방법 논문

루트 신경절 신경 세포와 차별화 된 지방 유래 줄기 세포를 이룬다 :

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DOI:

10.3791/52543

⸱

2015년 2월 26일

 ,  , 
1Centre for Neuroprosthesis, EPFL | STI | IMT/IBI | LSBI, 2Blond McIndoe Research Laboratories, Institute of Inflammation & Repair, The University of Manchester, 3University Hospital of South Manchester

이 논문에서

요약

도설 신경절 (DRG)은 말초 신경계의 감각 뉴런을 포함하는 구조이다. 해리 된 때, 그들은 손상 부위에서 생체 내 환경을 모방 관내 신경 재생과 수초 형성을 연구하는 유용한 모델을 제공하고, SC 형 지방 유래 줄기 세포 (ASC)와 함께 공동 배양 될 수있다.

초록

척추의 추간공(intervertebral foramina)에 위치한

Dorsal root ganglia (DRG) 뉴런은 신경 재생 및 수초화(myelination) 연구를 용이하게 하는 체외 시스템을 만드는 데 사용할 수 있습니다. 말초 신경계의 신경교세포(glial cell)인 슈반 세포(Schwann cell, SC)는 이러한 과정의 핵심 촉진자입니다. 따라서 이러한 세포 구성 요소의 상호 작용을 함께 연구하는 것이 중요합니다. DRG 뉴런과 신경교세포 사이의 직접적인 접촉은 특정 막 수용체가 감지하는 추가 자극을 제공하여 뉴런 반응을 더욱 개선합니다. SC는 배양 배지에서 성장 인자와 단백질을 방출하여 뉴런 생존을 향상시키고 신경돌기 발아 및 확장을 자극합니다. 그러나 SC는 조직 공학 응용 분야에 사용되기까지 긴 증식 시간이 필요하며 소싱을 위해 건강한 신경을 희생해야 합니다. SC 표현형으로 분화된 지방 유래 줄기세포(ASC)는 신경 재생을 연구하기 위해 DRG 뉴런과 공동 배양 모델을 설정하기 위한 SC의 유효한 대안입니다. 현재 연구는 성체 쥐에서 DRG 뉴런과 ASC를 모두 수확하기 위한 상세하고 재현 가능한 단계별 프로토콜을 제시합니다. ASC를 SC 표현형으로 구별하기 위해; 말초 신경계에서 뉴런과 SC 사이의 상호 작용을 조사하기 위해 직접 공동 배양 시스템에서 두 세포 유형을 결합합니다. 이 도구는 말초 신경 복구를 위한 조직 엔지니어링 구조물의 최적화에 큰 잠재력을 가지고 있습니다.

서론

말초 신경 손상은 영국에서 약 9,000가지 경우는 주로 젊은 매년 발생하고 인구 1 일에 일반적이다. 미세 수술 신경 수리 기술에도 불구하고, 기능의 정상 회복이 손상 손 감각, 감소 된 운동 기능과 잦은 통증과 감기 편협 2 결과와 얻기 어려운 것입니다. 이러한 부상은 심오하고 영구적 인 환자에 미치는 영향과 60 % 미만이 3 일 반환과, 일상 생활의 활동을 수행 할 수있는 능력을 가지고있다.

부상, 표현형 및 신경 세포의 형태와 슈반 세포 축삭 발아 수있는 적합한 환경을 만들기 위해 (SC)의 변화에​​ 따라. 절단 한 경우에는 신경 근위 및 원위 덩어리들로 분할되고; 회생 절차가 말초 그루터기 동안, 발생하는 지점 인 근위 그루터기는 SC의 분리 그러자 Wallerian의 변질부상 축삭, 드 차별화 증식에서. 이것은 미엘린 파편을 제거하고 신경 재생성 4,5- 대한 원위 루터 제조 향해 기본이다. 축삭의 발아는 말초 그루터기에서 SC가 발표 한 신경 영양 요소와 케모카인의 생산에 의해 지원 및 Wallerian 변성 6,7 다음 남겨 기저판에 의해 인도된다. SC는 Büngner의 밴드를 형성하는 재생 축삭, 나란히 정렬하는 원조 endoneurial 튜브 외부 분기 감소 대상 기관으로 축삭의 성장. reinnervation 다음, SC는 재생 된 축삭 포장 새로운 수초를 형성하지만, 감각과 운동 기능을 부분적으로 만 8 복원됩니다.

배근 신경절 (DRG)는 감각 신경 세포가 주변 장기에 분포 포함하는 척추의 척추 사이 구멍에있는 구조이다. 해리 된 때, 그들은 적합한 시험 관내 개조로서 사용될 수있다수초 형성의 조사를 포함하여 11 일 - 신경 재생 (9)의 연구를위한 엘. 특히, 성인 DRG 뉴런은 이러한 세포의 생체 내 특성을 모방 및 조직 공학에서 말초 신경 수리를 위해 새로운 전략을 연구하는 강력한 도구를 제공합니다.

공동 배양은 시험관 내에서, 특히 두 개 이상의 세포 유형의 생체 내 상호 작용 환경을 시뮬레이트 동적 시스템을 나타낸다. 이들 세포 공동 배양 모델의 장점 중 하나는 세포 외 환경에 작용 될 수있는 유연성과 높은 제어이다. 14 - DRG 뉴런은 말초 신경계 (10,12)의 두 세포 형 사이에 발생하는 실제의 상호 작용을 모방하는 SC와 공동 배양 시스템에서 자주 사용되어왔다. 이는 SC는 세포 외 기질 (ECM) 단백질과 현저하게 개선 할 수 성장 인자를 분비하는 것으로 입증되었다DRG 뉴런의 능력은 생존과 신경 돌기를 15, 16 새싹합니다. 그러나, SC는 세포 배양 기술의 발전에도 불구하고, 그것을 조직 공학 어플리케이션에 적합한 세포 수를 생성하기 위해 여전히 어렵고, 증식, 긴 시간을 필요로하고. 또한, 건강한 신경의 희생자가 SC 수확 필요로한다. 따라서 소싱 SC의 차이는 두 조직 공학 및 신경 재생의 시험 관내 시험에서 중요하다. 이러한 관점에서, ASC는 말초 신경 17,18 수리에 사용되는 조직 공학적 구조의 개발을위한 유용한 대안으로 간주 될 수있다. 이전 작업은 S-100, P75 및 신경교 원 섬유 성 산성 단백질 (GFAP) (19)뿐만 아니라, 미엘린 단백질 제로 (P0)와 같은 특성 신경교 - 마커 (20)를 발현하는, SC 형 ASC로 분화하는 이러한 세포의 능력을 입증 . 뇌 유래 신경 영양 인자로서 신경교 성장 인자의 분비 (BDNF)은 신경 성장 인자 (NGF) 및 아교 세포 유래 신경 영양 인자 (GDNF)도 21, 22을 관찰 하였다. 26 - 시험관 내에서 모두에 의해 입증 및 생체 내에서 23 일 연구 따라서, SC 형 ASC는, 말초 신경 재생의 프로모터로서 사용될 수있다. 또한, ASC는 다른 줄기 세포 유형에 비해 더 많은 수의 최소 침습 절차를 수확 할 수있다; 지방 조직에서 줄기 세포의 빈도는 100- 골수 (27)보다 1000 배이며, 이들은 SC 골수 간엽 줄기 세포에 비해 더 높은 증식률을 갖는다.

이 작품은 각각 해리 DRG 뉴런과 ASC의 고효율 수확을 수행하기위한 세부 프로토콜, 후자는 SC-유사 세포로 분화되는 것을를 제공하는 것을 목표로하고있다. 이러한 두 종류의 세포 공동 배양 따라서 DRG 네브라스카의 능력에 대한 추후 연구에 사용될 수있는 매우 실용적인 시스템을 제공하는 것이다urons는 신경 돌기 신경 조직 공학에 대해 서로 다른 발판에 수초 형성의 메커니즘을 새싹합니다.

프로토콜

주 : 동물을 포함한 모든 실험 동물 UK (과학적 절차) 법 1986에 따라 수행 하였다.

1. 실험 장치

  1. 모든 도구는 멸균 확인, 조직 및 세포 수확을 시작하기 전에. 필요 여부, 날카로운 외과 가위, 아주 좋은 집게와 벌금 표준 포셉 한 쌍을 압력솥. 또한 UV 살균, 에탄올 노출 또는 적절한 증기 멸균을 사용하여 세포 파종하기 전에 각 기판을 소독.
  2. 줄기 세포 수확 및 차별화를위한 미디어의 준비
    1. 10 % 소 태아 혈청 (FBS), 200 mM의 L- 글루타민 및 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신 (PS)가 보충 된 최소 필수 중간 (MEM-α)를 포함하는, 줄기 세포 성장 배지를 준비한다.
    2. 멸균 디메틸 sulfoxyde의 2.436 ml의 포스 콜린 10mg을 용해시켜 포스 콜린의 10 mM 스톡 용액을 준비한다. 14 μM의 최종 농도로 사용합니다.
    3. 멸균 디메틸 sulfoxyde 1.43 ml의 50 mg을 용해시킴으로써 레티노 산의 35 ㎎ / ㎖의 스톡 용액을 준비한다. 350 NG / ㎖의 최종 농도로 사용합니다.
    4. 멸균 증류수 100 ㎕의 동결 건조 분말을 10 μg의 용해시켜 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF) 축적량 (100 ㎍ / ml)로 준비한다. 5 NG / ㎖의 최종 농도로 사용합니다.
    5. 멸균 증류수 500 μL의 동결 건조 분말을 50 μg의 용해시켜 염기성 섬유 아세포 성장 인자 (bFGF) 축적량 (100 ㎍ / ml)로 준비한다. 10 NG / ㎖의 최종 농도로 사용합니다.
    6. 14 μM 포르 스 콜린, 126 NG / ㎖ 아교 성장 인자 -2 (GGF-2), 5- NG / ㎖의 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF), 10 ng의 보충 줄기 세포 성장 배지 함유 줄기 세포 분화 배지를 준비 / ml의 염기성 섬유 아세포 성장 인자 (bFGF).
  3. 신경 수확 및 분리를위한 미디어 및 주식 솔루션의 준비
    1. Bottenst 준비EIN와 햄 F12 배지에 1 % 1 % PS N2 보충제를 첨가함으로써 사토 (BS) 매체 (28). (24 웰 플레이트를 사용하는 경우) 물론 당 500 μL로 필요한 최종 부피를 계산합니다.
    2. 중량 / V 1.25 %의 농도에서 햄의 F12 배지에서 콜라겐 IV 주식을 준비합니다. 200 ㎕를 분주으로 -20 ° C에서 솔루션 및 저장소를 필터 소독.
    3. , 2.5 % 중량 / V의 농도에서 햄의 F12 배지에 소 췌장 트립신 주식을 준비 200 μL 씩 -20 ° C에서 필터 소독 및 저장.
    4. 신경 성장 인자 (NGF) 200 μL -20 C에서 필터 멸균 한 MG F12 매체 저장소 / ㎖의 지방산이없는 소 혈청 알부민 (BSA) 중의 5 ㎍ / mL의 농도의 스톡 용액을 준비 분취. 재구성 후 NGF를 필터링하지 마십시오.
  4. 경우에는 표면 개질 RT에서 15 분 동안, 코팅 된 커버 / 폴리 D 라이신 플레이트 (0.1 ㎎ / ㎖을 수행되지 않았다) 및 / 또는 라미닌 (37 ° C에서 2 시간 동안 2-10 ㎍ / cm 2) 적절한 신경 세포의 부착 및 신경 돌기 가지를 지원합니다.
  5. 항상 사용하기 전에 37 ° C에서 물을 욕조에 미디어를 따뜻하게.

SC 표현형에 2 지방이 유래 줄기 세포 (ASC) 수확 및 차별화

  1. 성인 남성 흰쥐의 내장과 사타구니 지방에서 ASC 수확
    1. 시작 행크스 '균형 식염수 지방 수확 때까지 얼음에 PS 솔루션 및 저장의 1 %의 v / v를 보충 (HBSS)의 10 ~ 15 ml의 튜브를 준비하기 전에.
    2. 자궁 경부 전위와 잘린 쥐를 종료합니다. 내부 장기를 노출하고 출혈을 방지 쥐를 면도하고, 복부 피부를 통해 절개를합니다. 위와 장 (일반적으로 지방 노란색 일관성이 특징)과 성인 남성의 Sprague-Dawley 계 쥐의 고환 주위의 사타구니 지방을 감싸는 내장 지방을 제거합니다. 전송 일얼음 HBSS를 함유하는 튜브 E 지방.
    3. 생물학적 안전 캐비넷 (등급 II)에서 미세하게 도달 가위 미세한 일관성까지 멸균 면도날을 이용하여 지방을 잘게 중량 / V 콜라게나 제 I 형 용액을 새로 제조 한 0.2 %의 15 ml를 함유하는 튜브로 옮기고 하루에 필터 소독.
    4. 37 ℃에서 수욕 튜브를 전송하고 연속 교반 하에서 30 분 - 1 시간 동안 효소의 존재 하에서 소화 지방 조직을 떠난다. 밀접 소화를 모니터링하고 조직이 충분히 해리되기 전에,이 세포 생존율 및 세포 수율을 향상 멈춘다. 필터 100 μm의 셀 스트레이너를 통해 조직을 theun는 - 해리.
      참고 : 부드럽게 베이지 색 외관을 획득, 튜브를 소용돌이하면 좋은 조직 소화가 눈으로 볼 수 지방의 균일 한 일관성 발생합니다.
    5. C 및 원심 분리기 37 °에서 소 태아 혈청을 함유하는 줄기 세포 성장 배지 15 ㎖에 첨가하여 효소를 중화상기 튜브의 하단에, 줄기 세포를 포함하는 각막 혈관 분획을 수집하기 위해, 10 분 동안 160g의 용액.
    6. 이 단계에서, 펠릿 적혈구 1 ㎖에 재현 탁 될 수있는 혈액 세포 오염을 제거하는 용해 완충액. 1 분 동안 재현 탁 피펫 팅 한 후, 10 분 동안 160g로 신선한 줄기 세포 성장 배지 (10) 및 원심 분리기를 가하여.
    7. 조심스럽게 바닥에 퇴적 된 세포 펠렛을 돌보는, 튜브에서 뜨는을 대기음. 줄기 세포 성장 배지 10ml에 재현 탁 세포를 75cm로 2 플라스크로 전송하고, 37 ° C, 5 % CO 2에서 배양한다. 3 일마다 매체를 변경, 통로 1-2까지 하위 합류 수준에서 세포를 유지합니다.
  2. SC 표현형에 ASC 차별화
    1. 통로 1-2에서, 75cm 2 플라스크에서 줄기 세포 성장 배지를 제거하고 신선 처리장 1 밀리미터 β 머 캅토 에탄올을 함유하는 새로운 배지 10 mL로 교체빨간색과 당일 필터 살균. 24 시간 동안 37 ℃로, 5 % CO 2에서 세포를 배양한다. 이 단계에서, 상기 세포의 분화를 시작하기 전에 낮은 농도 (30 %)로 접종하는 것이 중요하다.
    2. 조심스럽게 HBSS, 기음과 세포를 씻으 350 NG / ㎖ 레티노 산 (retinoic acid)을 함유하는 10 ml의 배지로 교체합니다. 72 시간 동안 37 ℃로, 5 % CO 2에서 세포를 배양한다. 빛에 대한 세포 매체의 노출을 최소화하려고합니다.
    3. (단계 1.2.6 참조) 삼일 후, HBSS, 기음 조심스럽게 세포를 씻어 줄기 세포 분화 배지 10 ㎖로 교체합니다. 3 일마다 배지를 변경 부 합류 수준에서 세포를 유지한다.
      참고 : (. Kingham 등 5 입증 된 바와 같이) 배양 2 주 후, ASC가 자신의 특성 표현형을 표현, SC-같은 ASC로 분화된다. 그들은 다음 행동 (29)의 눈에 띄는 변화없이 10 유로까지 사용할 수 있습니다.

3. 수확 및 등쪽 뿌리 신경절 (DRG) 뉴런의 해리

  1. 자궁 경부 전위와 잘린 쥐를 종료합니다. 쥐를 면도하고 척추를 노출 피부를 들어 올립니다. 날카로운 가위를 사용하여 밀폐 된 장기와 혈관의 추가 돌보는 척추를 excide. 페트리 접시를 사용하여 생물 안전 캐비닛 (클래스 II)에 척추를 전송하고 지느러미 부분을 제거합니다.
  2. 코드 조직을 노출 멸균 날카로운 수술 가위를 사용하여 종축을 따라 반으로 나눈다 척주. 이 점에서, 그것은 쉽게 DRG 신경 세포가 수확 중에 처리 할 수​​ 있도록, 흉곽 레벨보다 작은 두 개의 세그먼트 척주를 절단하는 것이 도움이된다. 미세 집게를 사용하여 부드럽게 당겨 DRG 뿌리를 제거하지 않도록주의를 기울이고, 모든 코드 조직을 제거합니다. DRG 뿌리가 척추 운하 내에서 노출되는이 방법은, 여전히 열 쌌다. 흰색 필라멘트 COMI으로 DRG를 관찰운하에서 직접 밖으로 ng를.
  3. 신경의 뿌리를 손상하지 않도록주의를, 아주 좋은 집게를 사용하여 척추 운하에 깊은 가서 지불 척추 운하에서 전체 DRG 루트 (다만 DRG)를 잡아 당깁니다. 1 %의 PS 보충 햄의 F12 매체의 3-4 ml의를 포함하는 작은 페트리 접시 (60mm 2)에 DRG를 전송합니다. 다른 동물을 사용하는 경우, 별도의 요리를 사용합니다.
  4. 해부 현미경, 신경교 세​​포의 오염을 감소시키기 위해 멸균 겸자 메스를 이용하여 주변 신경절 신경 뿌리 초과의 DRG 청소. 신선한 F12 매체의 1.8 ml의 작은 페트리 접시 (35mm 2)에 DRG를 전송합니다.
  5. 1.25 % 중량 / V 콜라게나 제 4 형 원액 (0.125 %의 최종 농도)의 200 μl를 추가하고 1 시간 동안 37 ° C, 5 % CO 2의 DRG를 배양. 조심스럽게 흡인 또는 DRG를 손상하지 않도록주의하면서 유리 피펫으로 흡인 매체. 신선한 F12 매체는 유연한 추가전술 한 바와 같이 0.125 중량 % / V 콜라게나 제 IV 형 효소와 함께 그 취지에 1 시간 동안 배양한다.
  6. 매체를 대기음 부드럽게 F12 매체와 DRG을 씻는다. F12 배지 후 1.8 ml의 트립신 200 μl를 추가 (최종 농도 0.25 %의 중량은 / v)로 30 분 동안 37 ° C, 5 % CO 2에서 배양한다.
  7. 트립신을 제거하고 효소 반응을 체포 FBS 500 ㎕를 보충 F12 배지 1 ㎖를 추가합니다. 매체를 대기음 부드럽게 혈청의 흔적을 제거하기 위해 3 회 F12 매체와 DRG을 씻는다.
  8. 신선한 F12 매체의 2 ML을 추가 조심스럽게 유리 피펫을 사용하여 15 ML 튜브에 매체 DRG를 전송합니다. 부드럽게 (플라스틱 팁 대안으로 사용될 수있다) 유리 피펫으로 하 (약 8-10 시간)를 피펫 팅에 의해 DRG 뉴런 해리.
  9. 펠릿은 관의 바닥에 침전하고 새로운 튜브에 매체를 수집 할 수 있도록. 펠렛을 포함하는 튜브에 신선한 F12 배지 2 ㎖를 추가하고 m를 반복유리 피펫 echanical 해리. 서스펜션은 균일 (약 3 ~ 4 번)이 될 때까지이 단계를 반복하고 새로운 튜브의 모든 해리 DRG를 수집합니다. 이 방법은 기계적 분해로부터 유도 응력을 감소시키고, 뉴런의 생존 능력을 향상시킨다.
  10. 비 - 해리 된 뉴런 및 기타 이물질을 제거하기 위해 100 ㎛ 세포 여과기를 사용하여 15ml의 새로운 튜브에 생성 된 균질 현탁액을 필터. 이 단계에서는, 먼저 50 ㎖ 튜브에 세포 현탁액을 필터링하고 유리 피펫을 사용하여 더 작은 튜브 내로 용액을 전송하는 것이 편리 할 수​​도있다. 5 분 동안 110g의 현탁액을 원심 분리기.
  11. F12 배지 500 μL에 30 %의 BSA 용액 500 μL를 첨가하여 15 % 소 혈청 알부민 (BSA)을 준비한다. 천천히 점진적 단백질 흔적을 만들기 위해 15 ML 튜브의 벽 아래로 솔루션을 피펫. 이 단계에서, 그 번호에 대한을 사용하여 BSA을 45 ° 각도로 튜브를 잡고 천천히 풀어 유용성형 "트랙"에 대한 기준으로 팔콘 튜브.
  12. 상기 튜브의 하단에 500 μl를 떠나는 단계에서 3.10 상등액을 대기음 동일한 배지에서 세포 펠렛을 재현 탁. 천천히 이전에 5 분 동안 500g 3.11에서 단계 (참조로 튜브의 번호를 사용하여)하고 원심 분리기에서 제조 된 단백질 흔적을 따라 현탁액 피펫.
  13. 단계 4.5에서 후술하는 바와 같이, 상등액을 수정 대기음 BS 매체 (또는 SC 형 ASC / DRG 공동 배양 용 배지의 혼합 한 용액에 펠릿을 재현 탁.
    주 : DRG 뉴런을 다시 일시 중단 볼륨 시드 할 원하는 최종 세포 농도 및 샘플의 수에 따라, 필요한 실제 부피로 구성 될 수있다. 한 동물은 24 웰 플레이트 실험에 대한 충분한 세포를 제공 할 것입니다.
  14. 세포 부착을 허용하기 위해 2 시간 동안 37 ° C, 5 % CO 2에서 인큐베이션 시딩 된 샘플을 최종적 신경 성장의 50 ng를 FA / ㎖가 보충 된 신선한 배지 BS를 추가ctor에 (NGF).

SC-같은 ASC 및 DRG 뉴런의 4. 직접 공동 문화

  1. 단계 2.2.3에 설명 된대로 하위 합류 수준의 문화 SC-같은 ASC를 유지한다. DRG 수확하기 전에 스물 네 시간, 줄기 세포 분화 매체를 대기음 HBSS로 세포를 씻어. 대기음, 3 분 동안 37 ° C, 5 % CO 2에서 3 ml의 트립신으로 인큐베이션.
  2. 모든 세포는 플라스크에서 분리 한 광학 현미경 검사. 조심스럽게 분리를하는 데 도움이 플라스크를 누릅니다. , 트립신 반응을 중지 5 분 동안 110g에서 15 ML 튜브와 원심 분리기에 세포 현탁액을 수집하는 매체의 7 ML을 추가합니다.
  3. 상등액을 대기음 줄기 세포 분화 배지 5ml에 세포 펠렛을 재현 탁. 혈구를 사용하여 세포를 세어 필요한 최종 농도에 따라 세포 현탁액을 희석. 이상적으로, SC-20000 등 ASC 시드 / cm 2가 세포의 합류 층을 보장한다.
  4. SC-같은 종자및 기판상의 ASC는 세포 부착을 허용하도록 24 시간 동안 37 ° C, 5 % CO 2에서 배양한다.
  5. 24 시간 배양 후, 배지를 흡인하고, 단계 3.14 및 3.15에 기술 된 바와 같이 세포의 위에 DRG 신경 세포를 추가한다. 줄기 세포 분화 배지의 50 %와 BS 배지의 50 %를 함유하는 혼합 매체 변화 매체. 또한, 최종 혼합 배지에서 1-2.5 %의 FBS 농도를 감소시키는 것은 DRG 해리로부터 유도 위성 세포 오염의 확산을 방지 할 수 있습니다.
  6. 37 ° C, 5 % CO 2의 공 배양 샘플을 품어 미래의 시험에 필요한 시간 동안 배양 유지한다.

결과

해리 DRG 신경 세포 배양 신경 재생의 연구를위한 시험 관내 모델에 적합한를 나타낸다. 그러나, 처리되지 않은 기판은 DRG 부착 및 신경 돌기의 확장에 적합한 환경을 제공하지 않습니다. SC 형 ASC는이 배지에서 릴리스되면 신경 돌기 발아 DRG 뉴론의 기능을 향상시킬 수있는 성장 인자 및 케모카인 (19)를 제조 할 수있다. 배양 시스템에서 SC-ASC 등의 존재 따라서 DRG 기능 조절에 중요​​한 역할을 할 수있다.

이 프로토콜 (도 1) 신경 세포는 이전에 시드 SC 형 ASC와 직접 접촉되는 동안 얻을 SC 상 및 ASC DRG 뉴런의 직접적인 공존 배양을 수행하는 절차를 도시한다. 이 절차와 관련된 주요 어려움은 다른 동물에서 수확 DRG 뉴런의 수의 높은 가변성이다. 이러한 이유로, 결과는 비교 예 때로는 어려울 수 있습니다E 및 특별한주의 항상 각 실험에서 유사한 세포 밀도를 얻기 위해 시드 절차 중에 기울여야한다. 프로토콜은 BSA 구배 (단계 3.11)를 사용 DRG 신경 세포로부터 해리 나머지 위성 세포의 적어도 수를 줄이기 위해 최적화되었다. Kingham 외. (11)에 의해 설명 된 바와 같이 또한, 사이토 신 아라비 노스 (ARA-C) 보충제, 상기 위성 세포 집단을 최소화하기 위해 BS 배지에 첨가 할 수있다. 그러나, 처리 시간의 선택은 또한 배양 배지에서 ARA-C 보충의 존재에 의해 영향 DRG와 같은 SC-ASC 활력, 조심스럽게 균형을 할 필요가있다. 따라서, 위성 무 세포 시스템을 달성하는 것은 매우 어렵다.

기질로서 카프로 락톤 (PCL) 필름 -도 2는 미처리 화학적 변성 폴리 이용한 공 배양 모델에서 돋 DRG 신경 돌기를위한 SC-ASC 등의 중요성을 보여준다. DRG 뉴런했다 마이단계 4.5에 기재된 바와 같이, BS 배지의 50 %와 줄기 세포 분화 배지의 50 %를 함유하는 혼합 용액을 사용하여, 존재 또는 SC-ASC 등의 부재하에 3 일 동안 배양 ntained. 이 기간 후, 세포를 4 % 파라 포름 알데히드에서 수정 및 β-tubulin의 III (DRG 뉴런)와 S100 (SC-같은 ASC) 세포 형태를 조사하고 신경 돌기를 돌출하는 DRG 뉴런의 기능을 연구하기로 염색. 신경 돌기의 형성은 명확 공존 배양 시스템 (도 2c)에서 개선 된 반면 어떤 신경 돌기는, SC 형 ASC (도 2a)의 부재하에 처리되지 않은 표면 상에 관찰되지 않았다. 평균적으로, 전지 본체 당 신경 돌기의 수는 현저하게 줄기 세포의 존재하에 0에서 3까지 증가 하였다. 이러한 결과의 확인은 또한도 3에 도시 된 전자 현미경 (SEM) 분석을 주사하여 주어졌다. 특히, SEM 이미지는 신경 돌기 발아 DRG 뉴런의 결합 능력은 우선적으로 발생하는 것을 보여SC-같은 ASC와 같은 그림 3C에 노란색 화살표로 표시.

이는 신경 돌기의 형성과 신장에 현저한 효과를 갖는, DRG 신경 세포를 함유하는 배양 시스템 (라미닌 유래 펩타이드 포함) 라미닌 수정 기판의 사용이 빈번하게 신경 세포 배양에 적합한 조건으로 정의되었음을 지적되어야 30-32 . 그러나,도 2D 및도 3d에 도시 된 결과는 생화학 큐들의 조합이 상기 DRG 뉴런의 응답을 향상시킬 수 있음을 보여준다.

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직접 DRG-SC-같은 ASC 공동 배양 시스템 그림 1. 준비. DRG 뉴런과 ASC는 척추와 성인 말의 내장과 사타구니 지방에서 각각 유래전자 흰쥐. 효소 반응의 연쇄를 통한 지방 조직의 소화 후에는 ASC SC 유사 세포로 분화되고, 필요할 때까지 서브 - 컨 플루 언트 상태에서 유지 하였다. SC-같은 ASC는 DRG 수확 이전에 각각의 기판 (24) 시간에 미리 씨앗을 품고있다. 날 DRG 뉴런 추출되고 효소 및 기계적 동작의 시리즈를 통해 해리. 신경 세포는 이전에 접종 SC-같은 ASC의 상단에 시드 및 분석까지 문화에 유지 (혼합 매체 줄기 세포 분화 매체의 50 % 수정 BS 매체의 50 % 포함). 여기를 클릭하십시오 것은 큰 볼 이 그림의 버전입니다.

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다양한 배양 조건에서 DRG 뉴런의 그림 2. 형광 이미지.(A) 치료 PCL 필름 (B) RGD-수정 PCL 필름 (C) 공동 배양 SC-같은 치료 PCL 영화에 ASC와 (D) 공동 배양 RGD-수정 PCL 필름에 SC-같은 ASC와. 세포 변성 BS 배지의 50 %와 줄기 세포 분화 배지의 50 %를 함유하는 혼합 용액을 사용하여 3 일 동안 배양 유지되었다. 이 시간 후에, 세포를 4 % 파라 포름 알데히드에 고정시키고 트리톤 X 용액에 투과 가능하고 비특이적 결합 부위는 1 % BSA로 차단 하였다. 및 S-100에 대한 SC-같은 ASC (AlexaFluor568 적색) 항체; 신경 세포는 β-tubulin의 III (녹색 FITC)에 염색 하였다. 마지막으로 핵은 DAPI (파란색)으로 염색 하였다. 이미지는 형광 현미경 (올림푸스 BX60, Japan)를 사용하여 획득 하였다. 허가와 (재 인쇄 드 루카 등. (30). 더 큰 적이있는를 보려면 여기를 클릭하십시오이 그림의 이온.

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다양한 배양 조건에서 DRG 뉴런의 그림 3. SEM 이미지 (A) 치료 PCL 필름 (B) RGD-수정 PCL 필름;. (C) 공동 배양 처리되지 않은 PCL 필름에 SC-같은 ASC와 (D) 공동 배양 RGD 수정 PCL 필름에 SC-같은 ASC와. 노란 화살표는 공동 배양 시스템에서의 직접적인 상호 작용을 확인 SC-ASC와 같은 DRG 사이의 접촉 지점을 나타낸다. 세포는 3 일 동안 문화를 유지하고 2.5 % 글 루타 알데하이드 (glutaraldehyde)에서 수정되었습니다. 그레이딩 에탄올 시리즈 (50 %, 70 %, 90 %, 100 %)에서 탈수 후, 최종적으로 세포를 헥사 메틸 디 실라 잔으로 세정하고, SEM 분석을위한 스퍼터링 스텁과 금에 장착하기 전에 건조시킨다. 이미지 가속 부피와 SEM (자이스 EVO60, UK)를 이용하여 취득한10kV를의 다케. (드 루카 등. (30)의 허가를 다시 인쇄. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

차 문화가 생체 내에서 axotomy 후 신경 세포의 재생을 연구하는 DRG 뉴런은 자주 신경 세포들 사이에서 사용된다. 여기에서 성인 쥐 DRG 수확 정확한 프로토콜 뉴런 생존을 손상시키지 않고 주변 환경 위성 세포 집단을 줄이는 목적으로 제시된다. SC-같은 표현형로 ​​분화 ASC으로 세포 치료에 대한 SC에 대한 유효한 대안, SC-같은 ASC / DRG 공동 문화 시스템은 상세하게 설명한다.

33 - 널리 라미닌 (또는 라미닌 유래 펩티드 서열) 신경 세포의 생존 및 신경 돌기의 형성 (31)에 유익한 영향을 미칠 것으로 알려져있다. DRG 신경 세포 배양을 수행 할 때 이것은 따라서 신경 세포의 기능의 손실을 방지하기 위해 이전에 코팅 라미닌 각각의 기판을 의뢰한다. 라미닌 코팅의 개념은 또한 설계를위한 기판을 생체에 적용예컨대 폴리 조직 공학 구조물, - 카프로 락톤 (PCL)은 자주 신경 도관 (30)의 제조에 사용된다. 또한, 이전의 연구는 섬유소 행렬은 세 가지 차원 (11)의 연결을 문화에 적합한 물질이라는 것을 보여 주었다.

단백질 코팅 외에도 공동 배양 모델 DRG 신경 세포의 생존과 손상 후 말초 신경계에서 신경 및 SC 사이에 발생하는 상호 작용을 연구하기위한 가치있는 적합한 환경 조건을 제공한다. 세포는 손상 부위에서자가 세포의 모집 시간을 단축하기 위해 신경 디바이스를 사용하여 생체 내에서 이식 될 수있다. 이 세포 노화 / 죽음과 근육의 위축으로 이어질 수 있습니다 심각한 부상에서 특히 중요하다. SC는 말초 신경 재생과 수초, 제한된 가용성 및 느린 확산 속도의 과정에 관여하는 가장 중요한 신경 교세포 있지만 이들에 부적합하게조직 공학 응용 프로그램 (34). ASC는 그들의 풍부하고 SC 표현형으로 분화 할 수있는 능력, 특정 아교 세포 마커를 발현 및 기본 SC 19 기능적 유사성을 보여주는에 유효한 대안이다. ASC는 공존 배양 시스템에 의한 DRG 뉴런 형성 및 신경 돌기의 연장에 도움이 될 수있는 단백질, 성장 인자 5를 생산할 수있다. 그러나, 두 개의 서로 다른 공동 문화 시스템은 실험의 요구 기능으로 설정할 수 있습니다. 본 논문에서 제안 된 방법은 실험실 11 노포 프로토콜 개정판이며 제 2 셀 타입 (DRG 뉴런)이 시딩되는 두 세포 형 사이에 직접 접촉 (직접 공 배양)를 포함 기타 (SC 형 ASC)의 위에. 이 접근법은 신경 세포 배양 물 (35)을 시드 때 기판상의 폐해 전지 층의 존재의 중요성을 입증 이전 연구 결과에 기초 - (37). 이 효과는 줄기 세포 표면에서 ASC 및 다른 큐들로부터 증착 DRG 인테그린을 ​​통하여 세포 - 세포 상호 작용 및 ECM 분자로 인한 것 같다. 또한 매체에있어서 혈청 단백질의 감소는 ASC 기능에 영향을주지 않고, DRG 뉴런의 해리로부터 도출 할 수 위성 세포 오염의 확산을 감소하는 것이 관찰되었다. 그러나, SC의 작은 집단을 포함 위성 셀들은, 또한 완전히 공동 배양 시스템 존재할 것이다 DRG 뉴런 거의 남은 세포 배양 물로부터 제거하기 어렵다. 이들 작은 하위 집단은 또한 손상 후 생체에 존재하는자가 세포를 회수하고, 체외 공부하는 동안 수초 프로세스에 참여할 수 있습니다하는 것이 중요하다. 두 번째 방법 (여기서 제시되지 않음) 개의 상이한 세포 유형 간의 직접 접촉 (간접 공 배양)을 피하고, 세포 배양 인서트의 사용을 포함한다. HowevER, 이는 신경 재생 (긴 신경 돌기를 개발하는 신경 세포의 능력이 감소) 중 생체 조건의 반영하지 않고 있지만, 다른 (38) 상에 소정의 세포 집단에 의해 배지에서 방출 확산 성 요인의 영향을 조사하기 위해 사용되는 .

공개 사항

저자는 이 출판물과 관련된 이해 상충이 없음을 확인합니다.

감사의 글

이 연구는 National Institute for Health Research, Academy of Medical Sciences 및 British Society for Surgery of the Hand의 지원을 받고 있습니다. 또한 미국 Acorda Therapeutics로부터 GGF-2를 지속적으로 공급해 주신 것에 대해 감사드립니다. 저자는 마지막으로 이 프로토콜의 개발 및 최적화로 이어진 지난 몇 년 동안 우리 그룹에서 귀중한 지원과 지도를 제공한 Giorgio Terenghi 교수에게 감사를 표합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
100 &마이크로; m 세포 여과기BD Biosciences35236070 μ m 스트레이너(ref. 352350)는 대안으로 사용할 수 있습니다
15ml 플라스틱 튜브Sarstedt62.554.002
50ml 플라스틱 튜브Sarstedt62.547.004
75cm2 플라스크CorningBC301
레티노산 >98% HPLC, SigmaR2625
ARA-C 보충제SigmaC6645
재조합 인간 FGF-basic (154 aa)Peprotech100-18B
소 혈청 알부민 (BSA)SigmaA9205
콜라겐 분해 효소 I 형Gibco17100-017참고 :이 콜라겐 분해 효소는 지방 조직 소화에만 사용됩니다
콜라겐 분해 효소 IV 형Worthington 생화학LS004188참고 :이 콜라겐 분해 효소는 DRG 외식을 해리하는 데만 사용됩니다
소 태아 혈청 (FBS)바이오세라FB-1001
포스콜린 SigmaF3917
유리 피펫Fisher ScientificFB50253그에 따라 폐기할 날카로운 재료
Glial Growth Factor-2 (GGF-2)Acorda TherapeuticsGGF-2는 Acorda Therapeutics에서 친절하게 기부했습니다. 상업적으로 이용 가능한 대안의 경우 NRG1-&beta를 권장합니다. 1 (R & D Systems, Abingdon)의 최종 농도에서 사용되는 줄기 세포 분화를 위해 영양
혼합 F12 HAM시그마N665837 °C에서 따뜻하게; C 명시되지 않는 한 수조에서
Hank' s 균형 잡힌 소금 용액 (HBSS)시그마H939437도에서 따뜻하게; C: 명시되지 않는 한 수조에서
N-2 보충제 (100x)Invitrogen17502
신경 성장 인자 2.5s 단백질, 마우스 하악선  (NGF)MilliporeNC011
페니실린-스트렙토마이신 (PS)시그마P0781
[헤더]
페트리 접시Corning430165
재조합 인간 PDGF-AAPeprotech100-13A
트립신 Invitrogen25200-05637°C에서 따뜻함; C 수조에서. 이것은 조직 배양 플라스크에서 세포를 분리하는 데 사용됩니다
Trypsin (2x 소 췌장)Worthington BiochemicalLS003703이것은 DRG 해리에 사용됩니다
최소 필수 매체 독수리 (MEM)SigmaM8042Warm at 37 ° C: 명시되지 않는 한 수조에서
2-메르캅토에탄올SigmaM3148생물학적 캐비닛에서 용액을 준비합니다.
: , .

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