박테리아, 곤충 세포 및 공장 시스템 : 재조합 단백질 다른 Biofactories에서 표현의 비교 분석

Summary

이 연구에서는 서로 다른 생산 플랫폼에서 표적 인간 재조합 단백질의 발현을 비교했습니다. 우리는 전통적인 발효기 기반 배양과 식물에 초점을 맞추고, 각 시스템의 설정을 설명하고, 보고된 결과를 기반으로 각 플랫폼의 고유한 한계와 장점을 강조했습니다.

Abstract

식물 - 기반 시스템은 높은 품질의 생체 활성 제품의가요 성, 저비용 생산을 위해 자신의 잘 문서화 전위의 결과로 재조합 단백질의 생산에 유용한 플랫폼 여겨진다.

본 연구에서 우리는 과도하고 안정적​​인 식물 기반 발현 시스템, 전통적인 발효기 계 세포 배양 (세균성 및 곤충)에서 표적 재조합 인간 단백질의 발현을 비교 하​​였다.

각 플랫폼을 위해, 우리는 셋업, 최적화 및 제조 공정의 길이, 최종 제품의 품질과 수율을 설명하고 우리는 선택된 대상 재조합 단백질에 특이 잠정 생산 비용을 평가 하였다.

전반적으로, 우리의 결과는 박테리아 인해 불용성 봉입체 내에서 축적 목적 단백질의 생산에 적합하지 않은 것을 나타낸다. 한편, 식물 기반 시스템은 다목적 플랫폼 t는모자 배큘로 바이러스 / 곤충 세포 시스템보다 낮은 비용으로 선택된 단백질의 생산을 허용한다. 특히, 안정된 형질 전환 라인은 최종 생성물의 높은 수율 및 과도 발현하는 식물 빠른 프로세스 개발을 표시. 그러나, 모든 재조합 단백질은 식물 기반 시스템의 혜택을 누릴 수 있지만, 여기에 설명 된대로 최고의 생산 플랫폼, 사례 별 접근 방식을 경험적으로 결정되어야한다.

Introduction

재조합 단백질은 새로운 생명공학 도구의 도움으로 이종 발현 시스템에서 상업적으로 대량 생산됩니다. 이종 발현 시스템을 선택할 때 고려해야 할 핵심 요소에는 단백질 품질, 기능성, 공정 속도, 수율 및 비용이 포함됩니다.

재조합 단백질 분야에서는 의약품 시장이 빠르게 확대되고 있으며, 이에 따라 오늘날 생산되는 대부분의 바이오의약품은 재조합 의약품입니다. 단백질은 박테리아, 효모, 곰팡이, 포유류, 식물 및 곤충의 세포 배양뿐만 아니라 식물 시스템(안정 또는 일시적 변형을 통해) 및 형질전환 동물에서 발현될 수 있습니다. 각 발현 시스템에는 고유한 장점과 한계가 있으며 각 표적 재조합 단백질에 대해 최적의 생산 시스템을 신중하게 평가해야 합니다.

식물 기반 플랫폼은 안전하고 비용 효율적인 재조합 단백질 생산을 위한 기존 발효기 기반 시스템의 중요한 대안으로 부상하고 있습니다. 다운스트림 처리 비용은 미생물 및 포유류 세포의 비용과 비슷하지만, 식물의 상업적 생산에 필요한 낮은 초기 투자와 넓은 면적의 배양으로 제공되는 잠재적인 규모의 경제가 주요 이점입니다.

우리는 제1형 자가면역 당뇨병(T1D)의 주요 자가항원 중 하나인 인간 글루탐산 탈카르복실라제(hGAD65)의 65kDa 동형의 발현을 위한 생물반응기로 식물을 평가했습니다. hGAD65는 질병의 진행 과정을 분류하고 모니터링하기 위한 마커로 널리 채택되고 있으며, T1D 예방에서의 역할은 현재 임상 시험에서 조사 중입니다. 이러한 임상시험이 성공적일 경우, 재조합 hGAD65에 대한 전 세계 수요가 급격히 증가할 것입니다.

여기에서는 보조인자 PLP(pyridoxal-5'-phosphate)를 아르기닌 잔기(K396R)1로 결합하는 라이신 잔기를 치환하여 생성된 돌연변이인 hGAD65, hGAD65mut의 효소 비활성 대응물의 발현에 초점을 맞춥니다.

hGAD65mut는 면역원성을 유지하며 식물 및 곤충 세포에서 야생형 hGAD65보다 최대 10배 더 많이 축적됩니다. hGAD65의 효소 활성은 식물 세포 대사를 방해하여 자체 합성을 억제하는 반면, 효소 비활성 형태인 hGAD65mut는 식물 세포에 더 높은 수준으로 축적될 수 있다는 가설이 세워졌습니다.

hGAD65mut의 발현을 위해 식물 생명 공학에 널리 사용되는 다양한 기술의 사용을 탐구하고 기존 발현 플랫폼(Escherichia coli 및 Baculovirus/곤충 세포 기반)과 비교했습니다.

이 연구에서는 기존 및 식물 기반 시스템으로 구성된 hGAD65mut의 발현을 위해 개발된 재조합 플랫폼을 공정 속도와 수율, 최종 제품의 품질 및 기능을 기준으로 검토하고 비교했습니다.

Protocol

발현 벡터의 1. 건설

1. 상용 재조합 클로닝 시스템 :
   1. 앞서 설명한 바와 같이 ² 프라이머는 적절한 유전자의 5 '말단에서 CACC 클램프의 첨가를 허용와 표적 유전자 (hGAD65mut)의 전체 길이의 서열을 증폭.
   2. 1 몰비 인서트 : 벡터 및 1 μL의 1.5을 사용하여, 6 μL의 총 부피의 반응을 조합하여 엔트리 벡터 (토포 이소 머라 바운드)에서 지향성 클로닝 키트 규격에있어서, 겔 - 정제 된 증폭 산물을 복제 염 용액 (0.01 M의 MgCl _2의 NaCl 및 0.2). 실온 (RT)에서 5 분 동안 배양.
   3. 화학적으로 관할 E.으로 전체 반응을 변환 식민지 PCR ^(3)에 의한 방향 복제 키트 사양과 화면을 얻을 식민지, 앞으로 M13를 사용하여 역방향 프라이머에 따라 대장균 세포는 방향 복제 키트에 포함되어 있습니다. 포에서 플라스미드를 분리돌연변이 ^3의 부재를 보장하기 위해 프라이머를 앞으로 M13를 사용하여 역 플라스미드 DNA 준비 키트 사양 및 순서 삽입에 따라 sitive 식민지.
   4. 특정 대상 벡터와 람다 재조합 효소 Clonase II 효소 (LR)에 의해 재조합 반응을 수행 할 얻어진 항목 클론을 사용 pDEST17 (pDEST17.G65mut를 산출)와 박테리아 세포에서 재조합 단백질 발현을 위해, pK7WG2와 (일시적 또는 안정) 식물 ⁴ (Baculo.G65mut 항복) 선형화 된 바이러스 DNA로 배큘로 바이러스 / 곤충 세포 시스템에서, (pK7WG2.G65mut 얻었다). 엔트리 벡터 100 ng의, 대상 벡터 150 ng의 10 μL의 최종 부피 효소 믹스 2㎕의 함께 clonase 키트 사양에 따라, 반응을 조립한다. 1 시간 동안 실온에서 믹스를 품어.
   5. 유능한 화학적으로 재결합 E. 제품 변형 clonase 키트 사양에 따라 대장균 세포. PCR ^(3)에 의한 화면을 얻을 식민지 모든 변환 반응을 유도 식민지에 같은 역 GAD65mut 특정 프라이머를 사용하여 (5'-CACACGCCGGCAGCAGGT-3 ') 다음과 같은 특정 대상 벡터 앞으로 프라이머 pDEST17에 대한 : 5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'; pK7WG2에 대한 : 5'-AAGATGCCTCTGCCGACAGT-3 '; 바큘로 선형화 된 벡터 : 5'-AAATGATAACCATCTCGC-3 '.
   6. 상업용 minipreparation의 DNA 키트를 사용하여 플라스미드 DNA를 분리하고 이전 단계에서 설명한 것과 같은 특정 프라이머의 조합을 사용하여, PCR ^(3)에 의해 표적 서열의 존재를 확인한다.
   7. 다음 단계에 설명 된대로 재조합 단백질 발현을 위해 선택된 플랫폼에 따라 다른 대상 유기체를 변환 얻어진 PCR 양성 플라스미드를 사용합니다.
2. MagnICON 시스템 ^5-7 :
   1. 이전 pICH31070.G65mut을 수득 상세히 ^7에 기재된 바와 같이, 3'- 모듈 pICH31070에서 표적 유전자를 복제. 사용특정 반응을 다음주기 : 80 ° C에서 37 ° C, 50 ° C에서 5 분에서 30 분 인큐베이션 한 후, 5 분.

2. 재조합 단백질 발현

1. 세균 전지 시스템 :
   1. E.에 pDEST17.G65mut 변환 대장균 BL21 (DE3) 다음 유전자 특이 적 프라이머를 이용한 콜로니 PCR에 의해 암피실린 함유 (100 ㎍ / ㎖) 상에 성장 된 표준 기술 및 화면 콜로니를 LB-매체를 사용 electrocompetent 셀 : 5'-CTGGTGCCAAGTGGCTCAGA-3 '와 5' -CACACGCCGGCAGCAGGT-3 ', 58 ° C의 어닐링 온도에서 20 초간의 신장 시간. 플라스틱 튜브에서 끝 세균 세포를 용해시킨 후 20 ㎕의 총 부피에서 PCR 반응을 수행한다.
   2. 암피실린 함유 (100 ㎍ / mL)을 3 ㎖ LB 배지에서 - 37 ° C에서 밤새 단일 콜로니를 접종한다.
   3. 세균 배양 1을 희석 : 신선한 LB 배지 100 100 ㎖의를 (포함 ampicill등)에 최종 OD 0.8 _600까지 1-6 시간 동안 37 ° C에서 품어.
   4. 최종 농도 1mM isopropil-β-D-1-tiogalattopiranoside (IPTG)를 첨가하여 재조합 단백질 발현을 유도하고 격렬하게 37 ° C에서 3 시간 동안 진탕 배양을 배양한다.
   5. 20 분 동안 4,000 XG에서 원심 분리하여 세포를 수집하고 단백질 추출 (단계 3.1.1.1)에 대한 세균 펠렛을 사용합니다.
2. 배큘로 바이러스 / 곤충 세포 시스템 :
   1. 씨 스포 도프 테라 프 루기 페르 (인 Sf9) 6 웰 플레이트에 세포 (물론 당 8 × 10 ⁵ 세포) 및 비 보충 그레이스의 곤충 중간의 2 ml로 두 번 씻는다.
   2. 매체 드롭 현명한 형질 전환 혼합물 (5 μL의 LR 재조합 반응, 6 μL의 Celfectin 용액 200 ㎕를 비 보충 그레이스의 곤충 중간)을 제거하고 교체합니다.
   3. 5 시간 동안 27 ° C에서 접시를 품어.
   4. 제거하고 신선한 SF-9 2 ㎖로 형질 전환 혼합물을 대체10 % 소 태아 혈청, 10 ㎍ / ml의 겐타 마이신 및 100 μM 갠 시클로 비르로 보충 된 배지를 00, 재조합 바큘로 바이러스 클론을 선택한다.
   5. 27 ° C에서 96 시간 동안 배양 한 후, 4 ° C에서 어둠 속에서 세포와 큰 파편과 저장소를 제거하기 위해 4,000 XG에서 매체 (V1 바이러스 주), 원심 분리기를 수집합니다.
   6. 씨앗 당 1 × ¹⁰⁶ 개의 Sf9 세포에 2.5 ml의 웰 SF-900 배지, 10 % 소 태아 혈청, 10 ㎍ / ml의 겐타 마이신 및 100 μM 갠 시클로 비르를 포함하고 각 웰에서 V1 스톡 100 ㎕로 감염시킨다.
   7. 27 ° C에서 3 일 동안 세포를 품어.
   8. 수집하고 원심 분리기 매체 4,000 x g에서.
   9. 4 ° C에서 상층 액 (V2 높은 역가 스톡)를 저장합니다.
   10. 씨앗 당 1 × ¹⁰⁶ 개의 Sf9 세포에 2.5 ml의 웰 SF-900 배지, 10 % 소 태아 혈청, 10 ㎍ / ml의 겐타 마이신 및 100 μM 갠 시클로 비르를 포함하고 각 웰에서 V2 스톡 25㎕를 함께 감염.
   11. 27 ° C에서 3 일 동안 세포를 품어.
   12. 4000 XG에서 원심 분리하여 세포를 수집하고 단백질 추출 (단계 3.1.2. 1)에 대한 곤충 세포 펠렛을 사용합니다.
3. 담배 속 benthamiana 일시적 발현 시스템 :
   1. N. 성장 온도 범위 18 ~ 23 ° C의 내 자연 채광 아래 온실에서 benthamiana 식물. agroinfection 4-5 주 오래된 식물을 사용합니다.
   2. 13 시간 일 / 11 시간 밤 광주와 22 ° C에서 기후 챔버에서 agroinfected 식물을 유지합니다.
   3. 상용 재조합 클로닝 시스템 :
      1. 아그로 스트레인 EHA105 electrocompetent 세포 메파에 앞서 ⁸ 바와 같이 pK7WG2.G65mut 소개하고이 후 LB 배지 함유 리팜피신 (50 ㎍ / ㎖), 스트렙토 마이신 (300 ㎍ / ml) 및 스펙 티노 마이신 (100 ㎍ / ㎖)상에서 성장한 콜로니를 선별 다음 유전자 특이 적 프라이머를 사용하여 식민지 PCR ⁽⁸⁾ 28 ° C에서 배양 일 : 5'-CATGGTGGAGCACGACACGCT-3 & #8217; 58 ° C의 어닐링 온도에서 50 초간의 신장 시간 5'-CACACGCCGGCAGCAGGT-3 '. 20 ㎕의 총 부피에서 PCR 반응을 수행한다.
      2. 28 ℃에서 이틀 동안 LB 배지 함유 리팜피신 (50 ㎍ / ㎖), 스트렙토 마이신 (300 ㎍ / ml) 및 스펙 티노 마이신 (100 ㎍ / mL)을 30 ㎖의 박테리아를 접종한다.
      3. 침투 버퍼의 10ml에 20 분에 resuspend 펠렛 (10 MM의 MES, 10 mM의의 MgCl _2, 100 μM 시린 곤, pH를 5.6) 4,000 XG에서 원심 분리하여 박테리아를 수집합니다. ₆₀₀ OD 값을 측정 한 후 동일한 완충액으로 희석하여 0.9로 조정.
         주 : 세 N. 침투에 필요한 총량 benthamiana 식물은 30 ㎖이다.
      4. N.에있는 아그로 박테 리움 현탁액에 침투 2.5 ml의 바늘 주사기를 사용하여 benthamiana 나뭇잎. 조심스럽게 천천히 주사기의 서스펜션 잎 패널을 주입. 세 확장 리터 침투공장 당 처마와 삼중으로 세 가지 식물을 사용합니다.
         참고 : 건강과 안전을 이유로 침투 과정에서 눈 보호구를 착용하십시오.
      5. 액체 질소에 agroinfiltrated 잎 이일 포스트 감염 (dpi)로 동결를 수집합니다. -80 ° C에서 보관 식물 조직.
   4. MagnICON 시스템 :
      1. 5 '모듈 (pICH20111), 3'모듈 (pICH31070.G65mut) 및 인테그라 모듈 (pICH14011) - - A.에서 MagnICON 벡터를 소개 표준 기술을 이용하여 변형을 GV3101 메파. 포함 된 LB 배지에서 재배 식민지를, 화면 50 ㎍ / ml의 리팜피신 각 벡터에 대한 특정 프라이머를 이용하여 식민지 PCR이 적절 벡터 별 항생제 (pICH20111 및 pICH14011, 50 ㎍ / ㎖의 카나마이신 pICH31070에 대한 50 ㎍ / ml의 카르 베니 실린).
      2. 개별적으로 세 A. 접종 튜메 파시 엔스 함유 LB 배지 5ml에 균주를 50 ㎍ / ㎖의 적절한 벡터 및 리팜피신 특정 항생제28 ° C에서 하룻밤 흔들.
      3. 펠렛은 하룻밤 세균 20 분 동안 4,000 XG에 원심 분리하여 문화와 10 밀리미터 MES (PH 5.5), 10 mM의 _황산의 초기 세균 배양의 두 권을 재현 탁.
      4. 세 벡터를 포함하는 박테리아 현탁액의 동일한 볼륨을 혼합하고 N.의 주사기 침투에 대한 서스펜션 믹스를 사용 benthamiana 나뭇잎. 공장 당 세 확장 잎을 침투.
      5. 4 dpi로 agroinfiltrated 잎을 수집하고 액체 질소에 동결.
      6. -80 ° C에서 보관 식물 조직.
4. 된 담배 안정적으로 발현 시스템 :
   1. 성장과 N의 체외 묘목을 유지 고체 식물 배양 배지에 tabacum (VAR SR1.) (4.4 g / L 무라 시게과 스쿡 - MS - 매체 비타민, 30g / L 자당, 산도 5.8, 7g / L 공장 한천 포함) 25 기후 실에서 통제 된 조건 하에서 16 시간 / 8 시간 일 / NI와 ° CGHT 정권.
   2. A.의 예비 - 배양을 시작 박테 리움 EHA105는 (100 ㎍ / ㎖의 스펙 티노 마이신, 300 ㎍ / ml의 스트렙토 마이신, 리팜피신 50 ㎍ / ml)에 적절한 항생제 액체 YEB 매체의 5ml에 발현 벡터 pK7WG2.G65mut을 은닉하고 진탕 세트에 28 ° C에서 하룻밤 성장 200 rpm에서.
   3. 세균 배양이 될 때까지 (100 ㎍ / ㎖의 스펙 티노 마이신, 300 ㎍ / ml의 스트렙토 마이신, 리팜피신, 50 ㎍ / ㎖) YEB 배지 플러스 항생제에 50 ml의 아그로 배양에 접종하고 24 시간 동안 성장 전 배양액 1mL를 사용 포화 (OD 0.5 ~ 1.0의 ₆₀₀ 값).
   4. 식물 액체 배지 50ml에 재현 탁하고, 20 분 펠릿 4000 XG에서 원심 분리하여 박테리아 수집. 완전히 항생제를 제거하기 위해 두 번이 단계를 반복합니다.
   5. 체외 담배 식물에서 처음 건강한 완전히 확장 잎을 가지고 약 1cm 사각형로 잘라.
   6. 전송 잎 조각깊은 배양 접시에 세균 현탁액을 포함하는 20 분 동안 어둠 속에서 떠나.
   7. 서스펜션에서 잎 조각을 제거하고 살균 필터 종이에 건조시킨다.
   8. 1.0 ㎍ / ㎖의 6 benzylaminopu​​rine (BAP) 0.1 ㎍ / ㎖의 나프탈렌 초산 (NAA)를 포함하는 고체 식물 배양 배지에 향축면 잎 조각 (위쪽 잎 표면)를 놓고 통제 된에서 기후 챔버에서 이틀 동안 판을 품다 조건 (25 ° C, 16 시간 일 / 8 시간 밤).
   9. 매체와 접촉 배축 표면 (잎의 하부면)과 (1.0 ㎍ / ml의 BAP, 0.1 ㎍ / ㎖의 NAA, 500 ㎍ / ㎖의 세포 탁심, 100 ㎍ / ㎖의 카나마이신 포함) 우수 문화 매체에 전송 잎 조각.
   10. 촬영 형성을 유도하기 위해 16 시간 / 8 시간 주간 / 야간 정권 25 ° C에서 기후 챔버 2 ~ 3 주 동안 번호판을 품어. 계대 1.0 ㎍ / ml의 BAP, 0.1 ㎍ / ㎖의 NAA, 500을 함유하는 신선한 식물 고체 배지에 잎 절편을 전송하여 모든 이주㎍ / ml의 세포 탁심, 100 ㎍ / ㎖의 카나마이신.
   11. 촬영은 500 ㎍ / ㎖의 세포 탁심과 루트 형성을 유도하는 100 ㎍ / ㎖의 카나마이신을 포함한 고체 배지를 포함 마젠타 색 박스로 전송 나타나면. 1~2주 25 ° C에서 16 시간 일 / 8 시간 밤 광주와 묘목을 품어.
   12. 때 뿌리의 형태, 온실에서 토양에 식물을 전송합니다.
   13. 각 공장의 잎 조각을 수집하고 상용 키트와 함께 게놈 DNA를 분리.
   14. PCR에 의해 특정 유전자의 존재를 검출. 다음 유전자 특이 적 프라이머를 사용하여 PCR 증폭을위한 주형으로서 게놈 DNA 30 ng의 사용 : 5'-CTGGTGCCAAGTGGCTCAGA-3 '와 5'-CACACGCCGGCAGCAGGT-3', 58 ° C의 어닐링 온도에서 20 초간의 신장 시간 . 50 ㎕의 총 부피에서 PCR 반응을 수행한다.
   15. 트리스 - 아세테이트 - EDTA (TAE) 완충액 중 1 % 아가로 오스 겔 (40 mM의 TR 전기 영동에 의해 220 bp의 생성물을 분석), 20 mM의 아세트산 및 1 mM의 EDTA.
   16. 대상 유전자를 포함하는 형질 전환 식물을 선택합니다.
   17. 선택된 형질 전환 식물체의 각에서 잎 조각을 수집하고 즉시 액체 질소에 동결.
   18. 식물 잎 조직 (단계 3.1.3)에서 총 단백질 추출물을 준비하고 이전에 가장 재조합 단백질 발현 담배 공장을 선택하려면 ^2를 설명한대로 웨스턴 블롯 분석에 의해 각각의 샘플을 테스트합니다.
   19. 교차 수분을 방지하기 위해 개화하기 전에 선택한 최고의 성능 공장의 가방 꽃.
   20. 피는 과일 숙성 종자 건조 후, 가방을 수집합니다.
   21. 왕겨에서 분리 씨와 온도 조절 (20 ~ 24 ° C에서)에서 건조한 장소에 보관하십시오.
   22. 2 세대 형질 전환 식물을 생산하고 이후 자체 수분으로 최고 성능의 시스템을 선택하기 위해 건조 된 씨앗을 뿌리고.
   23. 후속 세대 2.4.19-2.4.21 단계에서 설명 된 것과 동일한 절차를 반복한다.

3. 재조합 단백질 발현 분석

1. 총 단백질 추출 :
   1. 세균 세포 :
      1. TBS 버퍼의 절반 배양 부피, 단계 2.1.5에서 설명 된 바와 같이 수집 된 박테리아 세포 펠렛을 재현 탁 (TBS - 2 mM 트리스 / 염산, 500 mM의 염화나트륨) 1 밀리미터 phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF)로 보충하여 pH 7.4.
      2. 얼음에 샘플을 유지하면서 초음파 처리는, 반 전력에서 40 초 동안 세포 펠렛을 세 번 재현 탁.
      3. 4 ℃에서 20 분 동안 14,000 XG에서 원심 분리 해물을 명확히.
      4. 전송 깨끗한 튜브에 뜨는는 -80 ° C에서 별도로 뜨는 펠렛을 모두 저장합니다.
      5. 격렬한 실온에서 밤새 진탕하여 6 M 우레아로 보충 TBS 산도 8.0의 절반 세포 용해질 부피, 펠릿 수집 봉입체를 가용화.
      6. 실온에서 25 분 동안 10,000 XG에 원심 분리기 깨끗한에서 상층 액을 수집튜브.
      7. -80 ° C에서 모두 뜨는 펠렛을 저장합니다.
   2. 곤충 세포 :
      1. (- 137 mM의 NaCl을, 2.7 mM의 KCl을 10 mM의 나 ₂ HPO _4, 1.8 mM의 KH ₂ PO ₄ PBS)의 pH 7.4 인산염 완충 생리 식염수 1 ml로, 단계 2.2.12에 설명 된대로 수집에 감염된 곤충 세포 펠렛을 씻으십시오.
      2. 용해 완충액 200 μL에 재현 탁 셀 (20 mM 트리스 / 염산 pH를 8.0, 0.5 M의 NaCl, 3 밀리미터 β 머 캅토 에탄올, 1 % 트윈 -20) 30 분 동안 얼음 위에서 배양한다.
      3. 원심 분리기는 4 ° C에서 20 분 동안 14,000 XG에서 세포를 용해.
      4. -80 ° C에서 용해 분수와 저장소를 수집하고 펠렛을 폐기합니다.
   3. 식물 잎 조직 :
      1. 갈기 N. benthamiana 또는 N. 박격포와 유 봉 사용하여 액체 질소의 미세 분말에 tabacum 조직.
      2. 추출 버퍼 300 μL에 지상 조직 100 mg의 균질화 (40 mM의 헤 페스의 pH 7.9, 5 mM의 DTT, 1.5 %의 CHAPS), 석류프로테아제 억제제 칵테일의 3 μL와 emented과 얼음에 해동.
         주 : 식물 조직 무게 (g) 사이의 선택 비는 부피 (㎖)를 버퍼 1 : 3이다.
      3. 4 ℃에서 30 분 동안 30,000 XG에 원심 분리기 추출물.
      4. -80 ° C에서 깨끗한 튜브 및 저장소에 뜨는 수집합니다.
2. 쿠마시 염색 겔 :
   1. 추출 완충액 10 μL의 최종 부피 전체 단백질 추출물 (예를 들면, 식물 추출액 2㎕의 세균 및 곤충 추출물 5 μL)의 적절한 희석액을 준비하고 3X 샘플 버퍼 5 μl를 추가 (1.5 M 트리스 / 염산 pH를 6.8, 1X 최종 농도 3 % SDS, 15 % 글리세롤, 4 % β 메르 캅토 에탄올).
   2. 10 분 동안 삶아 샘플.
   3. 10 % SDS-PAGE에 의해 분리 된 단백질.
   4. 전기 영동 한 후, 약 2 분 동안 전자 레인지에서 쿠마 용액 A (0.05 % 브릴리언트 블루 R-250, 25 % 이소프로판올, 10 % 아세트산)의 존재하에 가열 겔비등점까지의.
   5. 부드러운 흔들림 실온에 젤을 냉각.
   6. 폐기 쿠마시 염색 액 A.
   7. 쿠마 용액 B의 존재 하에서 가열에 의해 Destain 겔 (0.05 % 브릴리언트 블루 R-250, 25 % 이소프로판올), C (0.002 % 브릴리언트 블루 R-250, 10 % 아세트산) 및 D (10 % 아세트산)마다 염색 동일한 프로토콜에 따라.
   8. 배경 ⁹ 분명하다까지 솔루션 D와 마지막 가열 단계 후, 젤 탈색을 둡니다.
3. 웨스턴 블롯 분석 :
   1. 전기 영동 후, 전송을 실온에서 1 시간 동안 PBS pH를 7.4에서 표준 기술 및 4 %의 우유를 사용하여 블록 한 다음, 니트로 셀루 로즈 막으로 단백질을 분리 하였다.
   2. 4 ℃에서 하룻밤 부화 블롯 또는 1 표적 단백질에 대해 발생 된 토끼 차 항체 함유 블로킹 용액에 실온에서 4 시간 동안 10,000 및 0.1 % 트윈 -20로 보충한다.
   3. 차 항체 라벨 후ING는 0.1 % 트윈 -20을 함유하는 차단 용액을 5 분마다 막 3 회 세척 하였다.
   4. 하나의 호스 래 디쉬 퍼 옥시 다제 (HRP) 공역 항 - 토끼 항체와 인큐베이션 : 10000 시간 1.5.
   5. 워시 막 5 분 PBS-T 각각 5 배 (PBS 0.1 %가 트윈 (20)와 보충).
   6. 화학 발광 퍼 옥시 다제 기판을 이용하여 웨스턴 블롯을 처리합니다.
4. 방사선 면역 분석 (RIA)
   1. 시약 (항혈청, 추적 및 단백질 파로스)는 실내 온도와 피펫 12 X 75mm의 폴리스티렌 튜브에 (재조합 상업 hGAD65의 300-2,400 ng를 / ㎖에서) 서로 다른 농도의 단백질 추출물 시료와 표준의 20 μl를 도달 할 수 있습니다.
   2. 항혈청의 20 μl를 추가 1:30 T1D 환자의 혈장에서 혈청을 희석 준비했다.
   3. 추적자 (125-I-GAD65)의 50 μl를 추가하고, 실온에서 2 시간 동안 배양한다. 단지 전체 활동을 추정하기 위해 추적에 튜브를 설정합니다.
   4. 50 μl를 추가단백질 파로스 실온에서 1 시간 동안 배양한다.
   5. 차가운 PBS 1 ml를 30 분 동안 4 ° C에서 1,500 XG에서 각 튜브와 원심 분리기로 버퍼 분배.
   6. 상층 액을 제거하고 부드럽게 튜브를 눌러 압지에 잔류 액체를 흡수하기 위해 튜브를 가만히 따르다.
   7. 측정은 감마 카운터에서 1 분간 계산하여 모든 튜브에 방사능 면역.
   8. 로그 스케일 플롯 활동과 관련된 총 교정기의 결합 비율 (B / T의 %)은, 표준 곡선을 설정하고, 검량선 ¹⁰ GAD 오프 샘플의 농도를 판독한다.
      참고 : 제한된 영역은 저장, 처리 및 방사성 물질의 처리를 위해 설계되어야한다.

Results

다른 생산 시스템의 목표 재조합 단백질의 이종 발현을위한 실험 설계는 여기에 설명되어 있습니다. 제 1 초점 각 시스템에서 목적 단백질의 발현을 위해 최적의 조건을 설정함으로써 다른 플랫폼의 셋업이다.

표적 단백질의 발현 hGAD65mut는 E. 중으로 유도 하였다 대장균 문화. 37 ° C에서 3 시간의 발현 후, 균체를 원심 분리에 의해 수집하고, 초음파 처리에 의해 용해. 원심 분리 단계 이후에, 수용성 단백질은 불용성 봉입체 분리 및 초기 분석 (데이타 미기재) hGAD65mut은 불용성 봉입체에서 축적 prevalently 것을 증명 하였다. 재조합 단백질 용액 화는 강한 변성 속성, hGAD65mut 불가 적절한 정량을, RIA 분석을 방해하는 요소 6 M의 사용이 필요합니다. 몇 가지 전략이 될 수있다EN은, 봉입체의 형성을 제한하는 낮은 온도에서 ¹¹ 균체 성장하기위한보고. 배양 물은 15 ° C, 20 ° C...

Discussion

박테리아 세포, 배큘로 바이러스 / 곤충 세포 및 식물 : 본 연구에서는 세 가지 플랫폼은 재조합 인간 단백질의 발현을 비교 하​​였다. (- MagnICON 및 pK7WG2 기반 - 안정적인 즉, 과도) 식물 기반 플랫폼은 더 세 널리 사용되는 표현 기술을 이용하여 탐구 하였다. 이 실험 hGAD65mut 위해 선택된 표적 단백질은 이전에 다른 시스템 ^(13)으로 표현되었고, 그것의 생산 및 기능은 쉽게 검출 및 측정 할 수있다 ^(14).

hGAD65mut는 봉입체를 형성하기 때문에 세균 세포 따라서 힘드는 가용화를 요구 및 원시 형태를 달성하는 폴딩에도 저온 성장 조건에서, 효율적인 생산 플랫폼 아니었다. 실제로 복잡한 재조합 단백질의 발현을위한이 플랫폼의 주요 장애는 최종 제품의 우측 형태이다.

배큘로 바이러스 / 곤충 세포 플랫폼은 면역 재조합 단백질의 고 발현을 ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
효모 추출물	Sigma	Y1333
Tryptone	Formedium	TRP03
Agar Bacteriological Grade	Applichem	A0949
Sf-900 II SFM medium	Gibco	10902-088
Grace' s 곤충 배지, 보충되지 않은	Gibco	11595-030
Cellfectin II 시약	Invitrogen	10362-100
비타민을 포함한 MS 배지	Duchefa Biochemie	M0222
설탕	Duchefa Biochemie	S0809
식물 한천	Duchefa Biochemie	P1001
암피실린 나트륨	Duchefa Biochemie	A0104	독성
겐타마이신 황산염	Duchefa Biochemie	G0124	독성
간시클로비르	Invitrogen	I2562-023
카르베니실린 디소	듐 Duchefa Biochemie	C0109	독성
카나마이신 황산염	Sigma	K4000	독성
리팜피신	Duchefa Biochemie	R0146	독성 & 은대쉬; DMSO
스트렙토마이신 설페이트	Duchefa Biochemie	S0148	독성
스펙티노마이신 디하이드로클로라이드	Duchefa Biochemie	S0188
IPTG(이소프로필-&베타;-D-1-티오갈라토피라노사이드)	Sigma	I5502	독성
MES 수화물	Sigma	M8250
MgCl2	Biochemical	436994U
아세토시링곤	그마	D134406	독성 – 0.1 M 재고 DMSO
주사기 (1 ml)	Terumo
MgSO4	Fluka	63136
BAP (6-벤질아미노퓨린)	Sigma	B3408	독성
NAA (나프탈렌 아세트산)	Duchefa Biochemie	N0903	자극성
Cefotaxime	Mylan Generics
Trizma base	Sigma	T1503	Tris-HCl 버퍼를 만들기 위해 1 N HCl로 pH 조정
	Sigma	H1758	부식성
NaCl	Sigma	S3014	1 M 재고
KCl	Sigma	P9541
Na2HPO4	Sigma	S7907
KH2PO4	Sigma	P9791
PMSF (Phenylmethanesulfonylfluoride)	Sigma	P7626	부식성, 독성
요소	Sigma	U5378
β-메르캅토에탄올	Sigma	M3148	독성
트윈-20	Sigma	P5927
Hepes	Sigma	H3375
DTT (Dithiothreitol)	Sigma	D0632	독성 – 1 M 재고, -20 °에서 보관; C
CHAPS	Duchefa Biochemie	C1374	독성
식물 프로테아제 억제제 칵테일	Sigma	P9599	너무 많이 동결/해동하지 마십시오
SDS (Sodium dodecyl sulphate)	Sigma	L3771	가연성, 독성, 부식성 – 10% 재고
Glycerol	Sigma	G5516
Brilliant Blue R-250	Sigma	B7920
이소프로판올	Sigma	24137	가연성
아세트산	Sigma	27221	부식성
항글루타민산 탈카르복실라제 65/67	Sigma	G5163	너무 많이 동결/해동하지 마십시오
양고추냉이 과산화효소(HRP)-접합체 항토끼 항체	Sigma	A6154	너무 많이 동결/해동하지 마십시오
Sf9 세포	수명 기술	11496
BL21 유능한 E. coli	New England Biolabs	C2530H
단백질 A 세파로스	Sigma	P2545
세포 배양 플레이트	Sigma	CLS3516
Radio Immuno Assay kit	Techno Genetics	12650805	Radioactive material