방법 논문

마우스에서의 높은 수준의 안정적인 골수 키메라를 생성하기위한 에이전트로서 골수 억제 술판

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DOI:

10.3791/52553

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2015년 4월 1일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Physiology and Kinesiology, Simon Fraser University, 2The Biomedical Research Centre, University of British Columbia, 3Division of Neurology, Department of Medicine, Neuromuscular Disease Unit, VHHSC

이 논문에서

요약

우리는 busulfan conditioning을 통해 방사선 조사가 없는 상태에서 녹색 형광 단백질을 유비쿼터스하게 발현하는 기증자 마우스의 골수 세포로 대체하는 프로토콜을 설명합니다. 이 기술은 중추 신경계의 골수 세포 축적을 연구하는 데 유용합니다.

초록

골수 이식(BMT)은 수혜자 마우스의 골수(BM) 구획을 기증자 마우스에서 분리된 뚜렷한 바이오마커를 발현하는 BM 세포로 대체하는 데 자주 사용됩니다. 이 기술을 사용하면 수용 마우스 내에서 공여자 유래 조혈 세포를 식별할 수 있으며 다양한 생화학적 기술을 사용하여 공여자 세포를 분리하고 특성화하는 데 사용할 수 있습니다. BMT는 일반적으로 기증자 세포 생착을 위해 수용 마우스의 BM 구획 내에 틈새 공간을 생성하기 위해 전신 방사선 조사를 통한 골수 절제 조건화에 의존합니다. 여기에서 설명하는 프로토콜은 화학요법제인 부설판(busulfan)과 함께 골수억제 조건화(myelosuppressive conditioning)를 사용합니다. 전문 설비를 이용해야 하는 방사선 조사와 달리, 부설판 컨디셔닝은 총 60-100mg/kg의 투여량이 투여될 때까지 20mg/kg 부설판의 복강내 주사를 사용하여 수행됩니다. 더욱이, 골수절제 방사선 조사는 독성 부작용을 일으킬 수 있으며 수용 마우스의 생존을 위해 기증자 세포의 성공적인 생착이 필요합니다. 대조적으로, 이러한 용량을 사용한 부설판 컨디셔닝은 일반적으로 내약성이 우수하며 마우스는 공여자 세포 지원 없이 생존합니다. 공여자 BM 세포는 녹색 형광 단백질(GFP)을 유비쿼터스하게 발현하는 마우스의 대퇴골 및 경골에서 분리되어 조건화된 수용 마우스의 측면 꼬리 정맥에 주입됩니다. BM 키메라증은 BMT 후 말초 혈액 내 GFP+ 세포의 수를 정량화하여 추정합니다. 키메라 수치 >80%는 일반적으로 이식 후 3-4주 후에 말초 혈액에서 관찰되며 최소 1년 동안 확립된 상태로 유지됩니다. 방사선 조사와 마찬가지로, 부설판과 BMT를 이용한 컨디셔닝은 중추신경계(CNS) 내에서, 특히 신경퇴행의 마우스 모델에서 기증자 BM 유래 세포의 축적을 가능하게 합니다. 이러한 부설판 매개 중추신경계 축적은 부설판 치료가 독성이 적고 중추신경계 염증이 덜 광범위한 것으로 보이기 때문에 전신 조사보다 생리학적으로 더 생리학적일 수 있습니다. 우리는 이 세포가 중추신경계에 치료제를 전달하도록 유전적으로 조작될 수 있다는 가설을 세웠습니다.

서론

최근에는 중추신경계(CNS)에서 미세아교세포와 골수(BM) 유래 세포(BMDC)가 질병 중과 정상적인 노화 기간 동안 하는 역할에 대한 관심이 높아지고 있습니다. 중추신경계의 상주 면역 세포인 미세아교세포(Microglia)는 현재 배발생(embryogenesis)1 동안 원시 골수성 전구세포(primitive myeloid progenitor)가 진입한 후 중추신경계에서 발달하는 것으로 알려져 있습니다. 미세아교세포는 성인이 될 때까지 골수단핵구 계통의 측면을 잘 유지합니다. 증거는 건강한 성체 동물에서 미세아교세포에 대한 BMDC의 기여도가 미미하다는 것을 시사하지만1, 다양한 신경퇴행성 질환의 진행에서 BMDC가 하는 역할은 불분명합니다. 이러한 불확실성은 보편적으로 받아들여지는 면역조직화학적 마커가 확인되지 않았기 때문에 CNS 내에 축적된 BMDC와 내인성 상주 미세아교세포를 구별하기 어렵다는 사실로 인해 더욱 복잡해집니다. in vivo에서 BMDC를 모니터링하기 위해 당사는 수혜자 마우스의 내인성 BM 세포를 β-actin promoter의 제어 하에 녹색 형광 단백질(GFP)을 유비쿼터스하게 발현하는 기증자 마우스의 세포로 대체하는 BM 이식(BMT) 프로토콜을 사용합니다. 이 프로토콜은 면역조직화학을 사용하여 수용 마우스 내에서 GFP+ BMDC의 국소화 및 형태를 모두 측정할 수 있도록 하며, 형광 활성화 세포 분류(FACS)에 이어 후속 생화학적 분석을 사용하여 이러한 세포의 추가 특성화를 용이하게 합니다.

성공적인 BMT를 위해서는 수용자 BM 세포 내에 틈새 공간을 생성하여 기증자 세포 생착을 허용하기 위해 수용자 BM 세포를 절제(골수절제라고 함)해야 합니다. 종종, 골수절제는 전신 감마선 조사를 사용하여 이루어지며, 이는 특히 조혈전구세포와 같은 활발하게 분열하는 세포에서 세포 사멸로 이어지는 DNA의 이중 가닥 절단을 유도합니다2,3. 방사선 조사 프로토콜은 충분한 BM 세포 사멸을 유도하기 위해 수행되며, 수용 동물이 BMT로부터 적절한 기증자 세포 생착을 달성하지 못할 경우(소위 '치사 방사선 조사') 동물에게 치사가 발생하도록 합니다. 그러나 방사선 조사에는 전문 시설과 장비가 필요하며, 모든 기관의 연구자가 이용할 수 있는 것은 아닌 수의학 및 축산 자원이 필요합니다. 또한, 골수절제성 방사선 조사는 다른 조직에 잠재적으로 치명적인 손상을 일으킬 수 있으며, 면역 억제로 인해 방사선 조사를 받은 동물은 2차 감염에 더 취약합니다3. 이와 같이, 환자, 특히 어린이와 노인과 같은 위험에 처한 인구에서 사용하기 위해 환자에서 컨디셔닝 프로토콜의 잠재적인 독성 부작용을 최소화하기 위한 저강도 컨디셔닝(소위 'RIC' 프로토콜) 요법이 개발되었습니다4.

일부 RIC 프로토콜은 BM 격실을 조절하기 위해 부설판과 같은 화학요법에 의존합니다. Busulfan은 방사선 조사의 대안으로 임상적으로 자주 사용되는 이중 기능 DNA 알킬화제입니다5,6. 특히, 부설판은 복강내(IP) 주사로 마우스에게 안전하게 투여할 수 있으며, 마우스에 방사선 조사에 필요한 전문 시설과 장비가 필요하지 않습니다. Busulfan conditioning은 본 연구실7과 다른 여러 최근 논문 8-11에서 광범위하게 사용되어 왔습니다. 60-100 mg/kg의 용량을 사용하면 말초 혈액과 BM7에서 높은 수준의 안정적인 키메라(>80% GFP+ 세포)가 확립될 수 있습니다. 중요한 것은, 이러한 용량에서 골수절제술이 완전하지 않기 때문에 마우스는 BM 세포를 지지하지 않고 생존할 수 있다는 것입니다(K. Peake, J. Manning, C. Lewis 및 C. Krieger, 미발표 관찰). 더욱이, 골수억제성 부설판 조건화(busulfan conditioning)를 사용하면 기증자 세포에 의한 말초 혈액 골수단핵구의 빠른 재구성이 이루어집니다. 그러나 말초 혈액 림프구가 공여자 세포에 의한 대체는 속도가 느려서 전신 방사선 조사에 비해 60-100mg/kg의 부설판을 투여할 때 발생하는 면역 억제가 부족하다는 점을 강조한다7.

우리는 야생형 마우스와 신경퇴행성 질환인 근위축성 측삭 경화증(ALS)7 및 알츠하이머병의 마우스 모델에서 BMDC를 조사하기 위해 부설판에 의한 키메라를 성공적으로 사용했습니다. 특정 조건 하에서 상당한 수의 GFP+ BMDC가 CNS7,12 내에 축적되는 것이 관찰되었습니다. 중요한 것은, 방사선 조사를 통한 골수절제 조건화와 마찬가지로, 부설판 조건화와 BMT는 야생형 마우스와 신경 장애 7-11 마우스 모두에서 CNS 내에 GFP+ BMDC 축적을 허용하기에 충분하다는 것입니다. 신경퇴행성 질환 치료의 주요 장애물은 혈액 순환에서 유익한 효과를 발휘할 수 있는 치료 분자를 CNS로 가져오는 능력이기 때문에, 이는 BMDC가 치료 분자를 발현하도록 조작될 수 있으며, 이후에 부설판에 조건화된 수용자의 CNS에 치료제를 전달하는 매개체로 사용될 수 있는 가능성을 제기합니다. 우리가 적극적으로 조사하고 있는 메커니즘입니다. 방사선 조사를 통한 골수 절제 조건화가 부설판 조건화에 비해 중추신경계에서 GFP+ BMDC가 더 많이 축적된다는 것을 발견했지만7, 방사선 조사는 신경퇴행성 질환 환자와 중추신경계 질환의 쥐 모델에서 상당한 독성을 가질 수 있습니다.

우리와 다른 많은 사람들이 신경퇴행성 질환에서 BMDC를 연구하기 위해 BMT 모델을 사용했지만, 수용 마우스의 BM 구획을 뚜렷하게 식별 가능한 BM 세포 집단으로 대체하는 능력은 조혈계의 다양한 측면을 연구하는 데 매우 유용한 도구입니다. 여기에는 조혈 계통 발달, 백혈병, 장기 이식, 이식편대숙주질환 및 면역생물학과 같은 광범위한 연구 주제가 포함됩니다.

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프로토콜

참고 : 윤리 성명 :이 프로토콜을 검토하고 사이먼 프레이저 대학의 동물 관리위원회의 승인을받은 (UACC, 허가 번호 1037K-12와 1060K-03) 및 동물 관리, NIH 가이드에 캐나다 협의회 준수 실험실 동물의 관리 및 사용 및 EEC 이사회 지침.

1. 특별 고려 사항

참고 : 술판은 세포 독성이다. 핸들과 물질 안전 보건 자료 및 제도적 지침에 따라 폐기하십시오.

  1. 층류 후드에서 무균 기술을 모두 수행한다.
  2. 이러한 박리 패키지, 오토 클레이브와 같은 적절한 포장 재료에 포장하여 사용 전에기구를 멸균.
  3. 감염 위험이 조사에 비해 술판 컨디셔닝 낮지 만 이식 후 처음 2 주 층류 후드에서 동물을 처리한다.

2. 컨디셔닝받는 사람 마우스

  1. 멸균 인산 완충 식염수 (PBS)와 ml의 3 ㎎ /에 술판을 희석.
    참고 : 주입 매일 사용하기 직전에 부설 판의 신선한 희석을하는 것이 중요합니다.
  2. 매일 IP 주입을 통해받는 사람 마우스에 희석 부설 판의 20 ㎎ / ㎏을 관리합니다.
  3. 60 ~ 100 mg의 총 투여 량까지 20 ㎎ / ㎏ 부설 판의 일상 IP 주사를 반복 / kg (즉, 80 ㎎ / ㎏ 총 복용량, 4 일 연속 부설 판의 20 ㎎ / ㎏을 투여) 전달되었습니다.

기증자 골수 세포의 3. 분리

참고 :이 프로토콜은 성공적으로 5 기증자 마우스로부터 BM 세포를 분리하고 제조에 사용되었습니다. 일반적으로 마우스 당 세포 수율은 12 ~ 16받는 사람 쥐를 이식하기에 충분 약 천 -4 천만 BMDCs입니다. 이상의 공여 쥐 필요하다면 프로토콜 따라서 조정될 필요가있다.

  1. 술판 조절 euth의 마지막 날 다음CO 2를 사용하여 (1-6개월 이전) GFP 기증자 마우스를 anize (또는 기관에서 받아 다른 안락사 절차에 의해). 이식 합병증받는 사람과 같은 성이다 동계 기증자를 사용하지 않도록합니다.
  2. 70 % 에탄올로 마우스 스프레이. 복부 및 사용하여 수술 가위에서 리프트 피부까지 복강 발목을 향해 다리에서 피부를 통해 절개를합니다. 발을 잡고 단단히 다리 조직을 노출 엉덩이쪽으로 발목으로부터 피부를 잡아 당깁니다.
  3. 고관절을 노출 대퇴골에서 근육과 지방 조직을 멀리 트림.
  4. 부드럽게 다리를 확장 도보로 당기면서, 고관절에 가위를 누릅니다. 그냥 대퇴골 자체를 절단하지 대퇴골 복용 치료의 머리 위에 잘라.
  5. , 불임을 유지 도보로 다리를 잡고 멸균 조직과 뼈의 표면을 문질러 뼈에 남아있는 모든 조직을 청소 도움이됩니다.
  6. 무릎 관절을 통해 절단에 의해 대퇴골과 경골을 분리하고멸균 PBS를 포함하는 배양 접시에서 대퇴골을 배치합니다. 얼음에 품어.
  7. 제거하고 비골은 경골에 연결되는 지점에서 절단하여 비골을 폐기합니다. 대퇴골과 배양 접시에서 경골를 놓고 얼음에 품어.
  8. 반복하여 다른 다리에 대한 3.2-3.7 단계, 그리고 필요한 경우, 추가 기증자 마우스. 뼈를 제거한 다음, 뜨거운 비드 살균기와 수술 도구를 소독 또는 후속 단계에 대한 멸균 새로운 도구를 사용합니다.
  9. 대퇴골의 경우, 집게와 대퇴골을 잡고 조심스럽게 '면도'수술 가위를 사용하여 말단 뼈를 종료합니다. BM 구멍을 노출하는 필요에 따라 뼈의 적은을 제거합니다.
  10. 멸균 PBS의 3 ㎖ 주사기를 입력하고 23 G 바늘을 연결합니다. 조심스럽게 BM 구멍에 바늘을 지루하게하고 멸균 배양 접시에 BM을 세척하십시오. 원하는 모든 세포의 제거를 보장하기 위해 바늘 포인트와 수질 공동을 긁어해야합니다. 추출 후,빨간 BM은 더 이상 볼 수없고 뼈가 지금 흰색 나타나는지 확인합니다.
  11. 반복 같은 배양 접시에 BM의 모든 풀링, 이후 대퇴골에 대한 3.9-3.10 단계를 반복합니다.
  12. 경골를 들어, 조심스럽게 집게로 경골과 '면도'경골이 BM 캐비티를 노출 무릎에 부착 된 끝을 잡고. 적색 가시 BM이 끝나는 뼈를 따라 두 번째 컷을 확인합니다.
  13. 멸균 PBS의 3 ㎖ 주사기를 입력하고 25 G 바늘을 연결합니다. 조심스럽게 (무릎에 부착 된 끝에서) BM 구멍에 바늘을 삽입하고 대퇴골에서 BM을 포함하는 배양 접시에 BM을 세척하십시오. 모든 세포를 제거하기 위해 바늘 BM 공동의 벽을 긁어. 추출 후, 빨간색 BM은 더 이상 볼 수없고 뼈가 지금 흰색 나타나는지 확인합니다.
  14. 반복 같은 배양 접시에 BM의 모든 풀링, 이후의 경골에 대한 3.12-3.13 단계를 반복합니다.
  15. 부드럽게 C를 해리 1 ML의 피펫 팁과 BM을 씹다ELL 학생.
  16. 멸균 50 ㎖ 원심 분리 튜브에 40 μM 바스켓 필터를 통해 세포 현탁액 합격. 남아있는 세포를 얻을 원심 분리 튜브에 필터를 통해이를 전송하는 PBS로 접시를 씻어.
  17. 4 ° C에서 450 XG에 5 분 동안 원심 분리기. 제거하고 상층 액을 버린다.
  18. 적혈구 용해하는 버퍼의 3 ㎖의 펠렛을 다시 일시 중지합니다. 8.5 분 동안 얼음에서 인큐베이션.
  19. 용균 버퍼를 해소하기 위해 멸균 PBS의 ~ 30 ML을 추가합니다.
  20. 4 ° C에서 450 XG에 5 분 동안 원심 분리기. 제거하고 상층 액을 버린다.
  21. 멸균 PBS 1 ㎖에 펠릿을 다시 일시. 얼음에 보관하십시오.
  22. 세포 균질 작은 분취 량을 가지고 PBS로 희석 (1 : 100 1 마우스 1 : 200이 쥐 등)를 이용하여 혈구 세포 수를 정량화.
  23. 8 × 106 세포 / ml에 세포 현탁액을 희석시키고, 얼음에 주입 될 때까지 배양한다.

4. 골수 이식

  1. 인터넷LL 각 마우스에 대한 희석 세포 현탁액 300 μL와 (28 G 인슐린 바늘) 0.5 ML의 주사기를 주입한다. 주사기에 존재하는 공기 방울을 제거해야합니다.
  2. 가열 패드 컨디셔닝받는 마우스를 함유하는 마우스 케이지를두고 꼬리 정맥이 팽창 할 수있다.
  3. 구속 장치에서받는 마우스와 장소를 가져 가라. 70 % 에탄올로 적셔 수술 거즈와 꼬리를 닦습니다.
  4. 단단히 꼬리를 잡고 경사 위로 부드럽게 측면 꼬리 정맥 중 하나에 바늘을 삽입하고 세포 현탁액을 주입.
  5. 출혈이 새로운 깨끗한 케이지에 마우스를 도입하기 전에 멈출 때까지 주사 부위에 수술 거즈를 잡습니다.

5. BM 키메라의 정도를 추정

주 : 키메라 수준 일주 BMT 이후에 말초 혈액에서 통상적 변수이며, 이러한 키메라 레벨은​​ 통상 적어도 이주 BMT 이후로 추정된다. Chim은의 수준erism 포스트 BMT 3-4주 내 말초 혈액에서> 80 % GFP + 세포에 도달해야한다.

  1. FACS 완충액 (PBS 2 mM의 EDTA + 2 % 소 태아 혈청)을 준비한다.
    주 : FACS 완충액 몇 주 동안 39 ° C에서 저장 될 수있다.
  2. 금지 튜브에 마우스를 놓고 측면 복재 정맥을 노출 후방 다리에 털을 면도.
  3. 얇게 코트 석유 젤리와 피어스 25 G 바늘과 복재 정맥과 다리.
  4. 헤파린 코팅 된 모세관에 혈액의 약 50 μl를 수집합니다. FACS 완충액 1 ㎖를 함유하는 마이크로 원심 분리 튜브로 혈액을 추가한다. 반전에 의해 튜브를 혼합하고 얼음에 저장합니다.
  5. 다시 케이지에 마우스를 반환하기 전에 정지 출혈까지 주사 부위에 수술 거즈를 잡습니다.
  6. X 900 g에서 5 분 동안 혈액 샘플을 원심 분리기. 제거하고 상층 액을 버린다.
  7. 적혈구 용혈 버퍼 500 μL에 펠렛을 다시 일시 중지합니다. 8.5 분 동안 얼음에서 인큐베이션.
  8. 용균 버퍼를 해소하기 위해 FACS 버퍼의 1 ML을 추가합니다.
  9. g X 900에서 5 분 동안 원심 분리. 제거하고 상층 액을 버린다.
  10. 적혈구 용혈 버퍼 500 μL에 두 번째 용해 단계를 수행합니다. 8.5 분 동안 얼음에서 인큐베이션.
  11. 용균 버퍼를 해소하기 위해 FACS 버퍼의 1 ML을 추가합니다.
  12. g X 900에서 5 분 동안 원심 분리. 제거하고 상층 액을 버린다. 펠렛은 이제 흰색 있는지 확인합니다.
    주 : 펠렛이 여전히 적색 나타나면 추가적인 분해 단계는 다음 단계로 진행하기 전에 필요할 수있다.
  13. FACS 완충액 1 ㎖에서 펠릿을 다시 일시. g X 900에서 5 분 동안 원심 분리. 제거하고 상층 액을 버린다.
  14. FACS 완충액 300 μL의 펠릿을 다시 중지하고 유세포 사용 GFP + 세포를 정량화 (주 :이 시점에서 셀로부터 임의의 면역 염색은 표준 기술을 이용하여 수행 될 수 있으며, 종래는 유세포 분석 유동).

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결과

60 ~ 100 mg을 투여 / 부설 판의 kg은 일반적으로 잘 마우스에 의해 허용됩니다. 그러나 동물은 일반적으로 식습관을 격려하기 위해 조사 해바라기 씨 등의 치료와 보완 될 필요가있다 조절 단계 (~ 5 ~ 10 %) 때문에 다이어트 중에 체중을 잃게됩니다. 말초 혈액에서> 80 % GFP + 세포의 키메라와 BM의 수준은 60 ~ 100 ㎎ / ㎏ 부설 판 (7)을 사용하여 지속적으로 달성해야한다. 우리의 실험은 성공적으로 말초 혈액 및 BM에서> 80 % GFP + 세포와 100여 키메라 쥐를 생성하기 위해이 프로토콜을 사용하고 있으며, 동계 기증자와받는 사람을 사용하는 경우 우리의 BMTs의 거의 모든 성공이다. 그림 1 키메라의 수준이 주간 정량 표시 성공적인 동계 BMT 수용 100 ㎎ / kg으로 조절 술판 마우스의 말초 혈액에서 (N = 3)과 동종 BMT 실패를 수신하는 80 ㎎ / kg으로 조절 술판 마우스 (N = 3). > 80 % 수준...

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토론

술판 조절은 쉽게 감지 할 수 있습니다 조혈 세포와 생쥐에서 높은 수준의 BM의 키메라의 생성을 허용합니다. 이러한 조절은, 조사 설비를 필요로하지 않고 행할 수있다. 더욱이,이 프로토콜에 설명 술판의 투여 량으로 골수 억제는 잘 조사 골수 투여에 의한 독성 부작용을 최소화 허용하고, 따라서 더 많은 아르 젊은 오래 또는 병에 걸린 마우스에서 BM의 키메라를 생성하기 위해 더 적합한 기술 일 수있다 조사를 골수에 민감. 술판로 달성보다 낮 키메라 레벨을 초래할 수 있으며, 일부 RIC 프로토콜 부작용을 최소화하기 위해 전신 조사 낮은 비 myleoablative 투여 량을 사용하지만, 이러한 프로토콜은 여전히​​ 방사선의 투여 량에 따라, 조사 시설을 필요 에어컨 (13). 최근 treosulfan는 BM 조절 8, 14 사용되어왔다. 술판처럼, treosulfan 컨디셔닝oning 및 BMT는 14 BM 키메라의 고도의 마우스를 생성 할 수있다. 그러나 treosul...

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공개 사항

저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

이 연구는 Ronald Peter Griggs Memorial Fellowship in ALS Research (to KP)와 CIHR, ALS Society of Canada, and Muscular Dystrophy Canada (JNM-69682)의 CK 및 FMR에 대한 신경근 연구 파트너십 프로그램 보조금의 지원을 받았습니다. 미국 ALS 협회(ALS Society of America, 57969)에서도 추가 지원을 제공했습니다. 캐나다 밴쿠버에 소재한 BC 암청(BC Cancer Agency) 테리 폭스 연구소/병리학과의 R. Keith Humphries 박사와 Simon Fraser University Animal Care Unit의 직원들에게 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Busulfex오츠카 캐나다 제약 Inc.DIN 02240602사용 직전에 멸균 PBS로 부설판을 3mg/mL로 희석합니다. Busulfan은 세포 독성이 있습니다. MSDS 및 기관 지침에 따라 취급 및 폐기하십시오.
ACK Lysing BufferLife TechnologiesA10492-01다른 용해 완충액으로 대체할 수 있지만 그에 따라 배양 시간을 조정해야 할 수도 있습니다
Fetal Bovine SerumLife Technologies12483-020
.

참고문헌

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