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방법 논문

마우스 해마 조직의 예 자궁 Electroporation에와 Organotypic 슬라이스 문화

9.2K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/52550

⸱

2015년 3월 4일

 ,  , 
1Institute of Molecular and Cellular Anatomy, University of Ulm

이 논문에서

요약

여기에서는 해마 발달 중 특정 유전자의 조절 메커니즘을 조사하는 도구를 제공하는 프로토콜을 제시합니다. 자궁외 전기천공법(ex utero electroporation) 및 유기형 절편 배양을 사용하면 단세포에서 관심 유전자의 발현을 상향 및 하향 조절하고 발달 과정에서 이들의 운명을 따를 수 있습니다.

초록

Mouse genetics는 발달 과정에서 특정 유전자의 역할을 결정하는 강력한 도구를 제공합니다. 면역조직화학 및 분자 방법에 의한 결과 표현형을 분석하면 잠재적인 표적 유전자 및 신호 경로에 대한 정보를 얻을 수 있습니다. 특정 조절 메커니즘을 추가로 규명하기 위해서는 특정 유전자의 과발현, 절제 또는 재도입을 통해 특정 조직의 소수의 세포만 조작하고 발달 과정에서 그들의 운명을 따를 수 있는 시스템이 필요합니다. 이를 달성하기 위해 해마 구조, 특히 치상회(dentate gyrus)의 자궁 외 전기천공(ex utero electroporation)과 유기형 절편 배양(organotypic slice culture)이 이러한 도구를 제공합니다. 이 시스템을 사용하여 모자이크 결실을 생성하면 관심 유전자가 전구 세포 증식 또는 신경 분화와 같은 세포 자율 발달 과정을 조절하는지 여부를 결정할 수 있습니다. 또한, 삭제된 유전자 또는 그 표적 유전자를 다시 도입하여 표현형의 구제를 용이하게 합니다. 자궁 전기천공법(in utero electroporation)과 대조적으로, 자궁외 접근법은 치상회(dentate gyrus)와 같은 뇌의 더 깊은 층을 성공적으로 표적으로 삼는 속도를 향상시킵니다. 전반적으로, 자궁외 전기천공법(ex utero electroporation)과 유기형 절편 배양(organotypic slice culture)은 내인성 조건을 반영하는 반(半)네이티브 환경에서 조절 메커니즘을 연구할 수 있는 강력한 도구를 제공합니다.

서론

해마는 기억과 학습에 중요한 역할뿐만 아니라 감정적 인 행동을한다. 하나의 주 기능은 신경계의 높은 소성을 필요로 장기 메모리로 단기 메모리의 통합으로 구성. 해마의 치아 이랑 (dentate gyrus)는 입력 정보에 대한 기본 게이트웨이 역할을하고 성인이 1, 2를 통해 또한 지속적인 신경 두 개의 뇌 영역 중 하나입니다. 해마 구조의 개발이 늦은 배아 발생 동안, 특히 제 3-4주 산후 3 중에 발생한다. 치아의 초기 개발 과정에서 줄기 세포 풀이 성인 신경 4뿐만 아니라 산후에 필요한 설립 이랑. 생후 개발 뉴런뿐만 아니라 성인 신경시 미성숙 최종적 성숙한 신경 전구 세포에 대한 여러 단계를 통해 줄기 세포에서 다양한 단계를 통과. 신경의 발현의 다른 단계에서특정 유전자는 해마 회로 5,6에 성숙하고 새로운 뉴런의 통합을 허용 할 필요가있다.

이 유전자의 많은의 발현 패턴과 함수를 정의 허용 마우스 유전학과 면역 조직 화학 염색에 의한 표현형 분석뿐만 아니라 분자 방법을 사용. 또한 마이크로 어레이 분석뿐만 아니라 크로 마틴 면역 침강 (에 칩)에서 잠재적 인 직접 및 간접 표적 유전자 7,8에 대한 정보를 제공합니다. 그러나, 치아 이랑의 특정 개발에 해마 개발의 규제 메커니즘에 관한 많은 오픈 질문은 여전히​​ 존재한다. 하향 또는 상향 조절 (up-regulation)의 관심 및 / 또는 표적 유전자 개발 중에 그들의 운명을 따르의 유전자 중 특정 유전자가 세포의 적은 수의 조작을 허용하는 필요한 시스템을 조절하는 방법을 추가 통찰력을 얻기 위해. 자궁 일렉트로에서 shRNA를, 관심 또는 Cre 호텔 recombina의 유전자의 cDNA그 자체는 도구를 제공합니다. 전기 천공에 사용되어야 원하는 DNA 또는 RNA를 작은 발현 플라스미드의 존재를 확인한다. 이 접근법은 매우 성공적으로 인해 깊은 뇌 해마 레이어 구조의 위치로 치아 이랑의 개발을 검토 더 도전 접근법을 개발 피질 9,10 공부에서 구현되지만된다.

Organotypic 슬라이스 문화 다음 예 자궁 전기는이 문제 (11, 12)을 우회하는 한 방법입니다. 대조적으로 자궁 전기가 아닌 전체 배아 만 머리 따라서 해마 치아 이랑 (dentate gyrus)을 향해 shRNA를 / DNA를 직접 할 수있는 더 유리한 방법으로 전극을 배치 할 수 있도록 사용됩니다에서. 우리 그룹은 성공적으로 치아 이랑 (dentate gyrus) 개발 (8) 중에 전사 인자 Bcl11b의 역할을 연구하기 위해 전 자궁 전기를 사용. Bcl11b는 R로 치아 이랑 (dentate gyrus) 개발의 이중 역할을면역 조직 화학에 의해 입증 된 바와 같이 선조 세포의 증식뿐 아니라 분화 egulating. 이러한 과정에서 상기 Bcl11b 관여하는 구조를 정의한, Polleux 기 11,12의 프로토콜은 프로토콜 부분에서 후술하는 바와 같이 치아 이랑 (dentate gyrus)을 연구하기 위해 조절 하였다. 첫번째 접근법에서 질문 Bcl11b 자율적 신경 세포 분화 세포를 조절할지 여부를 해결 하였다. 두 번째 방법은 Desmoplakin, Bcl11b의 직접적인 표적 유전자가, Bcl11b 표현형을 구출 할만큼 충분한 지 여부를 조사했다.

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프로토콜

참고 : 모든 동물 실험은 독일의 법에 따라 수행하고, 튀빙겐에있는 정부 기관에 의해 승인되었다.

마이크로 피펫, 솔루션 및 막 1. 준비

  1. 마이크로 피펫의 준비
    1. 다음 프로그램으로 마이크로 피펫 풀러를 사용하여 유리 마이크로 피펫을 당겨 : 열을 : (540), 당기 : 125, 속도 : 20 및 지연 : (140) 바늘 길이의 양을 5.5 cm에.
    2. microgrinder를 이용하여 베벨 바늘 4mm의 적절한 크기의 팁을 얻었다. 팁의 손상을 방지하기 위해 상자 또는 15cm 페트리 접시에 바늘을 저장합니다.
  2. 솔루션의 준비
    1. 플라스미드 DNA 솔루션
      1. 제조사의 프로토콜에 따라 엔도톡신을 준비 자유 맥시 키트를 이용하여 소망하는 cDNA 구조체를 포함하는 플라스미드 DNA를 준비한다.
      2. 플라스미드 DNA (GFP 스파이크 벡터 없음) 3 ㎍ / ㎕의 최종 농도로 용액을 조정 또는 4 ㎍ /μl의 독소에 (GFP 스파이크 벡터의 1 μg의와) 빠른 그린 (최종 농도 0.05 %)를 포함 트리스 - EDTA 버퍼를 확보.
    2. 라미닌 원액
      1. 1 ml의 최종 용적에 멸균 수 라미닌 1mg을 녹인다. -80 ° C에서 100 ㎕를 분주하고 저장을 준비합니다.
    3. 폴리 -L- 라이신 원액
      1. 1 mg / ml의 최종 농도로 멸균 물 50 ㎖ 중의 폴리 L 리신 50mg을 녹인다. -20 ° C에서 1 분취 량 및 저장을 준비합니다.
    4. 행크의 균형 소금 솔루션을 완료 (전체 HBSS)
      1. CaCl2를 10 ㎖의 100 mM이 황산을 10 배 HBSS 100 ㎖, 1 M HEPES 완충액 2.5 ml를 (PH 7.4), 1 M D 글루코스 30 ㎖, 100 mM의 10ml를 조합하여 완전한 HBSS를 준비하고, (4) 1 ml의 M의 NaHCO3. 4 ° C에서 1 L 및 저장에 멸균 업을 추가합니다.
        참고 : 오토 클레이브는 모든 솔루션은 1 M HEPES 버퍼링 기대 한 M D-포도당, FIL 있습니다터 멸균.
    5. 슬라이스 문화 매체
      1. 에 기초 배지 이글 35 ㎖, 완전한 HBSS 12.9 ㎖ (1.2.4), 1 M D 글루코스 1.35 ㎖, 200 mM의 L- 글루타민, 250 μL, 그리고 500 μL 첨가함으로써 슬라이스 배양 배지를 준비 페니실린 - 스트렙토 마이신 50 ㎖의 최종 부피를 얻었다. 4 ° C에서 최종 5 %의 농도와 저장소에 말 혈청을 추가합니다.
    6. 낮은 녹는 점 (LMP) 아가로 오스
      1. 아가로 높은 전력에서 1~2 분 동안 전자 레인지에서 가열 하였다 완전한 HBSS 50 ㎖ (1.2.4)에 LMP의 2g을 첨가하여 4 % LMP 아가 용액을 준비한다. 39 °의 C - 37에서 물을 욕조에이 솔루션을 유지합니다. 4 ° C와 재사용의 솔루션을 저장합니다.
    7. 파라 포름 알데히드 솔루션
      1. 흄 후드에서 1X PBS 100 ㎖에 파라 포름 알데히드 4g을 첨가하여 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA) 용액을 제조 하였다. 60 ° C로 가열하고 용액 용액 C가 될 때까지 1 N NaOH를 몇 방울을 가하여리어.
    8. 투과성으로 해결
      1. 4 ℃에서 0.3 % Trition X-100을 함유하는 저장소와 1X PBS 300 ㎖의 BSA의 9g 녹인다. 장기간 보관시 10 % 아 지드 화 나트륨을 추가한다.
  3. 막 삽입의 코팅
    1. 12 ml의 최종 부피 라미닌 스톡 용액 (1.2.2)와 멸균 수 폴리 -L- 라이신 스톡 용액 (1.2.3)의 일 분취 한 분취 량을 희석.
    2. 멸균의 각 웰 포함 2 ml로 6 웰 플레이트에 막 삽입을 놓습니다. 멤브레인 위에 코팅 용액 1 ㎖를 첨가하고, 5 % CO 2 인큐베이터에서 37 ℃에서 O / N을 배양한다.
    3. 배양 후 막을 멸균 건조 1 ㎖로 3 회 삽입 씻는다. 마른 6 웰 플레이트에서 4 주 4 ° C에서 같은 날 또는 저장소의 코팅 막 삽입을 사용합니다.

2. DNA 주입 및 E15.5의 일렉트로와 E18.5 태아

  1. 5 % 이소 플루 란 포화 기화기에 접속 마취 챔버 내에 배치하여 암컷 마우스를 교배 시간 마취. 1 L / min의 속도로 이소 플루 란과 산소를​​ 순환. 2-4 분 동안 또는 마우스의 발 사이에 집어 테스트하는 의식이 될 때까지 상자에 동물을 유지합니다.
  2. 배아 일에 자궁 경부 전위 (E) 15.5 또는 18.5에 의해 무의식 마우스를 안락사. 배아 (13)를 포함하는 자궁을 해부 차가운 완벽한 HBSS의 15 ~ 20 ml의를 포함하는 페트리 접시에 놓습니다.
    참고 : 이후이 시점에서, 얼음의 배아와 조직을 유지.
  3. 차가운 완벽한 HBSS를 포함하는 두 번째 페트리 접시에 자궁 뿔과 장소에서 각각의 배아를 분리하는 가위를 사용합니다.
  4. 해부 현미경, 자궁 근육의 벽과 미세 집게 (# 55)와 가위를 사용하여 태반을 끊다. 조심스럽게 난황에서 배아를 놓습니다.
  5. decapitat에 본의 가위를 사용하여단지 60 ° 각도로 앞다리 위의 전자 배아. 실험은 배아의 유전자형을 필요로하는 경우, 게놈 DNA의 분리를위한 조직 샘플 (꼬리의 작은 조각)를 수집합니다.
  6. 깨끗하고 건조한 페트리 접시에 머리를 전송합니다. 머리가 60 ° 각도에서 참수되었다 때문에 지느러미 쪽을 배치 할 때, 머리는 한쪽으로 기울해야합니다.
  7. 브레 그마에 반구 주변의 중앙으로 조심스럽게 바늘을 놓습니다 (그림 1A, B). 5-8 펄스를인가, 펄스 당 10 ~ 15 msec의 지속 기간 동안 압력을 30 파운드를 사용 picospritzer III의 페달을 밟아 DNA 용액 (3 또는 4 ㎍ / μL로) 약 2-3 μl를 주입한다. 펄스의 지속 시간과 수는 더 많은 시간을 필요로하는 작은 개구를 가진 바늘 개구의 직경에 의존한다. 각 펄스 사이의 간격은 1 초에 달한다.
  8. 전극을 배치하기 전에, EMBR의 머리에 완전한 HBSS 몇 방울을 적용요. '음'말단은 주입 뇌실 태아의 머리 (도 1C, D)의 귀 아래 주입 심실의 반대측 '긍정적 인'전극과 동일한 측에있는 방식으로 전극을 배치. 50 V. 5 펄스를 적용
    1. E 18.5에 대한 E 15.5에 대한 3mm 전극과 5mm 전극을 사용합니다.

뇌의 해부 (3)

  1. 전기 천공 후, 미세 포셉 쌍의 도움으로 헤드로부터 피부를 떼어. 스프링 가위를 사용하여 두개골의 정중선 소뇌의 중간에 작은 절개 부위를 만든다.
  2. 절개에 봄 가위를 삽입하고 시상 봉합을 따라 길이 방향으로 절단. 두개골을 벗겨 미세 집게를 사용하여 두개골에서 뇌를 분리합니다. 15 ~ 20 ml의 차가운 완벽한 HBSS 용액에 뇌 전체를 전송합니다.
  3. 한편, 4 % LMP 아가 부어껍질 멀리 금형에, 물을 욕조에 37 ~ 39 ℃로 유지했다.
  4. 작은 국자를 주걱으로 전체 HBSS 중 뇌를 타고 고급 티슈 또는 Kimwipes를 사용하여 HBSS를 초과하는 드레인.
  5. 아가로 오스에 부드럽게 뇌 전체를 놓고 미세 바늘의 위치를​​ 조정합니다. 아가로 오스가 응고하고 블록 (관상 섹션의 후각 전구가 포인트) 절단 될 때까지 얼음에 금형을 보관하십시오.

4.에 vibratome 단면 및 슬라이스 문화

  1. LMP 아가로 오스 블록을 잘라 내고 '강력 접착제'를 이용하여 시편 단계에 붙입니다. 접착제는 전사 후 건조에 vibratome의 버퍼 트레이 표본 스테이지이고 블록이 용액에 침지를 완료 할 때까지 HBSS 차가운 얼음 채우기.
    참고 : 단면 전에 70 % 에탄올로 모든 악기 및 장비 표면을 소독.
  2. 다음과 같은 새로운 블레이드를 사용하여 250 μm의 두께에 vibratome 섹션을 준비합니다.
    1. 블록 위스콘신 트림다음 설정 번째; 주파수 - 60 Hz의 진폭 - 0.7 μm의 속도 16-18mm / 초. 느린 속도 (9mm / 초)에서 위의 설정으로 원하는 조직을 포함하는 부분을 잘라. 후뇌에서 절편 시작, 대뇌에서 5-7 섹션을 수집합니다.
    2. 구부러진 주걱의 도움으로 HBSS를 완료하고 모든 섹션 (그림 1E) 수집까지 얼음 계속 차가운 얼음 5 mL를 함유 한 깨끗한 6 웰 배양 접시에 섹션을 전송합니다.
  3. 섹션의 배향을 용이하게하기 위해, 멤브레인 부분을 배치하기 전에 완전한 HBSS 100 ㎕와 교차 방식으로 멤브레인 적셔.
  4. (막에 섹션을 밀어 집게를 사용하여 다음 집게로 부분의 모서리를 선택하고 주걱에 끌어와) 막에 구부러진 주걱을 사용하여 섹션을 전송합니다. 한 막에 5 절까지 놓고 (집게를 사용하여 그림 1 층을 마련). 서로 절을 중복하지 마십시오.
    1. 피펫을 사용하여 막 떨어져 HBSS의 초과를 가져 가라. 여기에 사용 된 특정 멤브레인들은 프레임에 부착되고, 티슈 접촉하지만 매체에 의해 커버 할 수없는 조직 배양 플레이트에 삽입된다.
  5. 슬라이스 배양 배지 (1.2.5) (그림 1G, H)의 1.8 ml를 포함하는 6 웰 플레이트에 막 삽입을 놓습니다. 11 DIV 14 DIV 5 % CO 2와 37 ° C에서 배양 접시를 품어. 절반 매체 (0.9 ml)을 격일로 변경합니다.
    주 :이 단계에서 브로 모데 옥시 우리 딘 시약을 추가 (BrdU의 10 μM 최종 농도)를 라벨링 배양 시간의 처음 20 시간 동안 미디어에 대한 세포 증식.

면역 형광 염색법에 이어 섹션 5. 고정

  1. 잘라 깨끗하고 날카로운 메스 블레이드를 사용하여의 방향에 따라 막 트림섹션.
  2. 4 % PFA (1.2.7) 1 ㎖를 함유하는 24 웰 플레이트에 막과 함께 전송 섹션. 15 분 각 1X PBS로 3 회 세척 한 다음 실온에서 1 시간 동안 섹션을 품어. 부드러운 교반과 함께 4 ° C에서 투과성으로 솔루션 섹션 O / N을 품어.
  3. 다음 날, 투과성으로 용액에 희석 적절한 차 항체와 섹션을, 부화, O / N 또는 교반과 4 ° C에서 48 시간 동안.
  4. 1X PBS로 15 분간 섹션 3 회 세척하고 투과성으로 용액에 희석 적절한 보조 항체와 4 ° C에서 O / N을 품어.
  5. 이차 항체와 배양 후, 10 분 동안 DAPI 염색 한 다음 15 분 동안 1X PBS로 한 번 섹션을 씻는다.
  6. 15 분 각각의 섹션을 1X PBS로 3 회 세척하고 슬라이드를 현미경에 전송합니다. ImmunoMount를 추가하고 부드럽게 섹션의 상단에 커버 슬립을 배치합니다. 4 ° C와 자체에서 슬라이드 O / N을 건조매니큐어와 알.
    참고 : 항상 4 ° C에서 슬라이드를 유지합니다.
    1. 공 초점 현미경 (그림 1I)에 의해 슬라이스 문화를 분석합니다.

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결과

전사 인자의 Bcl11b 삭마 전구 세포 증식 및 치아 이랑 (dentate gyrus)의 감소 된 크기와 셀 번호의 결과 신경 세포 분화의 손상을 야기한다. 또한 돌연변이 신경 세포는 학습과 기억 손상 (8)의 원인이되는 해마 회로에 통합하는 데 실패. 전 자궁의 전기가 사용되었다 이러한 과정에서 Bcl11b의 규제 메커니즘 (들)에 대한 질문에 대답합니다.

문제를 해결하는 데는 Bcl11b 세포 자율적으로 E15.5에 Bcl11b 플록스 / 플록스 해마로, Bcl11b의 모자이크 삭제를 GFP- Cre 호텔 재조합 효소의 구조 나 혼자 GFP (11)의 전 자궁 전기에 의해 생성 된 신경 세포 분화를 조절 Organotypic 슬라이스 문화까지 다음 여부 전기로부터 18 일 (그림 2A, B,이 그림 8에서 수정 된)...

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토론

해마는 학습과 기억에 중요한 기능을 가지고있다. 치아 이랑도 신경이 개발하는 동안뿐만 아니라 성인기에 걸쳐뿐만 아니라 발생 두 뇌 영역 중 하나입니다. 산후 많은 공통 요소를 포함하는 유사한 방식으로 성인 해마 신경 진행한다. 이러한 요소의 규제 메커니즘을 정의하는 것은 다시 새로운 치료법 및 예방 조치로 이어질 것입니다 신경 퇴행성 질환을 이해하는데 매우 도움이 될 것입니다. 이 정보를 얻으려면 하나의 세포를 조작하고 Organotypic 슬라이스 문화 뒤에 전 자궁 내 전기에 의해 입증 된 바와 같이 그 나라의 환경에서 관찰 할 수있는 시스템이 필요합니다.

예 자궁 전기가 성공적으로 피질 개발 11,16 공부에 처음 적용되었다. 해마 개발 Bcl11b의 역할을 검사 우리가 알기로는 D의 첫 번째 설명 전직 자궁 전기입니다치아에 NA 조직 8 이랑. 우리는 피질 개발 (11, 1...

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공개 사항

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

감사의 글

이 작업은 Deutsche Forschungsgemeinschaft에서 SB에 대한 보조금으로 지원되었습니다(BR-2215; SFB 497/A9).

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Flaming/Brown Micropipette PullerSutter Instruments Company (USA)P-97
Fine Glass PipettesWarner InstrumentsG100F-4
MicrogrinderNarishige, JapanEG-44
마취 브래킷 유닛Harvard ApparatusPY2 34-0412
Halovet VaporizerHarvard ApparatusPY2 34-0398
Fluovac SystemHarvard ApparatusPY2 34-0387
IMS FluosorberHarvard ApparatusPY2 34-0415
마취 챔버Harvard ApparatusPY2 34-0460
ElectroporatorBEX CompanyCUY21 EDIT
디스크 전극이 있는 핀셋BEX CompanyLF650P33mm 전극 디스크 전극이 있는 E15.5
핀셋BEX CompanyLF650P5E18.5
Picospritzer IIIParker Hannifin CorporationP/N 052-0500-900
HM 650V 진동 블레이드 마이크로톰, 230VThermo Scientific920120
해부 현미경Carl Zeiss Microscopy GmbhStemi SV8
도립 현미경라이카Leica DM IL LED
컨포칼 현미경LeicaSp5II
6웰 디쉬BD Falcon#353502
6웰 디쉬CELLSTAR#657160
조직 배양 인서트BD Falcon#353090
패스트 그린시그마F7252
라미닌시그마
Poly-L-lysineSigma#P5899
스프링 가위Fine Science Tools15003-08
Extra Fine Bonn ScissorsFine Science Tools14084-08
ForcepsDumont #5511255-20 Inox
HBSS 10xLife Technology14180-046
BMELife Technology41010-26
용 5mm 전극 #L2020년

참고문헌

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  2. Frotscher, M., Zhao, S., Forster, E. Development of cell and fiber layers in the dentate gyrus. Prog Brain Res. 163, 133-142 (2007).
  3. Muramatsu, R., Ikegaya, Y., Matsuki, N., Koyama, R. Neonatally born granule cells numerically dominate adult mice dentate gyrus. Neuroscience. 148, 593-598 (2007).
  4. Li, G., Pleasure, S. J. Morphogenesis of the dentate gyrus: what we are learning from mouse mutants. Dev Neurosci. 27, 93-99 (2005).
  5. Hsieh, J. Orchestrating transcriptional control of adult neurogenesis. Genes Dev. 26, 1010-1021 (2012).
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  16. Nichols, A. J., O'Dell, R. S., Powrozek, T. A., Olson, E. C. Ex utero electroporation and whole hemisphere explants: a simple experimental method for studies of early cortical development. J Vis Exp. (74), (2013).

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