여기에서는 Ca2+ 지표가 로드된 온전한 포유류 세포에서 형광 현미경을 사용하여 로컬 IP3 매개 Ca2+ 이벤트를 이미징하는 기술과 이러한 이벤트의 식별 및 분석을 자동화하는 알고리즘을 제시합니다.
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이 논문에서
요약
초록
세포질 칼슘 2 + 이온은 유전자 전사, 전기 흥분과 세포 증식으로 광범위한 프로세스를 제어, 거의 모든 종류의 세포에서 세포 활동의 다양한 측면을 조절한다. 칼슘 신호의 다양성과 특이성은 현지 과도 칼슘 마이크로 도메인 분의 기간에 걸쳐 발생하는 세포 전체의 진동과 파도에 이르기까지 칼슘 신호는 서로 다른 시간과 공간 규모 이상 행동을 생성하는 메커니즘에서 유래 (칼슘 퍼프) 지속 (밀리 초). 전자의 최근 진보는 CCD는 (EMCCD) 카메라는 지금> 500 프레임 초 -1 (FPS)의 속도로 128 X 128 픽셀의 공간 해상도를 가진 지역의 칼슘 신호의 영상을 허용 곱한. 이 접근법은 매우 평행 한 번의 실험에서 채널 또는 퍼프 사이트 수백 동시에 모니터링 할 수있다. 그러나, 데이터의 방대한 양의 생성 (약 1 기가 체육R 최소) 2 + 이벤트 불가능한 로컬 CA의 시각적 식별 및 분석을 렌더링합니다. 여기에 우리가 설명하고 수집, 탐지를위한 절차를 설명하고, 넓은 필드 에피 형광 (WF) 및 총 내부 반사를 모두 사용하여 칼슘 2 + 지표로드 그대로 포유류 세포에서 칼슘에게 2+ 신호를 매개 성 3 로컬 IP 분석 형광 (TIRF) 현미경. 또한, 우리는이 지역의 칼슘 신호의 식별 및 분석을 자동화 오픈 소스 소프트웨어 환경 파이썬에서 개발 한 알고리즘을 설명합니다. 알고리즘은 서브 픽셀 해상도의 칼슘 방출 사이트 편재; 데이터의 사용자 리뷰를 할 수 있습니다; 엑셀과 호환 표의 진폭 및 속도 데이타와 함께 형광 신호의 비율의 시간 시퀀스들을 출력한다.
서론
칼슘 이온 (칼슘)는 도처 유전자 발현, 분비 및 시냅스 가소성 1 오래 지속 변경 사항을 포함 생물학적 과정의 다양한 범위를 조절한다. 칼슘은 다양한 방식으로 행동 할 수있는 방법 중 하나는 칼슘의 다른 공간과 시간 패턴을 통해 세포가 생성 할 수있는 신호를 보낸다. 세포질에서 예를 글로벌 고도 부드러운 근육 조직이 작은 반면에 [칼슘] 트리거 수축, 지역화 된 과도 고도 (현지 칼슘 마이크로 도메인)은 학습과 기억 (3)에 필수적인 유전자 발현을 자극한다.
무료 세포질은 [칼슘 2 +] ~ 100 nm의 휴식에 유지되지만 빠르게 칼슘 통해 세포질로 칼슘의 유입 다음과 같은 몇 가지 마이크로 몰로 세포막에 의해 위치 2+ -permeable 이온 채널을 상승 할 수있다 세포 내에서의 칼슘의 해방tores. 우리 연구소는 소포체 (ER) 막에있는 칼슘 릴리스 채널을 형성하는 이노시톨 1,4,5-trisphosphate 수용체 (IP 3 R)에 초점을 맞추고있다. 수용체의 사이트를 활성화 세포질에 모두 IP (3)과 칼슘의 결합하면, IP (3) R 채널은 칼슘이 ER 루멘 내에서 압수 해방 열립니다. 칼슘 이온의 방출이 공간적으로 (칼슘 2 + 퍼프 4) 칼슘 2의 로컬 세포질 마이크로 도메인을 생성하는 IP 3 루피의 작은 클러스터로 제한 상태로 유지하거나, IP 3 루피의 이웃 클러스터의 근접 정도에 따라 할 수있다 칼슘 유도 된 칼슘 -release (CICR) 5,6의 과정을 통해 여러 퍼프 사이트를 모집하여 세포 전체에 전파.
고급 현미경 imagi과 함께 첸 7 로저에 의해 개발 된 형광 작은 분자 칼슘 지표 염료의 도입,기술을 ng를, 칼슘 신호에 대한 우리의 이해를 촉진 크게있다. 현미경에 사용되는 카메라의 최근 진보는 지금과 같은 전례없는 공간과 시간 해상도 퍼프로 과도 지역 칼슘 이벤트를 이미징 할 수 있습니다. 현재 EMCCD 카메라> 500 프레임 초 -1 (FPS) 및 상보 형 금속 산화 반도체의 새로운 세대에서 128 X 128 픽셀 이미징 할 (CMOS) 카메라가 약간 높게의 비용보다 높은 화소 해상도 및 더 빠른 속도를 제공 할 소음 수준. 총 내부 반사 (TIRF) 현미경과 함께 그것은 이미지에 이제 하나의 칼슘 채널 이벤트 8,9 가능하다. 실무적 수동 처리, 시각적 식별 및 분석 렌더링 자동화 알고리즘 개발에 부담을 배치 대용량 데이터 세트 (분당을 약 1 기가 바이트)를 생성하는 동안이 방법은, 동시에 채널 / 이벤트 수백 이미징을 허용한다.
여기, 우리가 형광 칼슘 2 + 지표를 사용하여 그대로 포유류 세포에서 지방의 칼슘 신호를 영상화하기위한 절차 및 프로토콜을 제시한다. 우리는 더 TIRF 기존 넓은 필드 에피 형광 (WF) 현미경 모두 몇 군데 지역 칼슘 이벤트의 식별 및 분석을 자동화 오픈 소스 환경 파이썬으로 개발 한 알고리즘을 보여줍니다. 우리는 IP 칼슘 신호를 -generated 3의 맥락에서 이러한 방법을 설명하지만, 그들은 [칼슘 2 +] 칼슘의 다양한 중 표면에있는 2 + -permeable 이온 채널을 발산 세포질에서 로컬 변경 사항을 연구하기 쉽게 의무가 있습니다 막 또는 세포 내 소기관 8-10.
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프로토콜
우리는 인간의 신경 아세포종 SH-SY5Y 세포에서 지방 칼슘 이벤트를 이미징에 대한 자세한 절차를 제시한다. 이러한 절차는 많은 세포 유형에서 8-10 화상 내 Ca 2 + 신호들에 적용될 수있다.
세포의 1. 준비
- 문화 세포들은 공급 업체의 웹 사이트에 나와있는 지침에 따라 이미지를 만들 수 있습니다.
- 촬상 전에 며칠 수확 한 세포는 ㎖의 0.25 % 트립신 / EDTA (2-3 분)를 이용하여 조직 배양 플라스크에서 성장. 박리 후, 트립신을 불 활성화 배양액의 동일 부피를 추가한다.
- 접시 당 3-7 X 104 세포의 밀도로 유리 바닥 촬상 요리에 시드 및 혈구 세포를 이용하여 세포 수를 수행. 이미징 실험 셀을 선택 그들은 60 %의 합류 (2-3 일)에 도달하면.
솔루션 및 시약 2. 준비
- 버퍼링 칼슘 함유 HEPES 준비(MM)로 이루어지는 염 용액 (칼슘 -HBSS) : 135의 NaCl, CaCl2를, 하나의 MgCl 2, 10 HEPES, 10 글루코스 5.4의 KCl, 2; pH가 7.4 NaOH로 실온 (RT)에서. 4 ° C에서 포도당과 상점의 추가없이 칼슘 -HBSS를 준비; 사용하기 직전에이 용액에 포도당을 추가합니다.
- 형광 칼슘 지표 칼-520 (1 ㎜)의 막 투과 형태의 가용화, CI-IP (3) (200 μM) 및 EGTA 20 % 플루로 닉 F-127을 함유하는 디메틸 술폭 시드 (100 mM)을 (DMSO). -20 ℃에서, 수분 및 차광 에펜 도르프 튜브 및 저장소로 나누어지는 이러한 시약.
3.로드 세포 막 - 투과, 칼-520 CI-IP 3 EGTA
- 칼슘 -HBSS에서 각각 5 μM 및 1 μM의 최종 농도로 투과 막 (520) 및 캘-CI-IP (3)의 원액을 희석함으로써 "로딩 완충액"을 준비한다.
- 기음 CUlture 매체와는 칼슘 -HBSS 3 회 미디어를 대체하여 세포를 씻어.
- 칼슘을 제거 -HBSS과 어둠 속에서 실온에서 60 분 동안 로딩 버퍼에 세포를 배양한다.
- 로딩 버퍼를 제거하고 칼슘 -HBSS 3 회 미디어를 대체하여 세포를 씻어.
- 원하는 경우,이 단계에서, 다음로드 칼슘 -HBSS 5 μM의 최종 농도 원액을 희석함으로써 EGTA / AM과 함께 세포 어두울 RT에서 30-60 분 동안 세포를 배양한다. 이 배양 한 다음, 3.5 단계로 진행하기 전에 세포에게 칼슘 -HBSS로 3 회 씻어.
- 로드 시약의 탈 에스테르 화를 허용하는 30 분 동안 칼슘 -HBSS 세포를 부화.
- 촬영 직전, 최종 배양 중에 화장실에 유출했을 수있는 염료를 제거하기 위해 "신선한"칼슘 -HBSS와 칼슘 -HBSS를 교체합니다.
4. 칼슘 이미지 획득
- 100X APO TIRF의 목적 상 침수 오일의 작은 방울 (NA 1.49)를 놓습니다.
- 거꾸로 현미경의 무대에 영상 접시를 탑재하고 투과광을 사용하여 초점 세포를 가지고. 이것은 촬영 중에 이동을 막도록 접시 촬상을 확보하는 것이 중요하다.
- 고속 EMCCD 카메라를 사용하여 형광 방출 (λ> 내지 510nm)을 캘-520를 자극하고 수집하기 위하여 488 nm의 레이저로 세포를 밝히는.
주 : 현미경을 운영 소프트웨어 패키지는 사용자가 레이저 빔이 어느 ( "WF"음원 정보)보다 중앙 또는 (TIRF 여기 용) 대물 위로 개구의 극단 에지에 도입 될 수 있도록 집속 렌즈를 번역 할 수있다. - EMCCD 소프트웨어를 사용하여, 칼슘 로컬 이벤트를 캡처하는 데 필요한 시간 해상도로 데이터를 수집하기 위해서 전체 512 X 512 화소로부터 촬상 필드를 감소시킨다.
참고 : 예를 들어, 중앙 쿼드256 X 256 픽셀의 인수는 66 FPS로 수집 속도를 속도가 빨라집니다. 더 나아가 격리 자르기 모드 기능을 사용하여 500 FPS로 EMCCD 카메라의 프레임 레이트를 증가하는 것도 가능하다. - 자동, 기본 활동의 몇 초를 기록 세포에 자외선 플래시를 제공하고 다른 10 ~ 30 초 동안 계속해서 기록하도록 소프트웨어를 구성 할 수 있습니다.
주 : UV 플래시 현미경의 후면 포트에 다이크로 익 미러를 통해 반사 UV 도입 크세논 아크 광원을 사용하여 전달된다. UV 플래시의 지속 시간과 강도는 지역 칼슘 2 + 이벤트의 원하는 주파수를 연상 경험적으로 조정됩니다. - 이미지가 오프라인 분석을 위해 스택으로 파일을 저장합니다.
5. 자동 칼슘 이미지 분석
참고 :보고, 프로세스, 많은 상용 소프트웨어 패키지를 사용하여 캡처 된 데이터를 분석 할 수 있습니다. 그러나 빠르게 식별을 자동화하는 알고리즘을 개발했다지역의 칼슘 신호의 D 분석. 이 알고리즘에 사용되는 시공간 필터의 상세한 설명은, ΔF / F 0 및 식별 / 분석 루틴의 발생 11에서 찾을 수있다. 이 알고리즘은 오픈 소스 소프트웨어 플랫폼 파이썬에서 실행하기 위해 개발되었으며 의해 함께 샘플 실험 데이터 및 상세한 사용자 명령과 함께 획득 될 수있는 전자 메일로 해당 저자 (ismith@uci.edu).
- 파일을 변환하는 다중 평면 .TIFF 파일 형식으로 사용자가 작성한 알고리즘로 가져올 수 있습니다.
- 분석 알고리즘이 들어있는 폴더를 찾아 두 번 다음 Run.exe을 클릭합니다.
- .TIFF 파일을 선택 분석합니다.
- 열기 대화 상자에서 분석 매개 변수를 선택합니다. 샘플 데이터에 대한 기본 매개 변수에 대한 그림 2A를 참조하십시오.
- 흑색 레벨을 결정하는 것은 하나는 N을 수행 시야 부분에 커서를 이동하여 화상 스택 엇갈리게구약 셀을 포함한다 (그림 2B 참조) 또는 수동 '으로 설정 블랙 레벨'프롬프트를 사용하여 블랙 레벨을 입력하여.
- 소프트웨어 (그림 2C-F)에 의한 분석 다음 화면에 네 개의 창을 준수하십시오. C는 세포에서 형광을 휴식의 흑백 이미지 분석되고있다. 이 영상에 흰색 사각형 이벤트에 장착 두 차원 가우시안 함수의 중심 위치로 결정 이벤트 위치입니다.
- 각 이벤트 위치를 클릭하거나 이벤트 사이의주기에 커서 키를 누르십시오. 이렇게하면 배경 감산, 가우스 윈도우 D. 이러한 사이트 업데이트에 각각 형광 비율 변경 (ΔF / F 0) 부드럽게
참고 : 레드 이벤트가 인접 사이트 현지화 활동에서 '블리드를 통해'에서 특정 사이트에서 발생하지 결정된다 강조했다. 선택된 부위에서 형광 신호가 검출 초과 여기서 청색 하부 트레이스 나타낸다검은 선이 특정 사이트에서 발생하는 이벤트를 식별하는 반면, 임계 값 (적색에 해당하는 이벤트를 강조). - 빨간색을 클릭 이벤트의 시간적 진화를 표시 창 E와 함께 장착 가우스 함수의 공간 프로필과 이벤트의 공간 프로파일이 시간 과정을 통해 평균 표시 창 F를 업데이트 이벤트를 강조했다.
- 수동 유물 분석을 거부 할 수 있도록 확인 된 이벤트를 검토합니다. 오른쪽 빨간색을 클릭하여 이러한 이벤트를 삭제 이벤트를 강조했다.
참고 : 우리의 손에, CA는 하나의 IP (3) R 채널을 통해 2 + 플럭스는 ΔF / F 0 내지 약 0.11로 신호를 불러 일으키는, 그래서 이것보다 상당히 작은 감지 된 '이벤트'는 오탐 (false positive)이 될 가능성이 높다. - 저장 CellR을 관심의 세포 주위에 그려 '을 선택하여 셀 단위로 당에 데이터 또는 수출'Excel로 저장 '을 선택하여 데이터 내보내기17 ;.
주 : 데이터는 원본 이미지 스택과 같은 폴더에 저장됩니다.
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결과
그림 1A는 CI-IP 3로드 인간의 신경 모세포종 SH-SY5Y 세포에서 칼-520 형광 휴식의 WF 이미지를 보여줍니다. 사진 릴리스로 100 밀리 초 UV 플래시 이러한 세포의 노출은 I-IP 3 (그림 1A에 흰색 원으로 주목) 이산 사이트에서 일시적인 칼슘 2 + 퍼프를 이끌어 냈다. 이 사이트에서 측정 된 형광 추적을 서서히 방출 사이트에서 확산 칼슘 2로 훨씬 느린 하강 단계 (그림 1B 및 1C) 다음 IP 3의 R 과도 개구부로 인해 급격한 상승 위상을 보여 주었다. 레드 그림 1B에서 이벤트가 알고리즘에 의해 결정되었다 칼슘 신호가 선택한 사이트에서 유래 한 것으로 아르 강조했다. 비 강조 이벤트는 칼슘에게 가깝게 인접 사이트에서 확산
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토론
우리는 여기에 설명 형광 칼슘 2 + 지표를 사용하여 배양 된 포유 동물 세포에서 지방의 칼슘 이벤트를 이미징 프로토콜. 또한, 우리는 식별 및 수집 된 데이터의 분석을 자동화하는 직관적 인 사용자 인터페이스와 알고리즘을 설명합니다. 여기에 설명 된 절차는 형광 칼슘 지표 칼-520을 이용하지만, 그러한 FLUO-3, FLUO-4, FLUO-8 및 오레곤 그린 BAPTA-1 등 다른 많은 칼슘 민감성 염료는 화상과 Ca 2+ 잘 충분히 수행 마이크로 도메인. 케어는 이러한 지표의 선호도가 높은 버전 (~ 200 ~ 400 nm 인 K의 d)는 이미지에 현지 칼슘 마이크로 도메인을 사용하도록주의를 기울여야합니다 않으며, 이러한 지표의 최적의 하중 조건은 대한 경험적으로 결정해야 조사에서 각각의 세포 유형. 그 성격 CA에서 2 + 지표 2+ 버퍼 칼슘의 ...
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공개 사항
저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.
감사의 글
이 작업은 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 보조금 GM 100201 I.F.S, GM 048071 및 GM 065830 to I.P.의 지원을 받았습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 인간 신경 모세포종 SH-SY5Y 세포 | ATCC | CRL-2266 | |
| Cal-520 / AM | AAT Bioquest Inc. | 21130 | |
| ci-IP3 (D-23-O-이소프로필리덴-6-O-(2-니트로-4,5-디메톡시)벤질-myo-Inositol 1,4,5-trisphosphate-Hexakis(propionoxymethyl) 에스테르 | SiChem | cag-iso-2-145-10 | |
| DMSO/20% pluronic F127 | Invitrogen | P-3000MP | |
| EGTA/AM | Invitrogen | E-1219 | |
| 35mm 유리 바닥 이미징 접시 | MatTek | P35G-1.5-14-C |
참고문헌
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