DNA 메틸화 분석 차세대 시퀀싱 대상

요약

BSAS(Bisulfite amplicon sequencing)

Bisulfite 앰플리콘 염기서열분석(BSAS)은 관심 대상 게놈 영역에서 시토신 메틸화를 정량화하는 방법입니다. 이 방법은 차세대 염기서열분석 전에 표적 영역의 PCR 증폭과 쌍을 이루는 중아황산염 변환을 사용하여 염기 특이적 수준에서 DNA 메틸화의 절대 정량을 생성합니다.

초록

유전자 발현 조절에서 후성유전학적 과정의 역할은 수년 동안 알려져 왔습니다. 시토신 잔기에서의 DNA 메틸화는 유전자 발현의 오래 지속되는 동적 조절자인 것으로 입증되었기 때문에 후성유전학 연구에서 특히 중요합니다. 건강과 질병의 후성유전학적 변화를 조사하려는 노력은 처리량이 많고 정량적으로 정확한 방법이 없기 때문에 방해를 받았습니다. 차세대 염기서열분석(NGS) 기술의 출현과 대중화로 인해 이러한 도구는 이제 기존의 유전체 및 전사체 방법론 외에도 후성유전체학에 적용되고 있습니다. 특정 유전자 프로모터 또는 CpG 섬과 같은 관심 영역이 확인되고 높은 정량적 정확도로 상당한 수의 샘플을 검사해야 하는 시토신 메틸화의 후성유전학적 연구를 위해 BSAS(Bisulfite Amplicon Sequencing)라는 방법을 개발했습니다. 이 방법은 중아황산염 변환과 관심 영역의 표적 증폭, 트랜스포좀 매개 라이브러리 구축 및 벤치탑 NGS를 결합합니다. BSAS는 한 번에 최대 96개의 샘플에서 최대 10kb의 대상 영역을 분석할 수 있는 빠르고 효율적인 방법을 제공하며, 이는 기본적인 분자 생물학 기술을 갖춘 대부분의 연구 그룹이 수행할 수 있습니다. 그 결과 염기 특이성을 가진 시토신 메틸화의 절대 정량화를 제공합니다. BSAS는 모든 DNA 소스의 모든 게놈 영역에 적용할 수 있습니다. 이 방법은 전체 게놈 중아황산염 염기서열분석, 감소된 대표성 중아황산염 염기서열분석 및 메틸화된 DNA 면역침전 염기서열분석과 같은 게놈 전체 메틸화 분석에서 확인된 영역을 확인하는 것뿐만 아니라 관심 대상 영역에 대한 가설 테스트 연구에 유용합니다.

서론

그것은 자연스럽게 시토신 메틸화 ^(1)의 형태로 DNA의 변형 발생의 첫 번째 보고서 이후 반세기에 걸쳐있다. 시토신 메틸화베이스 링에 5 ^번째 탄소 메틸기 (5-MC)는, 가장 빈번하게 포유 동물 게놈에서의 CpG 디 뉴클레오티드 모티브에서 발생 갖는 변성 시토신 뉴클레오티드 염기이다. 부재가 전사 활성과 ^{연관이있는} 동안 유전자 프로모터의 5-MC의 존재는 일반적으로 작용 성, 전사 억제와 관련된다.

엄청난 진보 발전 ^3의 DNA 메틸화, 후생 유전 학적 프로파일 ^{4, 5,6} 암 발병 기전 및 다른 연구 분야의 수의 transgeneration 전파의 역할에 대한 이해 만들어왔다. 신규 방법론은 DNA 메틸화 ⁷ 프로파일 개발되었다 이러한 많은 진보는 지난 몇 년 동안왔다. 출현 및차세대 시퀀싱 (NGS) 기술의 대중화는 이제 전체 게놈 또는 게놈 ^(8)의 큰 영역에 걸쳐 DNA 메틸화를 프로파일 링하는 방법은 여러 가지가있을 수 있습니다. 이러한 접근은 DNA 메틸화 패턴 및 DNA 메틸화의 차이를 정량화 연구의 발견 가능성을 연다. 이러한 가설 발생 방법에 더하여, 타겟 / 가설 테스트 DNA 메틸화 정량 방법에 대한 상당한 필요성이 존재한다.

pyrosequencing 기법, 메틸화 특이 PCR, 바이 설 파이트 변환 된 DNA와 직접 생거 시퀀싱은 대상 영역의 분석을 위해 가장 많이 사용되는 방법이 있었다 (예를 들어, 하나의 유전자의 프로모터 영역 또는 CpG 아일랜드) ^9-12. 메틸화 된 시토신의 그대로 ^{13, 14을} 유지하면서 이러한 모든 방법, 중아 변환, 메틸화 된 시토신의이 우라실의로 변환 화학 탈 아미 노화 반응에 의존하고있다. bisulfite-의 PCR 증폭차동 메틸화 염기 차이로서 판독 할 수 티민 ¹⁵ 우라실의 여분의 DNA에 변환 결과. 매우 유용하지만, 이러한 방법에 제한이 낮은 양적 정확성, 짧은 읽기 길이, 낮은 시료 처리를 포함한다. 이러한 한계를 해결하기 위해 우리는 우리가 (BSAS) ¹⁶ 바이 설 파이트의 증폭 시퀀싱이라고 한 방법을 개발했다. 이 방법의 목적은 높은 정밀도로 정량 많은 수의 샘플에 대한 관심의 대상 게놈 영역을 분석 할 수 있어야한다.

BSAS은 기존의 방법의 요소 (중아 변환 및 지역별 PCR 증폭)를 사용하고 간단한 차세대 라이브러리 건설 (transposome 매개) ⁽¹⁷⁾ 및 벤치 탑 NGS ⁽¹⁸⁾ (그림 1)로 결합되어 있습니다. 이 방법은 관심의 영역에서 시토신 메틸화를 검사 할 수있는 정량적 및 높은 처리량 방법을 제공한다. 여기에 우리가 제시세부 방법 및 문제 해결과 품질이 BSAS 프로세스를 확인하는 방법을 설명합니다.

프로토콜

조직 1. 핵산 분리

참고 : 동일한 조직 샘플에서 DNA와 RNA의 공동 절연은 유전자 발현 분석 용 후생 유전 학적 분석을 위해 DNA와 RNA 페어링을 수집 할 수있는 기회를 제공한다. 여기에 주어진 예를 채용 할 수 있지만, 다른 실험 조직 샘플 또는 다른 유형의 분리를위한 대안적인 접근 방법에서 칼럼 정제의 형태이다. 주요 요구 사항은 단백질 또는 유기 용제를 오염없이 고순도 핵산입니다.

1. 기계 균질화를위한 신선한 냉동 또는 신선한 조직의 조각을 선택하고 얼음에 배치합니다. 2.0 ml의 둥근 바닥 microcentrifuge 관에 저장 또는 전송 조직.
2. 조직을 포함하는 각 관 한 5mm 스테인리스 구슬을 추가합니다. 세포 수 또는 조직 중량의 제조업체의 제안에 기초하여 용해 완충액을 적당량 추가.
3. 비드 밀에서의 기계적 균질화를 사용하여 조직을 균질화30 초 동안 30 Hz에서.
   주 : 주파수 및 기계적 균질화 시간은 조직 유형에 의존한다. 부드러운 조직이 완전히 강하다는 조직을 최적화 설정을 필요로하지만, 권장 설정을 사용하여 균질화한다.
4. 제조사의 프로토콜 다음 실온에서 실리카 스핀 컬럼을 사용하여 DNA 및 RNA 분리를 수행한다.
   1. 얼음의 RNase없는 물과 장소 50 μL에서 용출 RNA. qPCR에 의한 mRNA 발현 분석을위한 RNA를 사용합니다.
   2. TE 완충액 100 ㎕에서 DNA를 용출시켰다. DNA 농도와 수율을 증가 용리액을 사용하여 컬럼 DNA 반복 끄기 용출. 대상 메틸화 정량 DNA를 사용합니다.
5. 230 나노 미터, 260 나노 미터, 280 나노 미터 및 320 nm에서의 흡광도에 대한 표준 분광 광도계를 사용하여 DNA와 RNA의 품질을 평가.
   참고 : A260 / A280 비율이 높은 품질의 DNA를위한 ~ 1.8-2해야한다. A260 / A280 비율은 2 ~ 고품질의 RNA에 대한 있어야합니다. 230 nm의 인도에서의 과잉 흡수의 존재분리 과정에서 오버라이드 오염 물질.
6. 품질은 제조업체의 지시에 따라 모세관 전기 영동 칩을 이용하여 RNA를 추가로 확인한다.
   참고 : 고품질의 RNA는 RNA 무결성 번호 (RIN)> 8있을 것이다. rRNA의 피크 외에 electropherogram에 여분의 피크의 존재는 샘플 오염을 나타냅니다.
7. 제조 업체의 프로토콜에 따라 형광 분석에 의해 DNA 및 RNA를 정량화.
   참고 : 형광 분석을 사용하여 단독으로 분광 광도법보다 핵산의 정량에 더 민감하고 특이하다.
8. 스토어는 -80 ° C에서 DNA 및 RNA를 격리.

2. 대상 식별 및 프라이머 디자인

1. 관심 게놈 영역 (들)을 결정하는 적절한 참조 게놈 서열에 기초 BSAS 의해 분석된다. 발현 된 유전자의 유전자 프로모터 메틸화 정량의 일반적인 대상입니다.
2. 실리코 중아 - 변환에 준비시퀀싱 이후 정렬 에드 참조 게놈은 텍스트 편집기에서 .fasta 시퀀스 파일을 변경하여 읽습니다. 5'-3 '방향으로, 티민의 (그림 2)와 비의 CpG는 시토신의 교체.
3. 디자인 프라이머는 중아 변환 된 DNA에서 관심의 영역을 증폭 설정합니다.
   1. 선택하고 중아 특정 PCR 프라이머 디자인 프로그램 (그림 3)에, 5'-3 '방향으로 관심의 변환되지 않은 영역을 복사합니다.
      주 : 최적 중아-PCR 앰플 리콘 길이 bisulfite를 단편 DNA 앰플 리콘으로서 당 250-400 BP이며 400> BP 큰 영역을 증폭하는 것이 곤란하다. 예를 들어, 1킬로바이트의 관심 영역 인 경우, 복수의 프라이머 쌍은이 영역을 커버하도록 설계 될 수있다. 디자인 증폭 산물은 쉽게 풀링에 대한 동일한 염기쌍의 크기 여야합니다. 이 라이브러리 생성을위한 불충분 한 길이있을 수 있기 때문에 amplicon의 길이 <250 염기쌍을 피하십시오. BSAS을위한 최적의 프라이머의 길이는>이다프라이머 당 20 염기쌍.
   2. 앞으로 사이에 55 ~ 65 ° C의 T의 _{m 범위와} 최대 T의 _{m 차를} 선택하고 1-2 ° C에서의 역방향 프라이머.
   3. 가장 관심 영역을 커버 프라이머 쌍을 선택합니다. 이 PCR 반응에 바이어스 원인이됩니다 소비재 사이트를 포함하거나의 CpG 사이트에 직접 인접 프라이머를 선택하지 마십시오. 학술 또는 상업적 공급자의 수에서 주문할 수 있습니다 표준 PCR 프라이머를 사용합니다.
   4. 100 μM의 작업입니다에서의 RNase / DNase를 무료로 물에 동결 건조 된 프라이머를 복원합니다.
4. -20 ° C에서 보관 PCR 프라이머. PCR 반응에 대한 재고를 작업 10 μM 100 μM 프라이머 주식을 희석.

3. 바이 설 파이트 특정 PCR 최적화

참고 : 게놈 DNA의 중아 변환의 경우, 중아 변환에 대해 서로 다른 상업 키트의 번호를 사용할 수 있습니다. 가장 계획된 실험에 맞는 키트 또는 프로토콜을 선택합니다.

1. 게놈 DNA의 μg의 2 NG (200) 사이를 사용합니다. 최적화 실험을 위해, 다수의 BS PCR 반응을 위해 충분한 DNA를 바이 설 파이트 변환을 위해 여러 전환 반응을 실행.
2. 높은 DNA 농도를 유지하기 위해 변환 된 중아 DNA의 작은 (예를 들면, 10 μL) 용출 볼륨을 사용.
   주 : 1 μg의 DNA가 게놈 변환 입력에 사용 된 경우, 변환 중아 DNA 1-2 μL 최적화 PCR 반응에 충분하다.
3. 중아 특정 PCR에 의한 아황산 수소 변환 된 DNA를 증폭. BS-PCR 반응은 중아 변환 된 DNA를 증폭 할 수있는 DNA 형성 촉매 효소를 사용이 필요합니다.
   1. 하나의 앰플 리콘의 표적 증폭 최적화하기 반응을 조립한다. 다수의 샘플의 경우, 96 웰 플레이트에 PCR 반응을 조립한다.
      25 μL 반응 완충액 배
      0.5 μL의 dNTP 믹스
      5 μL 10 μm의 정방향 프라이머 (최종 1 μM)
      5 μL 10 μm의 역방향 프라이머(최종 1 μM)
      2 μL 템플릿 중아는 DNA를 변환
      0.4 μL (5 U / μL) DNA 폴리머 라
      12.1 μL DNase의 유리수 (최종 반응 부피 50 μL)
   2. 적절한 접착제 또는 열 융착 필름 PCR 플레이트를 밀봉합니다.
   3. 적절한 열 자전거 타는 사람의 반응을 놓고 가열 뚜껑 다음 사이클링 조건을 사용합니다
      1. 10 분 동안 95 ° C에서 초기 변성을 수행합니다.
      2. 30 초 동안 95 ℃에서 변성.
      3. 프라이머의 구체적인 T _m에서 30 초 동안 어닐링 사용된다. 어닐링 온도에서 최적화 반응을위한 프라이머의 T의 _m 아래 몇 ° C의를 시작합니다.
         주 : 최상의 소둔 온도는 온도 범위를 테스트하는 구배 열 사이 클러를 사용하여 결정될 수있다.
      4. 30 초 동안 72 ° C에서 확장 기능을 수행합니다. 더 이상 증폭 산물의 내선 시간을 길게.
      5. 반복 3.3.3.2-3.3.3.4 35 사이클 단계초기 최적화를위한 할거야. 높은 사이클 번호가 필요할 수 있지만, 일반적으로 반응 아티팩트를 생성합니다 클론 증폭을 방지하기 위해 피해야한다.
      6. 7 분 72 ° C에서 최종 확장을 수행합니다.
      7. 4 ℃에서 반응을 잡습니다.
   4. PAGE 전기 영동에 의해 증폭 산물을 시각화. 대안 적으로, 제조자의 프로토콜에 따라 모세관 전기 영동 DNA 칩을 사용한다.
      1. 얼음 소용돌이에 5 배 로딩 염료의 6 μL와 PCR 반응의 24 μl를 섞는다.
      2. O. DDH _2의 버퍼와 800 ml의 5 배 TBE 200 ㎖를 혼합 실행하여 1X TBE 버퍼를 실행 한 L합니다 DDH ₂ O 로딩 염료에 웰 당 0.5 μg의 최종 농도를 위해 DNA 사다리 희석.
      3. PCR 반응 또는 사다리의 30 μL와로드 웰.
      4. 45 분 ~ 200 V에서 젤을 실행합니다. 제 염료 프론트 겔의 끝에 도달하면 겔 실행을 중지.
      5. 5 ㎍ / ㎖로 젤을 얼룩DDH ₂ O. 100ml에 10 ㎎ / ㎖의 5 μL를 혼합함으로써 티듐 브로마이드 전체 젤을 덮고 ~ 5 분 동안 품어 보자.
      6. 이미지의 482 nm의 여기 파장에서의 UV 광 박스 또는 봉형 이미 저를 통해 겔.
      7. 크기 PCR 증폭 산물 사다리를 참조 및 예상 amplicon의 크기보다 다른 여러 밴드 (그림 4A 및 C)를 찾아 반응의 특이성을 결정합니다.
   5. 일단 BS-PCR을위한 최적의 조건은 실험 샘플에 BS-PCR을 수행, 결정되었습니다.
      1. 나머지 프라이머 및 다른 반응 성분의 증폭 물을 정화. 실리카 컬럼 정화, SPRI 구슬, 또는 젤 기반 청소 및 정량화를 수행합니다.
      2. 30 ㎕의 TE 버퍼에 용출 증폭 산물.
      3. 제조업체의 프로토콜을 사용하는 형광 분석법을 이용하여 증폭 산물을 정량화.
      4. 샘플 당 다수의 증폭 물이있는 경우, 동일한 부피 당 중량 그들을 풀-20 ° C에서 양 및 저장.

4. NGS 라이브러리 준비 및 도서관 QC

참고 : BSAS NGS 라이브러리 준비 듀얼 인덱싱 단순화 transposome 매개 프로토콜을 사용은 (라이브러리 준비 키트 선택에 대한 자세한 내용은 재료 목록 참조). 이 방법은 바이 설 파이트 시퀀싱 애플리케이션 ^{16, 19에} 어떤 편견이 거의 확인하고 보여줍니다 된 라이브러리 건설을위한 매우 신속하고 높은 처리량 경로를 제공합니다. 듀얼 인덱스는 하나의 인덱스보다 샘플의 높은 다중화 할 수 있습니다. 다른 라이브러리 준비 스타일이 가능한 경우가 있습니다 만, 테스트되지 않았습니다.

1. 96 웰 PCR 플레이트에서 BS PCR 증폭 산물의 NGS 라이브러리를 준비합니다. / 0.2 NG 증폭 물에 희석 한 NG, NG 또는 0.2 / μL 희석액 5 μL의 최종 입력 질량 μL. SPRI 비즈를 사용하여 생성 된 라이브러리 정리를 수행합니다. w 라이브러리를 분리를 위해 50 ~ 90 μL SPRI 비즈를 사용하여이 프로토콜 번째. SPRI 비즈의 부피는 라이브러리의 목표 크기와 원하는 시퀀싱 반응의 싸이클 횟수에 의존한다.
   참고 : 구슬을 재현 탁하는 마이크로 쉐이커 또는 판 vortexer를 사용합니다.
   1. 구슬 떨어져 라이브러리를 용출하고 새로운 96 웰 플레이트에 전송하고 -20 ° C에서 저장을위한 열 융착 필름 밀봉.
2. 라이브러리 (그림 4B 및 D)의 크기와 농도를 결정합니다.
   1. 제조 업체의 프로토콜에 따라 칩 크기를 조정 모세관 전기 영동 DNA에 실행 라이브러리.
      1. 라이브러리 검출 피크의 평균 크기 및 제조자의 프로토콜에 따라 몰 농도의 추정을 결정하기 위해 고감도 모세관 전기 영동 DNA 분석법을 사용한다.
   2. 알려진 농도 생성 된 라이브러리 및 사용 기준의 어댑터 시퀀스에 대해 설계 프라이머를 이용하여, qPCR에 의해 라이브러리를 정량화.
      1. 실행 qPCR에 다시제조사의 프로토콜에 따라 절대 정량 설정을 사용하여 실시간 동작 악기.
      2. 라이브러리의 몰 농도를 계산하는 qPCR의 라이브러리에서의 크기 및 몰 정량을 사용한다.
3. pH를 8.5에서 0.1 % 트윈 -20과 함께 10 mM 트리스 - (CL)를 사용하여 4 nm의 라이브러리를 희석. -20 ° C에서 열 융착 필름으로 밀봉 96 웰 PCR 플레이트에 보관 라이브러리.

벤치 탑 시퀀서를 사용하여 5. 시퀀싱 라이브러리

1. 밖으로 해동 제조업체의 지침에 따라 시약을 준비합니다.
2. 얼음에 4 nM의 라이브러리를 녹여.
3. 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 0.2 N NaOH를 1 mL로한다.
4. 동일 부피의 양으로 풀 4 nm의 라이브러리는 라이브러리는 여러 경우에 사용된다.
5. 희석시켜 원하는 최종 몰 농도는 제조업체의 지침에 따라 풀링 된 라이브러리를 변성시킨다.
   1. 희석 유지하고 변성준비가 될 때까지 얼음에 풀링 라이브러리는 시약 카트리지를로드합니다.
6. 샘플 시트 샘플 이름을 포함하고 대응하는 인덱스 정보를 생성하고 파일 만 .fastq 생성하도록 지정합니다.
   1. 시퀀서에 대응하는 샘플 시트 폴더에로드 샘플 시트.
7. 잘 대응에 시약 카트리지 (600) 희석 μL 변성 도서관의 총을 추가합니다.
8. 완료 시퀀싱 반응을 실행합니다.

6. 메틸화 정량 데이터 분석

참고 : 오픈 소스 및 상용 포함 NGS 데이터 분석에 사용할 여러 프로그램이 있습니다. 실행중인 프로그램에 대한 정보는 각각의 특정 패키지를 찾을 수 있습니다. 일반 지침은이 소프트웨어 패키지의 특정 명령과 함께 각 단계에서 제공됩니다. (이 프로토콜에서 사용되는 소프트웨어에 대한 자세한 내용은 재료 목록 참조).

1. 적절한 자체로 가져 오기 .fastq.gz 파일트리밍 읽기에 사용하기 위해 품질 평가 점수 (Qscores)를 유지 분석 파이프 라인을 quencing. (이 예제 프로그램의 '가져 오기'를 선택하고 읽는 생성하는 데 사용되는 시퀀싱 방법을 선택합니다. 가져올 파일을 읽을 .fastq.gz 선택하고 읽기 '일반 아래'폐기 품질 평가 점수 '를 선택 취소하여 응용 프로그램을 트리밍 .fastq 파일에서 Qscores을 유지 마침을 '옵션'수입 읽기를 선택하십시오. 위치를 선택 '.)
   1. 트림과 NGS 데이터 분석 파이프 라인에서 다음 설정을 사용하여 읽기 유지합니다. (이 프로그램의 'NGS의 핵심 도구'에서 '트림 시퀀스'를 선택하고 트리밍 할 수 읽기를 선택합니다.)
      1. 만 ≥ Q30 점수를 포함 읽고 보관하십시오. (이 프로그램의 '품질 평가 점수를 사용하여 다듬기'를 선택한 0.001에 제한을 설정합니다.)
      2. 유지 만 ≤ 1 모호한 염기를 포함 읽습니다. (이 프로그램의 '트림 모호한 뉴클레오티드'을 선택하고 설정1. '모호성의 최대 수는'읽기 손질 저장할 위치를 선택하고 '마침'를 선택합니다.)
   2. 지도는 2.2에 실리 중아 변환 유전자 참조로 읽어 손질. (예를 들어 소프트웨어의 'NGS의 핵심 도구'에서 '지도 참조로 읽어'를 선택합니다. 트림을 선택하면 매핑 '다음'을 선택합니다. 변환 된 레퍼런스 시퀀스를 선택하고 '참조 마스킹'에서 '더 마스크'를 선택하지 될 읽습니다. 선택 ' '다음.)
      1. 불일치, 삽입 및 삭제에 대한 최대 벌금을 할당합니다. 설정 파라미터는 판독 길이의 100 %가 90 %의 서열 동일성에 매핑하는 데 필요한되도록. 예를 들어 소프트웨어의 경우, 불일치, 삽입 및 삭제 3의 점수를 할당합니다. 참조에 매핑 읽기 길이의 최소 부분 1의 점수를 할당하고 읽고 참조 매핑 된 사이 정체성의 최소 비율 0.9의 점수를 할당합니다.
      3. 정렬 출력은 독립적 인 파​​일로 각각의 샘플을 생성합니다. 예를 들어 소프트웨어의 선택 '독립형 만들기 매핑 읽기' '출력 옵션'과 '결과 처리'에서 '저장'아래에 있습니다. 읽기 매핑을 저장하고 '마침'을 선택 할 수있는 위치를 선택합니다.
   3. 매핑 된 읽기에 변형 호출 워크 플로우를 실행합니다. 예를 들어 소프트웨어의 경우, '시퀀싱 분석'에서 '확률 론적 변형 탐지'를 선택하여 분석 할 수있는 읽기 매핑을 선택하고 '다음'을 선택합니다. 선택 '필터를 읽기'에서 '비 특정 일치를 무시'와 '다음'를 선택합니다.
      1. 시퀀스는 출발에 있는지 확인1000 '의미'에 '최소한의 범위'를 설정하여 ≥ 1000 X의 일.
      2. 변형 호출이 앞으로 모두에 있는지 확인하고 읽어 역. 예를 들어 소프트웨어의 선택 '앞으로 모두에서 존재를 필요로하고 스탠드 역' '변형 필터'항목과 '다음'를 선택합니다.
      3. 수출 정렬, 변형 주석 테이블로 데이터를했다. 예를 들어 소프트웨어의 경우, '출력 옵션'에서 '주석 테이블 만들기'를 선택하고 변형 테이블 파일을 저장할 위치를 선택합니다. '마침'를 선택합니다.
2. 변이체 테이블 파일에서 관심 영역에서 주석의 CpG 부위에서 변형 주파수를 이용하여 5-MC 백분율을 계산한다. CG의 기준 C에서 시토신의 주파수는 5-MC 백분율이다.
   참고 : 높은 메틸화 된 CpG의에 대한 알고리즘을 호출 변형을 사용하는 경우, thymines와의 CpG 사이토를 교체합니다. 이 식별자됩니다의 CpG의에서 시토신 주파수의 결과로, 변종으로 회계 연도는 시토신의 매핑.
3. 제 C의 비율이 기준 (C)에서의 CpG 부위에 없어 계산하여 바이 설 파이트 변환 효율 (BSC)를 결정. 기준 T의 (C _MPT)에 매핑 된 총 C의에 의해 총 T의 매핑 (T의 _MP)의 수에 의하여 비의 CpG C의 비율 및 분할을 곱하십시오. (100)은 마이너스 계산 주파수는이 라이브러리 (수학 식 1)의 바이 설 파이트 변환 효율 (BSC)이다.



수학 식 1 바이 설 파이트 변환 효율.
주 : 포유류 게놈 (줄기 세포 ^(20)의 잠재적 인 제외) 이외의 CpG 시토신 메틸화 매우 낮은 양을 포함하지만, 식물 게놈 상당량 함유한다. 이러한 referenc에 중아 변환 효율을 결정하기 위해,즉 게놈은 적합한 경로 ²¹ 게놈과 전술 한 바와 같이 변환 효율을 산출하는 식물에 존재하는 미토콘드리아 게놈 또는 엽록체 게놈 또는 유전자의 메틸화 공지 부를 시퀀스이다. 아황산 수소 전환 효율은 변환되지 않은 C의 잠재적 비의 CpG 메틸화에서 발생하여, 대부분의 경우 ≥98 %이어야한다.

결과

BSAS 제대로도 5를 닮은 것 변환 된 레퍼런스 시퀀스에 정렬 읽는다. CpG 디 뉴클레오티드는 명확히 식별 할 수 있고, 메틸화 상태는 읽기에 매핑 된 CpG 부위에서베이스 호출을 관찰함으로써 추정 될 수있다. 예를 들어, 메틸화 컨트롤, 0 %는 모든 메틸화가 T의 (도 5a)를 함유 된 CpG 부위에 매핑 판독 될 것이다. 100 % 메틸화 컨트롤 매핑 읽기 모두가 C의 (그림 5B)를 포함 된 CpG 사이트에 대한 읽기가 발생합니다.

된 CpG 부위에서 주파수 시토신 (C / C + T)의 정량은 원래 샘플 메틸화 주파수를 산출한다. 전체 게놈의 메틸화 컨트롤 (N = 3 / 메틸화 비율)에서 발생하는 대표적인 표준 곡선은 각 메틸화 비율 (그림 6)에서 정량의 메틸화 정량의 선형성뿐만 아니라 정밀도를 보여줍니다. 총이 방법의 예로서, RNA 및 DNA는 공동 ISO이었다 마우스 소뇌와 망막 (N = 4 / 그룹)에서 lated. 선택적 망막 조직에서 발현 로돕신 발현, qPCR을 사용하여 측정 하였다. 표현은 망막 (그림 7A)에서 검출되었다. BSAS를 사용하여, 메틸화 된 CpG 수준은 로돕신의 프로모터 영역에서 정량화 하였다. 프로모터 영역에 걸쳐 누적 메틸화 수준은 망막 (p <0.001, 파라 메트릭 테스트 t) (도 7B)에서 <15 %에 비해 소뇌에서> 80 %이었다. 부위 특이 적 메틸화 정량로부터 BSAS 메틸화 정량 이점 및 메틸화 수준은 특정 지역 전체 게놈의 CpG 관련 기초 비교 될 수있다. 망막 샘플 (p <0.001, 각 사이트에서의 CpG 파라 메트릭 테스트 t) (도 7C)에 비해 로돕신 프로모터 걸쳐 메틸화 된 CpG 소뇌 수준은 샘플에서 유의하게 높았다.

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그림 1 :. BSAS 방법의 도식이 방법에서는 게놈 DNA는 유라에 unmethylation의 사이토를 수정할 변환 중아입니다. 그 후, PCR 동안 이러한 유라는 thymines로 변경됩니다. PCR 증폭은 관심 영역에 대해 유도 및 높은 단지 이러한 시퀀스 풍부하게된다. 얻어진 PCR 증폭 산물은 간단한 공정을 통해 tagmentation 듀얼 인덱싱 라이브러리로 이루어진다. 그 후 라이브러리는 벤치 탑 차세대 시퀀서에 순서가되고, 순서는 시토신의는베이스 고유의 방식으로 결정된다 실리에서 변환 된 기준 서열과 퍼센트 메틸화에 매핑되는 읽습니다.

그림 2 :. 관심 지역의 실리 중아 변환의 모든 게놈 기준에서 관심의 모든 영역이 SELEC 될 수 있습니다실리코 중아 변환에 대한 테드. 비의 CpG 사이토는 티민의 기준 순서로 대체됩니다. 의 CpG 사이토는 중아에서 사이토가 참조를 변환 남아있다.

그림 3 :. 프라이머 배치 바이 설 파이트 PCR 프라이머가 실리 중아에 대해 설계는 레퍼런스 시퀀스로 변환. 뇌관은 CG 디 뉴클레오티드를 중첩하지 않도록 설계되거나 CG 디 뉴클레오티드에 인접 설계되어야한다.

그림 4 : 높은과 낮은 품질의 PCR 증폭 산물과 염기 서열 라이브러리의 예 대표 electropherogram 추적 및 젤 쇼 (A) 하나 고와 transposome 매개 라이브러리 생성을위한 최적의 증폭.농도 제품입니다.이 증폭 물에서 생성 (B) 라이브러리 (C) 품질이 낮은 PCR 증폭 산물의 크기, 농도가 낮을 수있다. 고농도 심지어 크기 분포를 보여 주며, 여러 제품 및 / 또는 프라이머 이량 체를 포함한다. 이러한 낮은 품질의 증폭 산물은 (D)으로 이어질 낮은 농도와 낮은 크기 분포와 라이브러리 생성을 실패합니다.

그림 5 : 메틸화 컨트롤에서 시퀀싱 출력의 예. 인 실리코 (A)가 된 CpG 사이트와 참조 순서가 빨간색으로 강조 변환. 매핑 0 % 메틸화 컨트롤의 CpG 사이트에서 선택한 영역 표시 thymines (탐욕 강조 표시) 매핑을 읽습니다. 매핑 (B) 100 % 메틸화 컨트롤의 CpG 사이트에서 시토신의 (파란색 강조 표시) 매핑을 보여 읽습니다.

도 6 :. 메틸화 컨트롤 범위에서 메틸화 정량 0 %에서 100 %까지 메틸화 비율 (N = 3 / 비)로 혼합 전체 게놈 메틸화 BSAS 컨트롤을 사용하여 정량 하였다. 정량화 대 예상의 정량을 플로팅 메틸화 제어 정량의 선형성을 보여줍니다. 모든 컨트롤에 걸쳐, 메틸화 정량의 높은 정밀도가 있었다.

도 7 : 조직 샘플로부터의 페어링 된 DNA 메틸화와 유전자 발현 분석의 예. (A) 마우스 소뇌와 망막 조직에서 로돕신 상대 mRNA 발현. (B) 소뇌 및 망막 DNA (*** p <0.001, 파라 메트릭 t-test를) 사이에 BSAS에 의해 정량화 로돕신 평균 프로모터 메틸화. <마우스 소뇌와 망막 DNA의 전사 시작 사이트 [TSS])를 기준으로 로돕신 프로모터 (+6 -244에 걸쳐 강한> C)의 CpG 사이트 별 메틸화 수준.

토론

BSAS 샘플 및 대상의 수 두 수의 높은 처리량 기능에 초점을 맞춘, 정확한 DNA 메틸화 정량 수 있습니다. 또한, transposome 매개 tagmentation을 사용하여이 라이브러리 세대는 빠르고, 적은 입력 DNA입니다 필요로하며, 기존의 전단 및 후속 어댑터 결찰 기술보다 더 적은 단계가 포함되어 있습니다. 기존의 방법에 비해 이러한 개선은 관심의 대상의 정확한 기본 수준 DNA 메틸화 분석 할 수 있습니다. 또한, BSAS는 전체 게놈 중아 ⁽²²⁾ 또는 캡처 ⁽²³⁾ 접근 방식을 사용하여 식별 된 관심의 영역 (차별적 메틸화 지역 (DMRS)의 CpG 섬, 규제 지역)의 확인을위한 새로운 방법을 제공한다. 직교 확인 방법 등을 정량적으로 정확한 방법을 사용하여 에피 지노믹스 연구의 치밀한 분석을 향상시킨다. BSAS 달성 높은 읽기 깊이는 다시 좁은 신뢰 구간의 정확한 정량이 가능정확한 정량 ¹⁶ sulting. 또한, 하나의 실험에서 많은 샘플을 실행할 수있는 능력은 통계적 전력을 증가 전체 게놈의 확정 방법에 대한 샘플 크기를 증가시킬 수있다; 많은 현재의 후생 유전 학적 연구의 약점. 중요한 것은, BSAS은 후생 유전 학적 연구에 대한 검증 가능한 가설의 생성을 허용베이스 고유의 CpG 메틸화 정량을 제공합니다. 이러한 특정 응답 요소의 증가 메틸화와 같은 가설이 감소 특정 전사 인자의 결합을 발생합니다. 한 쌍의 mRNA 발현 데이터와 결합 BSAS은 조직 또는 세포 집단의 단일 조각 내에 후생 유전 학적 규제 mRNA 발현 양을 얻기위한 방법을 제공한다. 규제와 표현의 짝 측정은 또한 과학적인 엄격함과 결과의 영향을 증가시킨다.

BSAS 프로토콜 내에서 중요한 단계는 프라이머 디자인, 앰플 리콘 최적화 및 라이브러리 생성 / 포함QC. 프라이머가 적절하게 설계 효율이 다른 ^8로 증폭하지 않으면 PCR 바이어스가 도입된다. 이러한 효소 적으로 생성 된 100 % 및 0 % 시토신 메틸화 표준 같은 메틸화 표준의 사용은 어떤 경우 메틸화 정량 바이어스, 정도를 결정하는데 사용하고, 메틸화 ^(16)을 정량 할 때 적절한 방법론 제어하다 할 수있다. 단일 고품질의 증폭 물을 생성하기위한 PCR 반응을 최적화 할 때 마찬가지로주의를 기울여야한다. 앰플 리콘은 어떠한 프로토콜에서 상세히 제시된 지침을 이용하여 존재하지 않는 경우, 최적화 단계가 증가하는 PCR 사이클 번호 또는 bsDNA 입력량을 포함한다. 프라이머 이량 체 등 다양한 PCR 제품들이 존재하는 경우, 최적화 단계는, bsDNA 입력량 감소 PCR 프라이머 몰 입력 농도 저하, 소둔 온도의 증가, 또는 PCR 싸이클 횟수 감소 등. 이러한 최적화 절차 중 하나 또는 조합이 단일 HIG를 생성하기에 충분한 결과를 얻을H-품질 증폭 물. 또한, 프라이머를 재 설계하는 것은 하나의 증폭을 생성하지 않는 프라이머 세트를위한 좋은 방법입니다. 재 설계에 적합 또는 수 없습니다 그 지역의 경우 두 역 프라이머에서의 CpG 사이트에서의 CpG 앞으로 프라이머의 사이트와 아데닌의 구아닌의에서 시토신의 티민의이 작동을 포함 프라이머 세트를 퇴화. 그러나, 이들 프라이머 세트는 바이어스가 발생하는 어떠한 PCR,이 프로토콜의 범위를 벗어난 프로세스 없도록 위해 추가 최적화를 필요로한다. 품질 라이브러리는 성공을 위해 매우 중요합니다. 품질 관리 조치를 시퀀싱하기 전에 라이브러리의 크기, 질과 양을 결정하기 위해 수행되어 있는지 확인합니다. 시퀀싱 반응은 저품질 라이브러리의 입력에 실패하는 경향이있다. 메틸화 정량의 바이어스는 메틸화 주파수가 앞으로 모두에 존재하고 시퀀싱 읽기 역하도록함으로써 완화 될 수있다. 또한,의 CpG 사이트에 정렬 기지의 품질 평가 점수가 높은 협력을위한 ≥Q30해야정량에 nfidence. 다른 사람은 위에 설명 된 기준을 보장 중아 변환 된 DNA ^(19)의 tagmentation 반응에서 어떤 편견 이전에 작은 표시하고 있지만 낮은 바이어스 메틸화 정량의 확인을 할 수 있습니다.

BSAS 현재 그러나,이 방법의 미래 확장은 바이 설 파이트 변환 ²⁴ 전에 칼륨 퍼 루테 네이트를 도입으로하는 5- MC 및 5- HMC 구별 실험 단계에 첨가 된 CpG -5- HMC의 페어링 측정을 허용 소비재 부위에서 메틸화를 측정한다. 이것은 DNA 메틸화 유전자 발현 조절의 역할을 결정하기 위해, 한 쌍의 메틸화시킴으로써 5-MC 및 5- HMC 및 발현 데이터를 모두 BSAS 유틸리티의 영향을 증가시킬 것이다. PCR 증폭 산물의 Transposome 매개 라이브러리 제조 증폭 영역의 단부에서 감소 된 깊이 순서화 될 않는다. 따라서, 높은 관심의 영역이 증폭 산물의 중간에 위치하도록 설계되어야한다. 방법BSAS가 생성하기 때문에 지금까지, 시퀀싱> 1000 X, 증폭 된 영역의 끝 근처 측정이 여전히 높은 5-MC의 양적 정도의 깊이를 읽어보십시오.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Agilent 2100 Bioanlyzer	Agilent	G29393AA
Agilent RNA 6000 Nano kit	Agilent	5067-1511
Agilent High Sensitivity DNA kit	Agilent	5067-4626
Typhoon 9200	Amersham/GE Healthcare Life Sciences
Agencourt AMPure XP - PCR Purification	Beckman Coulter	A63880	5 ml
PowerPac 기본 전원 공급 장치	Bio Rad	164-5050
twin.tech PCR 플레이트 96	Eppendorf	951020362	세미 스커트
히트씰링 필름	Eppendorf	0030127838
Heatsealing Foil	Eppendorf	0030127854
Heat Sealer	Eppendorf	5390000.024
0.1-10 μ l 팁	Eppendorf	0030073.002
2-200 μ l 팁	Eppendorf	0030073.045
50-1,000 μ l 팁	Eppendorf	0030073.100
MixMate	Eppendorf	5353000.014
1.5 ml 마이크로 원심분리기 튜브	Eppendorf	0030121.023
Centrifuge 5424	Eppendorf	5424000.010
2.0 ml 마이크로 원심분리기 튜브	Eppendorf	022363352
Nextera XT DNA 시료 전처리 키트	Illumina	FC-131-1024	24 rxn
Nextera XT 인덱스 키트	Illumina	FC-131-1001	24 인덱스
MiSeq 데스크탑 시퀀서	Illumina
MiSeq 시약 키트 v2	Illumina	MS-102-2002	300 사이클
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Novex 고밀도 TBE 시료 버퍼	Life Technologies	LC6678	5x (10 ml)
1 Kb Plus DNA Ladder	Life Technologies	10787-018
Xcell SureLock Mini-Cell	Life Technologies	EI0001
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