이미징 로컬 CA ^{2 +} 배양 된 포유 동물 세포에서 신호

칼슘 이온 ^(칼슘)는 도처 유전자 발현, 분비 및 시냅스 가소성 ¹ 오래 지속 변경 사항을 포함 생물학적 과정의 다양한 범위를 조절한다. ^칼슘은 다양한 방식으로 행동 할 수있는 방법 중 하나는 ^칼슘의 다른 공간과 시간 패턴을 통해 세포가 생성 할 수있는 신호를 보낸다. 세포질에서 예를 글로벌 고도 부드러운 근육 ^조직이 작은 반면에 ^[칼슘] 트리거 수축, 지역화 된 과도 고도 (현지 ^칼슘 마이크로 도메인)은 학습과 기억 ^(3)에 필수적인 유전자 발현을 자극한다.

무료 세포질은 [칼슘 ^{2 +]} ~ 100 nm의 휴식에 유지되지만 빠르게 칼슘 통해 세포질로 ^칼슘의 유입 다음과 같은 몇 가지 마이크로 몰로 세포막에 의해 위치 ²⁺ -permeable 이온 채널을 상승 할 수있다 세포 내에서의 ^칼슘의 해방tores. 우리 연구소는 소포체 (ER) 막에있는 ^칼슘 릴리스 채널을 형성하는 이노시톨 1,4,5-trisphosphate 수용체 (IP ₃ R)에 초점을 맞추고있다. 수용체의 사이트를 활성화 세포질에 모두 IP _(3)과 ^칼슘의 결합하면, IP ₍₃₎ R 채널은 ^칼슘이 ER 루멘 내에서 압수 해방 열립니다. ^{칼슘 이온의} 방출이 공간적으로 (칼슘 ^{2 +} 퍼프 ⁴⁾ 칼슘 ^2의 로컬 세포질 마이크로 도메인을 생성하는 IP ₃ 루피의 작은 클러스터로 제한 상태로 유지하거나, IP ₃ 루피의 이웃 클러스터의 근접 정도에 따라 할 수있다 ^칼슘 유도 된 ^칼슘 -release (CICR) ^5,6의 과정을 통해 여러 퍼프 사이트를 모집하여 세포 전체에 전파.

고급 현미경 imagi과 함께 첸 ⁷ 로저에 의해 개발 된 형광 작은 분자 ^칼슘 지표 염료의 도입,기술을 ng를, ^칼슘 신호에 대한 우리의 이해를 촉진 크게있다. 현미경에 사용되는 카메라의 최근 진보는 지금과 같은 전례없는 공간과 시간 해상도 퍼프로 과도 지역 ^칼슘 이벤트를 이미징 할 수 있습니다. 현재 EMCCD 카메라> 500 프레임 초 ^-1 (FPS) 및 상보 형 금속 산화 반도체의 새로운 세대에서 128 X 128 픽셀 이미징 할 (CMOS) 카메라가 약간 높게의 비용보다 높은 화소 해상도 및 더 빠른 속도를 제공 할 소음 수준. 총 내부 반사 (TIRF) 현미경과 함께 그것은 이미지에 이제 하나의 ^칼슘 채널 이벤트 ^8,9 가능하다. 실무적 수동 처리, 시각적 식별 및 분석 렌더링 자동화 알고리즘 개발에 부담을 배치 대용량 데이터 세트 (분당을 약 1 기가 바이트)를 생성하는 동안이 방법은, 동시에 채널 / 이벤트 수백 이미징을 허용한다.

2 + 지표를 사용하여 그대로 포유류 세포에서 지방의 ^칼슘 신호를 영상화하기위한 절차 및 프로토콜을 제시한다. 우리는 더 TIRF 기존 넓은 필드 에피 형광 (WF) 현미경 모두 몇 군데 지역 ^칼슘 이벤트의 식별 및 분석을 자동화 오픈 소스 환경 파이썬으로 개발 한 알고리즘을 보여줍니다. 우리는 IP ^칼슘 신호를 -generated _3의 맥락에서 이러한 방법을 설명하지만, 그들은 [칼슘 ^{2 +]} 칼슘의 다양한 중 표면에있는 ^{2 +} -permeable 이온 채널을 발산 세포질에서 로컬 변경 사항을 연구하기 쉽게 의무가 있습니다 막 또는 세포 내 소기관 ^8-10.

우리는 인간의 신경 아세포종 SH-SY5Y 세포에서 지방 ^칼슘 이벤트를 이미징에 대한 자세한 절차를 제시한다. 이러한 절차는 많은 세포 유형에서 ^8-10 화상 내 Ca ^{2 +} 신호들에 적용될 수있다.

세포의 1. 준비

1. 문화 세포들은 공급 업체의 웹 사이트에 나와있는 지침에 따라 이미지를 만들 수 있습니다.
2. 촬상 전에 며칠 수확 한 세포는 ㎖의 0.25 % 트립신 / EDTA (2-3 분)를 이용하여 조직 배양 플라스크에서 성장. 박리 후, 트립신을 불 활성화 배양액의 동일 부피를 추가한다.
3. 접시 당 3-7 X ¹⁰⁴ 세포의 밀도로 유리 바닥 촬상 요리에 시드 및 혈구 세포를 이용하여 세포 수를 수행. 이미징 실험 셀을 선택 그들은 60 %의 합류 (2-3 일)에 도달하면.

솔루션 및 시약 2. 준비

1. 버퍼링 ^칼슘 함유 HEPES 준비(MM)로 이루어지는 염 용액 ^(칼슘 -HBSS) : 135의 NaCl, _CaCl2를, 하나의 MgCl _2, 10 HEPES, 10 글루코스 5.4의 KCl, 2; pH가 7.4 NaOH로 실온 (RT)에서. 4 ° C에서 포도당과 상점의 추가없이 ^칼슘 -HBSS를 준비; 사용하기 직전에이 용액에 포도당을 추가합니다.
2. 형광 ^칼슘 지표 칼-520 (1 ㎜)의 막 투과 형태의 가용화, CI-IP ₍₃₎ (200 μM) 및 EGTA 20 % 플루로 닉 F-127을 함유하는 디메틸 술폭 시드 (100 mM)을 (DMSO). -20 ℃에서, 수분 및 차광 에펜 도르프 튜브 및 저장소로 나누어지는 이러한 시약.

3.로드 세포 막 - 투과, 칼-520 CI-IP ₃ EGTA

1. ^칼슘 -HBSS에서 각각 5 μM 및 1 μM의 최종 농도로 투과 막 (520) 및 캘-CI-IP _(3)의 원액을 희석함으로써 "로딩 완충액"을 준비한다.
2. 기음 CUlture 매체와는 ^칼슘 -HBSS 3 회 미디어를 대체하여 세포를 씻어.
3. ^칼슘을 제거 -HBSS과 어둠 속에서 실온에서 60 분 동안 로딩 버퍼에 세포를 배양한다.
4. 로딩 버퍼를 제거하고 ^칼슘 -HBSS 3 회 미디어를 대체하여 세포를 씻어.
   1. 원하는 경우,이 단계에서, 다음로드 ^칼슘 -HBSS 5 μM의 최종 농도 원액을 희석함으로써 EGTA / AM과 함께 세포 어두울 RT에서 30-60 분 동안 세포를 배양한다. 이 배양 한 다음, 3.5 단계로 진행하기 전에 세포에게 ^칼슘 -HBSS로 3 회 씻어.
5. 로드 시약의 탈 에스테르 화를 허용하는 30 분 동안 ^칼슘 -HBSS 세포를 부화.
6. 촬영 직전, 최종 배양 중에 화장실에 유출했을 수있는 염료를 제거하기 위해 ^{"신선한"칼슘} -HBSS와 ^칼슘 -HBSS를 교체합니다.

4. ^칼슘

1. 100X APO TIRF의 목적 상 침수 오일의 작은 방울 (NA 1.49)를 놓습니다.
2. 거꾸로 현미경의 무대에 영상 접시를 탑재하고 투과광을 사용하여 초점 세포를 가지고. 이것은 촬영 중에 이동을 막도록 접시 촬상을 확보하는 것이 중요하다.
3. 고속 EMCCD 카메라를 사용하여 형광 방출 (λ> 내지 510nm)을 캘-520를 자극하고 수집하기 위하여 488 nm의 레이저로 세포를 밝히는.
   주 : 현미경을 운영 소프트웨어 패키지는 사용자가 레이저 빔이 어느 ( "WF"음원 정보)보다 중앙 또는 (TIRF 여기 용) 대물 위로 개구의 극단 에지에 도입 될 수 있도록 집속 렌즈를 번역 할 수있다.
4. EMCCD 소프트웨어를 사용하여, ^칼슘 로컬 이벤트를 캡처하는 데 필요한 시간 해상도로 데이터를 수집하기 위해서 전체 512 X 512 화소로부터 촬상 필드를 감소시킨다.
   참고 : 예를 들어, 중앙 쿼드256 X 256 픽셀의 인수는 66 FPS로 수집 속도를 속도가 빨라집니다. 더 나아가 격리 자르기 모드 기능을 사용하여 500 FPS로 EMCCD 카메라의 프레임 레이트를 증가하는 것도 가능하다.
5. 자동, 기본 활동의 몇 초를 기록 세포에 자외선 플래시를 제공하고 다른 10 ~ 30 초 동안 계속해서 기록하도록 소프트웨어를 구성 할 수 있습니다.
   주 : UV 플래시 현미경의 후면 포트에 다이크로 익 미러를 통해 반사 UV 도입 크세논 아크 광원을 사용하여 전달된다. UV 플래시의 지속 시간과 강도는 지역 칼슘 ^{2 +} 이벤트의 원하는 주파수를 연상 경험적으로 조정됩니다.
6. 이미지가 오프라인 분석을 위해 스택으로 파일을 저장합니다.

5. 자동 ^칼슘 이미지 분석

참고 :보고, 프로세스, 많은 상용 소프트웨어 패키지를 사용하여 캡처 된 데이터를 분석 할 수 있습니다. 그러나 빠르게 식별을 자동화하는 알고리즘을 개발했다지역의 ^칼슘 신호의 D 분석. 이 알고리즘에 사용되는 시공간 필터의 상세한 설명은, ΔF / F ₀ 및 식별 / 분석 루틴의 발생 ^11에서 찾을 수있다. 이 알고리즘은 오픈 소스 소프트웨어 플랫폼 파이썬에서 실행하기 위해 개발되었으며 의해 함께 샘플 실험 데이터 및 상세한 사용자 명령과 함께 획득 될 수있는 전자 메일로 해당 저자 (ismith@uci.edu).

1. 파일을 변환하는 다중 평면 .TIFF 파일 형식으로 사용자가 작성한 알고리즘로 가져올 수 있습니다.
2. 분석 알고리즘이 들어있는 폴더를 찾아 두 번 다음 Run.exe을 클릭합니다.
3. .TIFF 파일을 선택 분석합니다.
4. 열기 대화 상자에서 분석 매개 변수를 선택합니다. 샘플 데이터에 대한 기본 매개 변수에 대한 그림 2A를 참조하십시오.
5. 흑색 레벨을 결정하는 것은 하나는 N을 수행 시야 부분에 커서를 이동하여 화상 스택 엇갈리게구약 셀을 포함한다 (그림 2B 참조) 또는 수동 '으로 설정 블랙 레벨'프롬프트를 사용하여 블랙 레벨을 입력하여.
6. 소프트웨어 (그림 2C-F)에 의한 분석 다음 화면에 네 개의 창을 준수하십시오. C는 세포에서 형광을 휴식의 흑백 이미지 분석되고있다. 이 영상에 흰색 사각형 이벤트에 장착 두 차원 가우시안 함수의 중심 위치로 결정 이벤트 위치입니다.
7. 각 이벤트 위치를 클릭하거나 이벤트 사이의주기에 커서 키를 누르십시오. 이렇게하면 배경 감산, 가우스 윈도우 D. 이러한 사이트 업데이트에 각각 형광 비율 변경 (ΔF / F ₀₎ 부드럽게
   참고 : 레드 이벤트가 인접 사이트 현지화 활동에서 '블리드를 통해'에서 특정 사이트에서 발생하지 결정된다 강조했다. 선택된 부위에서 형광 신호가 검출 초과 여기서 청색 하부 트레이스 나타낸다검은 선이 특정 사이트에서 발생하는 이벤트를 식별하는 반면, 임계 값 (적색에 해당하는 이벤트를 강조).
8. 빨간색을 클릭 이벤트의 시간적 진화를 표시 창 E와 함께 장착 가우스 함수의 공간 프로필과 이벤트의 공간 프로파일이 시간 과정을 통해 평균 표시 창 F를 업데이트 이벤트를 강조했다.
9. 수동 유물 분석을 거부 할 수 있도록 확인 된 이벤트를 검토합니다. 오른쪽 빨간색을 클릭하여 이러한 이벤트를 삭제 이벤트를 강조했다.
   참고 : 우리의 손에, CA는 하나의 IP ₍₃₎ R 채널을 통해 ^{2 +} 플럭스는 ΔF / F _{0 내지} 약 0.11로 신호를 불러 일으키는, 그래서 이것보다 상당히 작은 감지 된 '이벤트'는 오탐 (false positive)이 될 가능성이 높다.
10. 저장 CellR을 관심의 세포 주위에 그려 '을 선택하여 셀 단위로 당에 데이터 또는 수출'Excel로 저장 '을 선택하여 데이터 내보내기17 ;.
    주 : 데이터는 원본 이미지 스택과 같은 폴더에 저장됩니다.

그림 1A는 CI-IP 3로드 인간의 신경 모세포종 SH-SY5Y 세포에서 칼-520 형광 휴식의 WF 이미지를 보여줍니다. 사진 릴리스로 100 밀리 초 UV 플래시 이러한 세포의 노출은 I-IP 3 (그림 1A에 흰색 원으로 주목) 이산 사이트에서 일시적인 칼슘 2 + 퍼프를 이끌어 냈다. 이 사이트에서 측정 된 형광 추적을 서서히 방출 사이트에서 확산 칼슘 2로 훨씬 느린 하강 단계 (그림 1B 및 1C) 다음 IP 3의 R 과도 개구부로 인해 급격한 상승 위상을 보여 주었다. 레드 그림 1B에서 이벤트가 알고리즘에 의해 결정되었다 칼슘 신호가 선택한 사이트에서 유래 한 것으로 아르 강조했다. 비 강조 이벤트는 칼슘에게 가깝게 인접 사이트에서 확산 2+ 신호를 오염 나타냅니다.

로컬 CA의 고해상도 영상을 달성하기 위해, 칼슘 버퍼 EGTA로드 할 수있다. 이 칼슘을 퍼프 사이트간에 확산 2+ 이온을 킬레이트 따라서 IP 3 루피의 개별 클러스터에 의해 생성 된 지역 칼슘 퍼프의 연구를 당황하게 할 글로벌 칼슘 파도의 생성을 방지 할 수 있습니다. 또한, EGTA는 로컬 칼슘 마이크로 도메인의 붕괴를 촉진하지만, 느린 결합 반응 속도 때문에, 최소한 지역 무료 칼슘을 교란 2+과는 클러스터 내에서 빠른 칼슘 2 + 표시에 결합. EGTA의 순 효과는 상당히 자신의 진폭을 감소하지 않고, 시간과 공간에 퍼프의 형광 기록을 '선명하게'하는 것입니다. 해상도가 더 개선 TIRF에 의해 생성 된 좁은 (<100 nm의) 소멸 파 칼-520 형광 물질의 여기를 제한하는 TIRF를 사용하여 발생한다. 이러한 접근 방식의 양쪽의 합계는 순시 효과적으로 칼슘을 모니터링 기술이다 2+ (칼슘 전류) 오히려이 IP 3 루피를 통해 발표 천천히 방출 사이트에서 멀리 확산과 9 압수 궁극적으로한다. 그림 1D는 TIRF '발자국'의 표시 후 칼슘의 새는 통합 2+보다 칼-520 형광이 커버 글라스 / 수용액 인터페이스에서 셀에 좁은 거리 내에서만 흥분했다 SH-SY5Y 세포. EGTA와 함께, TIRF 조명에 의해 생성 된 attoliter의 세포질 볼륨 내에서 빠른 표시 칼-520 염료 2 + 칼슘의 결합 빠른에 '청소'까지 칼슘 확산, 시간과 공간 모두에서 날카롭게 수익률 형광 신호 ( 그림 1E 및 1 층).

이러한 방식으로 촬영 된 이미지 스택의 분석은 크게 오픈 소스 소프트웨어 플랫폼 파이썬 (11)에 대한 우리의 실험실 실행에서 개발 된 사용자가 만든 알고리즘을 통해 촉진된다.도 2a는 사용자 식별 및 화상 스택의 후속 분석을 위해 사용되는 파라미터를 입력하는 개구 다이얼로그 윈도우를 나타낸다. 이 후, 사용자가 전체 이미지 스택 뺄 블랙 레벨을 선택하도록 프롬프트 된 후에 식별 및 분석 알고리즘을 실행도 2C-F 쇼 각각 로컬 칼슘 방출의 세포 내 위치.; 선택 사이트에서 활동; 확장 된 척도에 대한 개별 이벤트; 대표 이벤트 공간 프로파일 (자세한 내용은 그림 2 전설을 참조). 확인 된 사이트의 사용자 검토하면, 모든 이벤트 (표 1 참조) '저장 Excel로'기능을 선택하여 내보낼 수 있습니다에 대한 데이터를 분석했다.

TIRF 촬상에 의해 달성 해상도의 향상을 모두 나타내는도 3 선물 데이터 언로드 세포 WF 촬상에 비해 세포 EGTA는로드, 및 p식별 및 지방 칼슘 신호를 분석하는 알고리즘의 타워도 한방. 그림 3a는 칼-520과 CI-IP 3 만로드 셀에 WF에 의해 촬영 대표적인 로컬 이벤트를 보여줍니다. 비교를 위해,도 3b는 유사한 이벤트를 보여줍니다하지만 지금은 더 EGTA로드 셀에 TIRF 현미경으로 몇 군데. 그림 3C 및 3D 겹쳐 흔적. 시간 (C)과 공간 (D) EGTA (검정)없이 EGTA로드 (빨간색)와 TIRF 현미경으로 WF 형광에 의해 기록 된 이벤트의 프로필을 해당 설명 3E 플롯 퍼프 진폭 측정을 의미하는 그림 이러한 두 가지 조건 하에서 감쇠 시간 및 공간의 폭은 약 44 (WF) 및 88 (TIRF) 이벤트를 분석하는 알고리즘을 사용하여 결정 하였다.

그림 1 : IP 칼-520과 CI-IP 3 넓은 필드에 의해 촬영 (C를 통해)와 TIRF (F를 통해 D) 현미경. (A)의 흑백 이미지로드 SH-SY5Y 세포에서 로컬 CA에게 2+ 신호를 -evoked 퍼프 사이트 위치가 흰색 동그라미로 표시되는 칼-520 형광 쉬고; 스케일 바 = ~ 10㎛. (B) 흔적 퍼프 (A)에서와 같이 번호가 세 개의 다른 부위에서 유발 된 예시한다. 레드 이벤트가 특정 사이트에서 유래 한 것으로 확인 된 퍼프 있습니다 강조했다. 화살표 UV 플래시의 시간을 나타냅니다. (C) 확장 된 규모로 정렬하고 그림에서와 (B)와 같은 대표적인 칼슘 퍼프 겹쳐 흔적. (D) SH에 칼-520 형광 휴식의 흑백 TIRF '발자국'이미지 CI-IP 3 EGTA로드 -SY5Y 세포. 흰색 원이 퍼프 사이트 기원을 나타낸다. (E) (F) 확장 된 규모로 정렬하고 그림에 그 (E) 같은 대표적인 칼슘 퍼프 겹쳐 흔적에서 유발.

그림 2 : 자동 TIRF 현미경으로 몇 군데 SH-SY5Y 세포에서 지방의 칼슘 신호를 파악하고 분석하기위한 사용자 정의 코드의 사용자 인터페이스 (A) 식별 및 분석 매개 변수 입력 대화 상자 열기 (B) 사용자가 선택합니다.. . 화상 스택의 모든 프레임으로부터 감산되어 블랙 레벨을 정의 할 수없는 세포를 포함하지 않는 화상의 영역 (C - F). 최종 / 식별 분석 윈도우의 스크린 샷 (C) 쉬고 이미지 칼 -5- 칼슘 과도 (흰색 사각형) 확인 된 경우에 20 형광 위치를 겹쳐있다. 사용자 수있는 이미지 위에 마우스를 이동하거나 커서 키를 눌러 사이트 간의주기. (D) 창 보여주는 형광 비율 (ΔF / F 0) 선택한 이벤트에서 추적. 빨간색으로 강조 이벤트는 선택한 사이트에서 제기 한 것으로 확인된다. 낮은 파란색 막대는 해당 사이트에서 검출을위한 임계 값을 초과하는 이벤트를 나타냅니다; 빨간색 강조 표시되지 이벤트는 인접한 사이트에 지역화되었습니다. 파란색 막대를 클릭하면 해당 이벤트 사이트로 사용자를합니다. 마우스로 빨간색 이벤트를 클릭하면의 공간 프로필과 함께 이벤트가 (왼쪽)의 시간 과정을 통해 평균의 확장 척도 (E) 및 공간 프로파일 (F)에 이벤트의 시간적 진화를 보여주는 두 개의 추가 창을 열어 장착 가우스 (오른쪽).e.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3 : EGTA의 세포 내 부하와 함께 TIRF 현미경을 사용하여 달성 퍼프 영상의 공간적 충실도 개선에 형광 휴식의 배경 이미지에 중첩 피크 진폭의 시간에 촬영 된 퍼프의 (A) 스냅 샷 이미지. 셀 개요를 보여줍니다. 화상 EGTA로드되지 셀 WF 현미경에 의해 수득되었다. 퍼프 이미지가 점점 '따뜻한'색상으로 표시 높은 칼슘 수준, 모조한다. (B) EGTA로드 셀에 TIRF 현미경에 의해 촬영 퍼프의 이미지를 해당. (C) 추적, WF (검은 색) 또는 TIRF + EGTA (적색), 칼-520 fluorescenc에 상응하는 변화를 보여(A)에 도시 칼슘 퍼프를위한 시간 및 상기 (B)을 통해 전자. 트레이스는 동일한 피크 진폭으로 정규화 및 동력학의 비교를 용이하게하기 위해 그들의 피크 시간 정렬된다. 주석 이벤트 파라미터 칼슘 2 측정 도시 (진폭 및 하강 시간) (E)의 정량. (D) 트레이스를, WF (블랙) 또는 TIRF + EGTA (적색), 선 형광 강도가 CA (2)를 통해 스캔 보여 + (A)에 도시 퍼프 및 (B). 라인 스캔은 피크 진폭을 정상화하고, 중앙에. 주석 (E)에서 정량화, 절반의 최대 진폭 (FWHM)에서 전체 폭의 측정을 보여줍니다. 평균 피크 진폭 (상단)를 표시 (E) 막대 그래프는,에 의해 EGTA (오픈 바)없이 세포에서 WF 현미경으로 몇 군데 퍼프의 피크 진폭 (가운데), 및 공간 폭 (FWHM)의 20 %에 80 %에서 하강 시간 및 EGTA로드 세포에서 TIRF 현미경 (회색 막대). 데이터는 적어도 37 퍼프의 N과 SEM ± 평균으로 표시하고 있습니다TIRF에 대한 WF 및 79. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

표 1 : 알고리즘의 출력 데이터.

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.