이 기사에서는 Cryptococcus neoformans에 대식세포를 감염시키는 프로토콜에 대해 설명합니다. 또한 대식세포에서 스테롤을 고갈시키는 방법에 대해서도 설명합니다. 이러한 프로토콜은 체외 진균 감염을 연구하고 이러한 감염에서 스테롤의 역할을 조사하기 위한 지침을 제공합니다.
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방법 논문
대 식세포 콜레스테롤 고갈과의 식균 작용에 미치는 영향
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
크립토는 속 크립토의 병원성 곰팡이에 의해 발생 생명을 위협하는 감염입니다. 감염 깊은 폐에 복제 할 수 포자의 흡입에 발생합니다. 크립토 식세포의 탐식 수막뇌염 치명적인 질병을 일으키는 중추 신경계로 확산 할 수있는 방법 중 하나이다. 따라서, 크립토 식세포 간의 관계에 대한 연구는 감염의 진행을 이해하는 것이 중요하다. 본 연구는 C.에 의해 대식 세포 감염을 연구하는 단계별 프로토콜을 설명합니다 체외에서 콕 쿠스 네오 포르 만. 이 프로토콜을 이용하여, 호스트 - 호스트 상호 작용에 대한 병원체 스테롤 역할이 검토되고있다. 상이한 농도의 메틸 - 시클로 덱스트린 (MCD)는 뮤린 세망 육종 식세포 같은 세포주 J774A.1에서 콜레스테롤을 고갈하는데 사용되었다. 콜레스테롤 고갈을 확인하고 시판 availabl를 사용하여 두 정량전자 콜레스테롤 정량 키트 및 박층 크로마토 그래피. 콜레스테롤 세포 고갈 Lipopolysacharide (LPS) 및 인터페론 감마 (IFNγ)를 사용하여 (1)의 활성화 및 이펙터 대 표적 비율 항체 - 옵 소닌 크립토 콕 쿠스 네오 포르 만 스 야생형 H99 세포를 감염시켰다 1. 감염된 세포는 C.와 배양 2 시간 후 관찰 하였다 콕 쿠스 네오 포르 만 그들의 균성 지수를 계산 하였다. 콜레스테롤 고갈 식세포 인덱스 상당한 감소 결과. 제시된 프로토콜은 실험실 환경에서 악성 프로세스의 개시를 모방하고 감염성 숙주에 지질 조성물의 역할을 연구하기에 편리한 방법을 제공한다.
서론
탐식 세포 외 실체가 숙주 세포에 의해 내재화되는 과정입니다. 또한 병원균에 대한 방어 면역 체계의 병기 키 무기이지만, 프로세스는 종종 내재화 및 본체 (1) 전체에 확산을 허용하도록 병원균 전복 될 수있다. 탐식 숙주 세포의 세포 골격 재 배열을 통한 부착과 말림을 초래할 여러 시그널링 이벤트에 의해 매개된다. '전문'식세포는 첨부 파일과 병원균을 삼켜과 phagosome 2를 형성 멜리의 형성에 대한 신호를 침입 병원균의 표면에 opsonins로 인식하고 결합 할 수 있습니다. 소위 '전문가'식세포 중 대 식세포이다. 대 식세포는 대부분의, 추구와 질병의 원인이 에이전트를 제거, 손상된 조직을 복구 및 염증을 매개하는 등 보호 기능을 수행 고도로 전문화 된 세포이다식균 작용 1,2의 과정을 통해 이들.
크립토 콕 쿠스 네오 포르 만은 크립토로 알려진 심각한 질병을 일으키는 병원성 효모의 종입니다. 크립토 포자는 호스트에 의해 흡입 일반적으로 무증상 폐 감염이 발생할 수 있습니다. 노광이 매우 만연이라고 사료된다; 조사 된 모든 사람들은 크립토 다당류 glucuronoxylomannan 및 다른 연구에 대한 항체를....
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프로토콜
MβCD와 J774A.1 세포의 1. 콜레스테롤 고갈
- 멸균 생물 안전성 캐비닛, 시드 105 J774A.1 식세포 유사 세포 웰 당 10 % 소 태아 혈청 (FBS)이 보충 된 둘 베코 변형 이글 중간 (DMEM) 200㎕의 1 %에서 96 웰 세포 배양 접시에 페니실린 / 스트렙토 마이신 (P / S). 37 ° C에서 품어 5 % CO 2 O / N.
- 세포 단일 층에서 미디어를 제거하고 여과 또는 멸균 된 1 배 인산 완충 식염수 (PBS)로 두 번 세포를 씻으십시오.
- 제어로 원하는 농도 (10 PBS에서 MM 또는 30 mM의) 또는 1X PBS에서 MβCD 솔루션의 200 μl를 추가하고 진탕 37 ° C에서 30 분 동안 배양한다. 즉시 절차에 따라 시판 키트와 함께 정량 분석을 실온에서 뜨는 및 예약을 제거합니다.
- 1X PBS 또는 혈청 무료 DMEM으로 세포를 2 ~ 3 배를 씻고 pipetti에 의한 감염이나 세포를 Lyse 계속박층 크로마토 그래피 또는 키트와 분석을위한 탈 H 2 O와 2 ~ 3 배 겨.
참고 : 시판 콜레스테롤 정량 키트를 사용할 수있는 콜레스테롤 고갈 이어. 자세한 내용은 자료 섹션을 참조하십시오. 작성된 ....
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결과
콜레스테롤 고갈
1X PBS 대조군에 비해 Amplex 레드 콜레스테롤 분석 키트 제조업체의 지침에 따라 프로토콜의 단계 1.3에서 예약 된 상층 액의 분석은 MβCD 처리 샘플 콜레스테롤의 높은 농도를 산출한다. 세포의 종류와 MβCD 농도 사용 콜레스테롤 고갈에 따라 다를 수 있습니다. 10mM의 MβCD 처리 J774 들어, 약 50 %의 고갈이 관찰되었다. 고갈 1.4 단계 (도 1)에 수집 된 상등액 및 세포 용해질로부터 얻은 값을 사용하여 계산 될 수있다.
TLC 분석을 이용하여 세포 용 해물은 MβCD (도 2a)의 농도가 증가함에 따라 처리 된 세포에서 콜레스테롤의 염색에서 현저한 감소를 보여준다. TLC의 비중계 분석은 정량적 분석 (그림 2B)와 비슷한 경향을 보여줍니다. 후 Bligh-다이어 방법은 조 추출액을 준다총 지.......
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토론
이 프로토콜과 협력 이는 포유류 세포를 C. 도금 및 opsonizing 때 정확한 세포 수를 구하는 것이 중요 콕 쿠스 네오 포르 셀. 이 시험 사이의 변화를 최소화하고 정확한 일 보장 : 연구를 통해 이펙터 비율 1 목표. 또한 절차 사이에 RT에서 휴식에서 옵 소닌 효모 세포 또는 처리 된 대 식세포를 방지 콜레스테롤 고갈과 감염의 타이밍을 조정하는 것이 중요하다. 감염이 시작하기 전에 긴 대기 기간은 항체의 옵 소닌의 손실 또는 고갈 콜레스테롤의 보충가 발생할 수 있습니다. 실험 정밀도했으면 결론 식세포 콜레스테롤의 역할에 대해 식별 될 수 있도록 데이터를 분석한다.
기술의 한계 콜레스테롤 결핍 세포 같은 식세포의 탐식 인덱스를 저하시키는 구체적인기구와 같은 임의의 결론을 방지하고, 이는 EF하는지 확실에는 영향으로 인해 콜레스테롤 때문에, 또는 보조기구에 직접입니다. 이 정맥을 따라 추가 작업은 이러한 Fcγ 수용체와 보체 수용체 등의.......
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공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
이 작품은 NIH 보조금 MDP에 AI56168, AI71142, AI87541 및 AI100631에 의해 지원되었다. 마우리 치오 델 포에 타는 감염증에 버로우즈 웰컴 탐정이다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 클래스 II 유형 A2 생물 안전 캐비닛 | Labconco | 3460009 | |
| J774A.1 세포주 | ATCC | TIB-67 | 이 냉동 상태로 도착합니다. 배양에 대한 ATCC 지침을 참조하십시오. |
| 둘베코' s Modified Eagle Medium | Gibco | 11995-065 | 4 °에 저장; C와 37까지 따뜻합니다. C 사용 전 |
| HI Fetal Bovine Serum Performance Plus | Gibco | 10082-147 | -20°C에서 냉동 보관 & DMEM에 첨가하기 전에 C 및 해동 |
| 페니실린-스트렙토마이신(10,000 U/ml) | Gibco | 15140-122 | 를 흡수하는 데 사용 |
| Fisher Scientific | 모델 # 3530 | ||
| 96-웰 배양 접시 | Corning Inc. Costar | 3595 | |
| 10x 인산염 완충 식염수 | Fisher Scientific BioReagents | BP3994 | 사용하기 전에 1배로 희석하고 여과하거나 오토클레이브하십시오. |
| 메틸-&베타;-사이클로덱스트린 | 시그마, 생명과학 | C4555-10G | 10mM 및 30mM 농도의 용액을 만들기 위해 1x PBS에 용해 |
| 오비탈 셰이커, | Labline, | ||
| Amplex, 적색 콜레스테롤 분석 키트 | , Life Technologies, 분자 프로브, | A12216 | 콜레스테롤 분석을 위한 모든 시약이 키트에 포함되어 있습니다. 제조업체 지침을 따릅니다. |
| 96-웰 블랙 어세이 플레이트 | Corning Inc. Costar | 3603 | |
| FilterMax 마이크로플레이트 리더 | 분자 장치 | 모델 F5 | |
| TLC 챔버 | Sigma-Aldrich | Z126195-1EA | |
| 클로로포름 | Sigma-Aldrich | 650498-4L | |
| 메탄올 | Sigma-Aldrich | 34860-2L-R | |
| TLC Paper | Whatman | 3030917 | TLC 탱크 |
| 후드 | AIHA/ANSI 표준을 준수하는 모든 흄 후드 | ||
| 6-웰 플레이트 | Corning Inc. Costar | 3506 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| 셀 스크레이퍼 | Corning Inc. Costar | 3010 | |
| 혈구계 | Hausser Scientific | 1490 | |
| 원심분리기 | Beckman Coulter | 모델 Alegra x-30R | |
| Votex 믹서 | Fisher Scientific | 12-812 | |
| 밸런스 | Mettler Toledo | 모델 # MS104S 0.1mg | |
| 유리 파스퇴르 피펫 | Fisherbrand | 13-678-20A | |
| 콜레스테롤 | Avanti 극성 지질 | 700000 | |
| SpeedVac 농축기 | Thermo Scientific | 모델 # SPD2010 | |
| 석유 에테르 | Fisher Scientific | E139-1 | |
| 디에틸 에테르 | 그마-알드리치 | 309966 | |
| 아세트산 | 시그마-알드리치 | 320099 | |
| TLC 실리카 겔 60 농축 구역 포함 | 분석 크로마토그래hy Millipore | 1.11845.0001 | |
| 요오드 칩 | : 시그마 - 알드리치 | 376558-50G | |
| 황산 | : 시그마 - 알드리치 | 320501 | |
| 염화망간 | 시그마 - 알드리치 | 244589 | |
| UVP EC3 이미징 시스템 | : 자외선 제품 주식 회사 | Vision Works LS 소프트웨어를 사용하여 밀도 분석을 수행하십시오. | |
| 유리 바닥 컨포칼 디쉬 | MatTek | P35G-1.5-10C | www.glassbottomdishes.com |
| Cryptococcus neoformans (H99) | 는 Duke University Medical Center | ||
| YNB | BD | 239210 | . 준비 지침은 제조업체를 참조하십시오. 20g/L의 포도당 농도를 사용하십시오. |
| 지질다당류 | Sigma | L4391-1MG | 1x PBS에 용해시켜 1mg/ml 스톡을 만듭니다. -20 °C에서 보관하십시오. |
| 인터페론 감마 | 시그마 | I4777 | 1x PBS에 용해하여 0.1 mg/ml 원액 |
| 글루쿠로녹실로만난 항체 (anti-GXM) | Arturo Casadevall의 실험실에서 선물한 농도는 1.98 mg/ml | ||
| Giemsa | MP Biomedicals | 194591 | 0.8 g의 Giemsa를 25 ml의 글리세롤에 용해시키고 60°C로 가열합니다. C 1시간 용액에 메탄올 25ml를 넣고 실온에서 최소 1개월 동안 숙성시킵니다. |
| 현미경 | Zeiss | Observer.D1 현미경과 AxioCam MRm이 있는 현미경 이미지 촬영용 |
참고문헌
- Sarantis, H., Grinstein, S. Subversion of phagocytosis for pathogen survival. Cell Host & Microbe. 12 (4), 419-431 (2012).
- Rougerie, P., Miskolci, V., Cox, D. Generation Of Membrane Structures During Phagocytosis And Ch....
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