이 연구에서는 서로 다른 생산 플랫폼에서 표적 인간 재조합 단백질의 발현을 비교했습니다. 우리는 전통적인 발효기 기반 배양과 식물에 초점을 맞추고, 각 시스템의 설정을 설명하고, 보고된 결과를 기반으로 각 플랫폼의 고유한 한계와 장점을 강조했습니다.
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방법 논문
박테리아, 곤충 세포 및 공장 시스템 : 재조합 단백질 다른 Biofactories에서 표현의 비교 분석
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
식물 - 기반 시스템은 높은 품질의 생체 활성 제품의가요 성, 저비용 생산을 위해 자신의 잘 문서화 전위의 결과로 재조합 단백질의 생산에 유용한 플랫폼 여겨진다.
본 연구에서 우리는 과도하고 안정적인 식물 기반 발현 시스템, 전통적인 발효기 계 세포 배양 (세균성 및 곤충)에서 표적 재조합 인간 단백질의 발현을 비교 하였다.
각 플랫폼을 위해, 우리는 셋업, 최적화 및 제조 공정의 길이, 최종 제품의 품질과 수율을 설명하고 우리는 선택된 대상 재조합 단백질에 특이 잠정 생산 비용을 평가 하였다.
전반적으로, 우리의 결과는 박테리아 인해 불용성 봉입체 내에서 축적 목적 단백질의 생산에 적합하지 않은 것을 나타낸다. 한편, 식물 기반 시스템은 다목적 플랫폼 t는모자 배큘로 바이러스 / 곤충 세포 시스템보다 낮은 비용으로 선택된 단백질의 생산을 허용한다. 특히, 안정된 형질 전환 라인은 최종 생성물의 높은 수율 및 과도 발현하는 식물 빠른 프로세스 개발을 표시. 그러나, 모든 재조합 단백질은 식물 기반 시스템의 혜택을 누릴 수 있지만, 여기에 설명 된대로 최고의 생산 플랫폼, 사례 별 접근 방식을 경험적으로 결정되어야한다.
서론
재조합 단백질은 새로운 생명공학 도구의 도움으로 이종 발현 시스템에서 상업적으로 대량 생산됩니다. 이종 발현 시스템을 선택할 때 고려해야 할 핵심 요소에는 단백질 품질, 기능성, 공정 속도, 수율 및 비용이 포함됩니다.
재조합 단백질 분야에서는 의약품 시장이 빠르게 확대되고 있으며, 이에 따라 오늘날 생산되는 대부분의 바이오의약품은 재조합 의약품입니다. 단백질은 박테리아, 효모, 곰팡이, 포유류, 식물 및 곤충의 세포 배양뿐만 아니라 식물 시스템(안정 또는 일시적 변형을 통해) 및 형질전환 동물에서 발현될 수 있습니다. 각 발현 시스템에는 고유한 장점과 한계가 있으며 각 표적 재조합 단백질에 대해 최적의 생산 시스템을 신중하게 평가해야 합니다.
식물 기반 플랫폼은 안전하고 비용 효율적인 재조합 단백질 생산을 위한 기존 발효기 기반 시스템의 중요한 대안으로 부상하고 있습니다. 다운스트림 처리 비용은 미생물 및 포유류 세포의 비용과 비슷하지만, 식물의 상업적 생산에 필요한 낮은 초기 투자와 넓은 면적의 배양으로 제공되는 잠재적인 규모의 경제가 주요 이점입니다.
우리는 제1형 자가면역 당뇨병(T1D)의 주요 자가항원 중 하나인 인간 글루탐산 탈카르복....
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프로토콜
발현 벡터의 1. 건설
- 상용 재조합 클로닝 시스템 :
- 앞서 설명한 바와 같이 2 프라이머는 적절한 유전자의 5 '말단에서 CACC 클램프의 첨가를 허용와 표적 유전자 (hGAD65mut)의 전체 길이의 서열을 증폭.
- 1 몰비 인서트 : 벡터 및 1 μL의 1.5을 사용하여, 6 μL의 총 부피의 반응을 조합하여 엔트리 벡터 (토포 이소 머라 바운드)에서 지향성 클로닝 키트 규격에있어서, 겔 - 정제 된 증폭 산물을 복제 염 용액 (0.01 M의 MgCl 2의 NaCl 및 0.2). 실온 (RT)에서 5 분 동안 배양.
- 화학적으로 관할 E.으로 전체 반응을 변환 식민지 PCR (3)에 의한 방향 복제 키트 사양과 화면을 얻을 식민지, 앞으로 M13를 사용하여 역방향 프라이머에 따라 대장균 세포는 방향 복제 키트에 포함되어 있습니다. 포에서 플라스미드를 분리돌연변이 3의 부재를 보장하기 위해 프라이머를 앞으로 M13를 사용하여 역 플라스미드 DNA 준비 키트 사양 및 순서 삽입에 따라 sitive 식민지.
- 특정 대상 벡터와 람다 재조합 효소 Clonase II 효소 (LR)에 의해 재조합 ....
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결과
다른 생산 시스템의 목표 재조합 단백질의 이종 발현을위한 실험 설계는 여기에 설명되어 있습니다. 제 1 초점 각 시스템에서 목적 단백질의 발현을 위해 최적의 조건을 설정함으로써 다른 플랫폼의 셋업이다.
표적 단백질의 발현 hGAD65mut는 E. 중으로 유도 하였다 대장균 문화. 37 ° C에서 3 시간의 발현 후, 균체를 원심 분리에 의해 수집하고, 초음파 처리에 의해 용해. 원심 분리 단계 이후에, 수용성 단백질은 불용성 봉입체 분리 및 초기 분석 (데이타 미기재) hGAD65mut은 불용성 봉입체에서 축적 prevalently 것을 증명 하였다. 재조합 단백질 용액 화는 강한 변성 속성, hGAD65mut 불가 적절한 정량을, RIA 분석을 방해하는 요소 6 M의 사용이 필요합니다. 몇 가지 전략이 될 수있다EN은, 봉입체의 형성을 제한하는 낮은 온도에서 11 균체 성장하기위한보고. 배양 물은 15 ° C, 20 ° C.......
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토론
박테리아 세포, 배큘로 바이러스 / 곤충 세포 및 식물 : 본 연구에서는 세 가지 플랫폼은 재조합 인간 단백질의 발현을 비교 하였다. (- MagnICON 및 pK7WG2 기반 - 안정적인 즉, 과도) 식물 기반 플랫폼은 더 세 널리 사용되는 표현 기술을 이용하여 탐구 하였다. 이 실험 hGAD65mut 위해 선택된 표적 단백질은 이전에 다른 시스템 (13)으로 표현되었고, 그것의 생산 및 기능은 쉽게 검출 및 측정 할 수있다 (14).
hGAD65mut는 봉입체를 형성하기 때문에 세균 세포 따라서 힘드는 가용화를 요구 및 원시 형태를 달성하는 폴딩에도 저온 성장 조건에서, 효율적인 생산 플랫폼 아니었다. 실제로 복잡한 재조합 단백질의 발현을위한이 플랫폼의 주요 장애는 최종 제품의 우측 형태이다.
배큘로 바이러스 / 곤충 세포 플랫폼은 면역 재조합 단백질의 고 발현을 .......
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공개 사항
저자는 이 논문의 출판과 관련하여 이해 상충이 없음을 선언합니다.
감사의 글
이 작업은 COST 조치 'Molecular pharming: Plants as a production platform for high-value proteins' FA0804의 지원을 받았습니다. 저자는 연구 목적으로 MagnICON 벡터를 제공해 주신 Anatoli Giritch 박사와 Yuri Gleba 교수에게 감사를 표합니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 효모 추출물 | Sigma | Y1333 | |
| Tryptone | Formedium | TRP03 | |
| Agar Bacteriological Grade | Applichem | A0949 | |
| Sf-900 II SFM medium | Gibco | 10902-088 | |
| Grace' s 곤충 배지, 보충되지 않은 | Gibco | 11595-030 | |
| Cellfectin II 시약 | Invitrogen | 10362-100 | |
| 비타민을 포함한 MS 배지 | Duchefa Biochemie | M0222 | |
| 설탕 | Duchefa Biochemie | S0809 | |
| 식물 한천 | Duchefa Biochemie | P1001 | |
| 암피실린 나트륨 | Duchefa Biochemie | A0104 | 독성 |
| 겐타마이신 황산염 | Duchefa Biochemie | G0124 | 독성 |
| 간시클로비르 | Invitrogen | I2562-023 | |
| 카르베니실린 디소 | 듐 Duchefa Biochemie | C0109 | 독성 |
| 카나마이신 황산염 | Sigma | K4000 | 독성 |
| 리팜피신 | Duchefa Biochemie | R0146 | 독성 & 은대쉬; DMSO |
| 스트렙토마이신 설페이트 | Duchefa Biochemie | S0148 | 독성 |
| 스펙티노마이신 디하이드로클로라이드 | Duchefa Biochemie | S0188 | |
| IPTG(이소프로필-&베타;-D-1-티오갈라토피라노사이드) | Sigma | I5502 | 독성 |
| MES 수화물 | Sigma | M8250 | |
| MgCl2 | Biochemical | 436994U | |
| 아세토시링곤 | 그마 | D134406 | 독성 – 0.1 M 재고 DMSO |
| 주사기 (1 ml) | Terumo | ||
| MgSO4 | Fluka | 63136 | |
| BAP (6-벤질아미노퓨린) | Sigma | B3408 | 독성 |
| NAA (나프탈렌 아세트산) | Duchefa Biochemie | N0903 | 자극성 |
| Cefotaxime | Mylan Generics | ||
| Trizma base | Sigma | T1503 | Tris-HCl 버퍼를 만들기 위해 1 N HCl로 pH 조정 |
| Sigma | H1758 | 부식성 | |
| NaCl | Sigma | S3014 | 1 M 재고 |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| Na2HPO4 | Sigma | S7907 | |
| KH2PO4 | Sigma | P9791 | |
| PMSF (Phenylmethanesulfonylfluoride) | Sigma | P7626 | 부식성, 독성 |
| 요소 | Sigma | U5378 | |
| β-메르캅토에탄올 | Sigma | M3148 | 독성 |
| 트윈-20 | Sigma | P5927 | |
| Hepes | Sigma | H3375 | |
| DTT (Dithiothreitol) | Sigma | D0632 | 독성 – 1 M 재고, -20 °에서 보관; C |
| CHAPS | Duchefa Biochemie | C1374 | 독성 |
| 식물 프로테아제 억제제 칵테일 | Sigma | P9599 | 너무 많이 동결/해동하지 마십시오 |
| SDS (Sodium dodecyl sulphate) | Sigma | L3771 | 가연성, 독성, 부식성 – 10% 재고 |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| Brilliant Blue R-250 | Sigma | B7920 | |
| 이소프로판올 | Sigma | 24137 | 가연성 |
| 아세트산 | Sigma | 27221 | 부식성 |
| 항글루타민산 탈카르복실라제 65/67 | Sigma | G5163 | 너무 많이 동결/해동하지 마십시오 |
| 양고추냉이 과산화효소(HRP)-접합체 항토끼 항체 | Sigma | A6154 | 너무 많이 동결/해동하지 마십시오 |
| Sf9 세포 | 수명 기술 | 11496 | |
| BL21 유능한 E. coli | New England Biolabs | C2530H | |
| 단백질 A 세파로스 | Sigma | P2545 | |
| 세포 배양 플레이트 | Sigma | CLS3516 | |
| Radio Immuno Assay kit | Techno Genetics | 12650805 | Radioactive material |
참고문헌
- Hampe, C. S., Hammerle, L. P., Falorni, A., Robertson, J., Lernmark, A. Site-directed mutagenesis of K396R of the 65 kDa glutamic acid decarboxylase active site obliterates enzyme activity but not antibody binding. FEBS Lett. 488 (3), 185-189 (2001).
- Avesani, L., et al.
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재인쇄 및 허가
