 1.3에서 예약 된 상층 액의 분석은 MβCD 처리 샘플 콜레스테롤의 높은 농도를 산출한다. 세포의 종류와 MβCD 농도 사용 콜레스테롤 고갈에 따라 다를 수 있습니다. 10mM의 MβCD 처리 J774 들어, 약 50 %의 고갈이 관찰되었다. 고갈 1.4 단계 (도 1)에 수집 된 상등액 및 세포 용해질로부터 얻은 값을 사용하여 계산 될 수있다.

TLC 분석을 이용하여 세포 용 해물은 MβCD (도 2a)의 농도가 증가함에 따라 처리 된 세포에서 콜레스테롤의 염색에서 현저한 감소를 보여준다. TLC의 비중계 분석은 정량적 분석 (그림 2B)와 비슷한 경향을 보여줍니다. 후 Bligh-다이어 방법은 조 추출액을 준다총 지...

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토론

이 프로토콜과 협력 이는 포유류 세포를 C. 도금 및 opsonizing 때 정확한 세포 수를 구하는 것이 중요 콕 쿠스 네오 포르 셀. 이 시험 사이의 변화를 최소화하고 정확한 일 보장 : 연구를 통해 이펙터 비율 1 목표. 또한 절차 사이에 RT에서 휴식에서 옵 소닌 효모 세포 또는 처리 된 대 식세포를 방지 콜레스테롤 고갈과 감염의 타이밍을 조정하는 것이 중요하다. 감염이 시작하기 전에 긴 대기 기간은 항체의 옵 소닌의 손실 또는 고갈 콜레스테롤의 보충가 발생할 수 있습니다. 실험 정밀도했으면 결론 식세포 콜레스테롤의 역할에 대해 식별 될 수 있도록 데이터를 분석한다.

기술의 한계 콜레스테롤 결핍 세포 같은 식세포의 탐식 인덱스를 저하시키는 구체적인기구와 같은 임의의 결론을 방지하고, 이는 EF하는지 확실에는 영향으로 인해 콜레스테롤 때문에, 또는 보조기구에 직접입니다. 이 정맥을 따라 추가 작업은 이러한 Fcγ 수용체와 보체 수용체 등의...

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공개 사항

저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

이 작품은 NIH 보조금 MDP에 AI56168, AI71142, AI87541 및 AI100631에 의해 지원되었다. 마우리 치오 델 포에 타는 감염증에 버로우즈 웰컴 탐정이다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
클래스 II 유형 A2 생물 안전 캐비닛Labconco3460009
J774A.1 세포주ATCCTIB-67이 냉동 상태로 도착합니다. 배양에 대한 ATCC 지침을 참조하십시오.
둘베코' s Modified Eagle MediumGibco11995-0654 °에 저장; C와 37까지 따뜻합니다. C 사용 전
HI Fetal Bovine Serum Performance PlusGibco10082-147-20°C에서 냉동 보관 & DMEM에 첨가하기 전에 C 및 해동
페니실린-스트렙토마이신(10,000 U/ml)Gibco15140-122를 흡수하는 데 사용
Fisher Scientific모델 # 3530
96-웰 배양 접시Corning Inc. Costar3595
10x 인산염 완충 식염수Fisher Scientific BioReagentsBP3994사용하기 전에 1배로 희석하고 여과하거나 오토클레이브하십시오.
메틸-&베타;-사이클로덱스트린시그마, 생명과학C4555-10G10mM 및 30mM 농도의 용액을 만들기 위해 1x PBS에 용해
오비탈 셰이커,Labline,
Amplex, 적색 콜레스테롤 분석 키트, Life Technologies, 분자 프로브,A12216콜레스테롤 분석을 위한 모든 시약이 키트에 포함되어 있습니다. 제조업체 지침을 따릅니다.
96-웰 블랙 어세이 플레이트Corning Inc. Costar3603
FilterMax 마이크로플레이트 리더분자 장치모델 F5
TLC 챔버Sigma-AldrichZ126195-1EA
클로로포름Sigma-Aldrich650498-4L
메탄올Sigma-Aldrich34860-2L-R
TLC PaperWhatman3030917TLC 탱크
후드AIHA/ANSI 표준을 준수하는 모든 흄 후드
6-웰 플레이트Corning Inc. Costar3506
Trypsin-EDTAGibco25300-054
셀 스크레이퍼Corning Inc. Costar3010
혈구계Hausser Scientific1490
원심분리기Beckman Coulter모델 Alegra x-30R
Votex 믹서Fisher Scientific12-812
밸런스Mettler Toledo모델 # MS104S 0.1mg
유리 파스퇴르 피펫Fisherbrand13-678-20A
콜레스테롤Avanti 극성 지질700000
SpeedVac 농축기Thermo Scientific모델 # SPD2010
석유 에테르Fisher ScientificE139-1
디에틸 에테르그마-알드리치309966
아세트산시그마-알드리치320099
TLC 실리카 겔 60 농축 구역 포함분석 크로마토그래hy Millipore1.11845.0001
요오드 칩: 시그마 - 알드리치376558-50G
황산: 시그마 - 알드리치320501
염화망간시그마 - 알드리치244589
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참고문헌

  1. Sarantis, H., Grinstein, S. Subversion of phagocytosis for pathogen survival. Cell Host & Microbe. 12 (4), 419-431 (2012).
  2. Rougerie, P., Miskolci, V., Cox, D. Generation Of Membrane Structures During Phagocytosis And Chemotaxis Of Macrophages: Role And Regulation Of The Actin Cytoskeleton. Immunological Reviews. 256 (1), 222-239 (1111).
  3. Liu, T., Perlin, D. S., Xue, C. Molecular Mechanisms Of Cryptococcal Meningitis. Virulence. 3, 173(2012).
  4. Abadi, J., Pirofski, L. A Antibodies Reactive With The Cryptococcal Capsular Polysaccharide Glucuronoxylomannan Are Present In Sera From Children With And Without Human Immunodeficiency Virus Infection. The Journal Of Infectious Diseases. 180 (3), 915-919 (1999).
  5. Kechichian, T. B., Shea, J., Del Poeta, M. Depletion Of Alveolar Macrophages Decreases The Dissemination Of A Glucosylceramide-Deficient Mutant Of Cryptococcus Neoformans In Immunodeficient Mice. Infection And Immunity. 75 (10), 4792-4798 (2007).
  6. Casadevall, A. Cryptococci At The Brain Gate: Break And Enter Or Use A Trojan Horse. The Journal Of Clinical Investigation. 120 (5), 1389-1692 (1172).
  7. Chrétien, F., et al. Pathogenesis Of Cerebral Cryptococcus Neoformans Infection After Fungemia. The Journal Of Infectious Diseases. 186 (4), 522-530 (2002).
  8. Luberto, C., Martinez-Mariño, B., et al. Identification Of App1 As A Regulator Of Phagocytosis And Virulence Of Cryptococcus Neoformans. The Journal Of Clinical Investigation. 112 (7), 1080-1094 (1172).
  9. Mcquiston, T. J., Williamson, P. R. Paradoxical Roles Of Alveolar Macrophages In The Host Response To Cryptococcus Neoformans. Journal Of Infection And Chemotherapy: Official Journal Of The Japan Society Of Chemotherapy. 18 (1), 1-9 (2012).
  10. García-Rodas, R., Zaragoza, O. Catch Me If You Can: Phagocytosis And Killing Avoidance By Cryptococcus Neoformans. FEMS Immunology And Medical Microbiology. 64 (2), 147-161 (2012).
  11. Coelho, C., Bocca, A. L., Casadevall, A. The Intracellular Life Of Cryptococcus Neoformans. Annual Review Of Pathology. 9. 219, 10-1146 (2014).
  12. Rao, M., Peachman, K. K., Alving, C. R., Rothwell, S. W. Depletion Of Cellular Cholesterol Interferes With Intracellular Trafficking Of Liposome-Encapsulated Ovalbumin. Immunology And Cell Biology. 81, Doi. 415-423 (2003).
  13. Sein, K. K., Aikawa, M. The Prime Role Of Plasma Membrane Cholesterol. In The Pathogenesis Of Immune Evasion And Clinical Manifestations Of Falciparum Malaria. Medical Hypotheses. 51 (2), 10-1016 (1998).
  14. Pucadyil, T. J., Tewary, P., Madhubala, R., Chattopadhyay, A. Cholesterol Is Required For Leishmania Donovani Infection: Implications In Leishmaniasis. Molecular And Biochemical Parasitology. 133, 145-152 (2004).
  15. Tagliari, L., et al. Membrane Microdomain Components Of Histoplasma Capsulatum Yeast Forms, And Their Role In. Alveolar Macrophage Infectivity. Biochimica Et Biophysica Acta. 1818 (3), 458-466 (2012).
  16. Crane, J. M., Tamm, L. K. Role Of Cholesterol In The Formation And Nature Of Lipid Rafts In Planar And Spherical Model Membranes. Biophysical Journal. 86 (5), 2965-2979 (2004).
  17. Brown, D. A., London, E. Functions Of Lipid Rafts In Biological Membranes. Annual Review Of Cell And Developmental Biology. 14, 111-136 (1998).
  18. Simons, K., Toomre, D. Lipid Rafts And Signal Transduction Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 1 (1), 31-39 (2000).
  19. Ilangumaran, S., Hoessli, D. C. Effects Of Cholesterol Depletion By Cyclodextrin On The Sphingolipid Microdomains Of The Plasma Membrane. The Biochemical Journal. 335 (Pt 2), 433-440 (1998).
  20. Bligh, E. G., Dyer, W. J. A Rapid Method Of Total Lipid Extraction And Purification). Canadian Journal Of Biochemistry And Physiology. 37 (8), 911-917 (1959).
  21. Mukherjee, S., Lee, S., Casadevall, A. Antibodies To Cryptococcus Neoformans Glucuronoxylomannan Enhance Antifungal Activity Of Murine Macrophages. Infect. Immun. 63 (2), 573-579 (1995).
  22. Deshaw, M., Pirofski, L. A. Antibodies To The Cryptococcus Neoformans Capsular Glucuronoxylomannan Are Ubiquitous. In Serum From HIV+ And HIV- Individuals. Clinical And Experimental Immunology. 99 (3), 425-432 (1995).
  23. Tripathi, K., Mor, V., Bairwa, N. K., Del Poeta, M., Mohanty, B. K. Hydroxyurea Treatment Inhibits Proliferation Of Cryptococcus Neoformans In Mice. Frontiers In Microbiology. 3, 187(2012).
  24. Chaka, W., et al. Quantitative Analysis Of Phagocytosis And Killing Of Cryptococcus Neoformans By Human Peripheral Blood Mononuclear Cells By Flow Cytometry. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2 (6), 753-759 (1995).

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Cryptococcus neoformansLPS IFN
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