방법 논문

앞으로 유전학 식별하는 대 식세포를 사용하여 화면

9.8K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/52556

⸱

2015년 3월 12일

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, New York Medical College

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

Forward genetics는 세포 내 병원체에서 세포 자율 면역에 대한 저항에 중요한 유전자를 식별하는 강력한 접근 방식입니다. 현재 접근 방식은 선천성 면역 세포, 특히 대식세포를 사용하여 면역 회피에 중요한 새로운 Toxoplasma gondii 유전자를 식별합니다.

초록

톡소플라즈마증의 원인균인 톡소플라스마 곤디이(Toxoplasma gondii)는 절대 세포 내 원생동물 병원체입니다. 이 기생충은 거의 모든 온혈 척추 동물 세포 유형에 침입하여 복제합니다. 기생충이 숙주 세포에 침입하는 동안, 기생충은 기생충이 복제하는 식세포작용(phagocytosis)과 무관하게 숙주 세포막에서 유래하는 기생 액포(PV)를 생성합니다. IFN 의존성 선천성 면역 및 세포 매개 면역이 감염의 궁극적인 통제에 중요하지만, 호중구, 단핵구, 수지상 세포를 포함한 선천성 면역 세포도 감염 초기에 기생충의 전신 전파를 위한 매개체 역할을 할 수 있습니다. 한 가지 접근법은 전방 유전자 검사에서 숙주 선천성 면역 반응(이 경우 대식세포)을 활용하여 활성화 후 감염된 대식세포에서 적합성 결함이 있지만 순진한 대식세포에서 정상적인 침입 및 복제를 보이는 기생충 돌연변이를 식별하는 방법입니다. 따라서, 이 검사는 대식세포 활성화의 영향에 저항하는 능력에 특정한 결함이 있는 기생충 돌연변이를 분리한다. 이 논문은 감염된 대식세포의 활성화에 따른 돌연변이 기생충의 두 가지 광범위한 표현형을 설명합니다: 기생충 정지 대 기생충 분해, 종종 비정질 액포에서. 그런 다음 기생충 돌연변이를 분석하여 세포 자율 면역의 유도 매개체에 대한 내성에 특히 중요한 책임 있는 기생충 유전자를 식별합니다. 이 논문은 이론적으로 특정 항균 매개체에 대한 내성에 중요한 기생충 유전자를 표적으로 하도록 수정할 수 있는 전방 유전학 스크리닝에 대한 일반적인 접근 방식을 제시합니다. 또한 기생충 돌연변이가 감염되기 쉬운 특정 대식세포 항균 매개체를 평가하는 접근 방식을 설명합니다. 감염된 대식세포의 활성화는 또한 타키조이트에서 만성 감염을 유지하는 서디조이트 단계로 기생충 분화를 촉진할 수 있습니다. 따라서 확인된 기생충 유전자가 만성 감염 확립에 미치는 중요성을 평가하기 위한 방법론이 제시됩니다.

서론

톡소 포자충 (T. 포자충)는 의무적 인 세포, 원 충성 병원체이다. 이 톡소 플라즈마 증의 원인균, 면역 개인의 건강 위험이 있습니다. 또한 포자충과 원 포자충 속을 포함하여 인간을 감염 다른 apicomplexan 병원균의 모델 시스템입니다. 톡소 플라즈마 증은 가장 일반적으로 기생충의 bradyzoite 또는 oocyst 단계에 오염 된 음식이나 물을 섭취을 통해 획득된다. 섭취시,이 단계는 숙주 세포 내에서 복제하고 체계적으로 유포 기생충의 tachyzoite 단계로 변환합니다. T 세포, IFN-γ와, 낮은 정도, 산화 질소 1-4, 감염의 조절에 중요하지만 tachyzoites의 비율로, 병을 제거 할 수없는 조직 포낭 내에서 보호된다 bradyzoite 스테이지로 변환 수명이 긴 만성 감염의 결과. 사실, 어떤 치료제는 만성 낭종의에 효과가없는질병의 다케. 심한 톡소 플라즈마 증은 기본 및 급성 감염의 신속 복제 tachyzoite 단계 특성으로 다시 변환 기생충의 bradyzoite 단계로 인해 지속적인 감염의 재 활성화에 가장 많다.

선천성 면역 반응의면에서 이른 생존 기생충 충분한 기생충 번호에 도달 할뿐만 아니라 만성 감염의 확립을 가능하게하기 위해, 말초 부위에 도달....

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

프로토콜

참고 : 동물의 사용을 포함 모든 프로토콜 뉴욕 의과 대학의 동물 관리 및 사용위원회에 의해 명시된 지침과 규정에 따라 수행되었다.
참고 : 희석 (38), 쥐의 골수 유래 대 식세포 (39)의 분리, T.의 성장을 제한함으로써 화학 돌연변이 (38), 기생충의 분리를위한 상세한 프로토콜 인간의 포피 섬유 아세포에서 포자충 (HFF) 대 식세포의 세포와 낭종 생산 및 기본 면역 형광 분석 (IFA) (32) 참조. (10 % 소 태아 혈청 및 2 mM L- 글루타민, 100 U / ㎖ 페니실린 및 100 ㎍ / ml의 스트렙토 마이신이 보충 된 둘 베코 변성 내 포도당 이글 중간) D10 배지에서 5 % CO 2에서 37 ° C의 모든 세포 배양을 수행 . 세포 절연 부 및 세포 배양에 걸쳐 살균 모든 시약을 보관하십시오.

IFN-γ와 CONCENTR을 확인하는 LPS의 1 용량 적정관리 포인트는 앞으로 유전학 화면에 대한 감염된 대 식세포를 활성화하기 위해 사용하는

  1. 문화 뮤린 골수 유래 대 식세포 O / N 챔버 당 D10 매체의 250 μL에 3 × 105....

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

결과

톡소 포자충은 순진 대 식세포에서 자유롭게 복제하고 6 ~ 12 시간이 기생충의 변형에 따라 사이에 두 배의 시간이 있습니다. (1)가 활성화 된 골수 유래 대 식세포 대 순진한 대표 기생충을 보여줍니다. 그림 2 HFF에서 기생충의 일반적인 형태를 보여줍니다 2, 4, 8, 16, 32 기생충 / PV에서 숙주 세포. 현재 프로토콜에서 기생충은 순진 대 식세포 침입 감염된 대 식세포에 강력한 활성화 자극, LPS 및 IFN-γ의 전달에 앞서 초기 parasitophorous 공포 (PV)를 설립 할 수있다. 이 모델에서, 야생형 기생충의 복제가 느려지지만 기생충 복제는 여전히 식세포 기생충 복제 억제에 점진적 숙달되어이 기간 동안 약 24 시간 동안 진행된다. 화면 유력한 식세포에 필요한 시간 사이 변성 경쟁 모델로서 기능하도록 설계야생형 기생충 또는 기생충 돌연변이가 PV 내에 계속 복제 할 수있는 동안의 시간 대 ctivati​​on. 화면의 첫.......

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

토론

설명 된 프로토콜은 뮤린 골수 유래 대 식세포를 분리 T. 순방향 유전학의 활성화를 사용하여 비 편파 접근법을 제공 자신의 능력에 결함이와 포자충 돌연변이 감염된 대 식세포의 활성화를 생존. 돌연변이 다음 식세포 활성화의 표현형은 일반적으로 두 가지 범주 중 하나에 해당 : 1) 기생충은 그대로 나타나지만 PV 당 1 기생을 넘어 복제하는 데 실패; 2) 기생충이 저하 될 넓고, 비정질 PV가 될 수 있습니다. 돌연변이 활성의 부재하에 나이브 식세포에서 야생형 표현형 기생충 등을 가지고 있다는 사실은 프로토콜과 특이 식세포 활성화를 저항하는 능력을 손상되어 돌연변이를 식별 할 수 증명한다. 일차 골수 유래 대 식세포의 사용은 화면 RAW 264.7 대식 세포주 대 권장 때문에 VACU 당 기생충 및 기생충 수의 모폴로지OLE보다 쉽게​​ 골수 유래 대 식세포에서 시각화 하였다.

앞으로 유전학과 결합 된 설명 화면이 기생충 유전자.......

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

공개 사항

저자는 경쟁하는 재정적 이해관계가 없습니다.

감사의 글

T. gondii 미토콘드리아를 검출하는 항체에 대해 Peter Bradley 박사에게 특별한 감사를 드립니다. 이 작업은 미국 국립보건원(National Institute of Health)의 보조금 AI072028과 D.G.M의 AI107431, 그리고 열대의학 연구를 위한 뉴욕 의과대학(New York Medical College)의 지원을 받았습니다.

....

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
DMEMHycloneSH3008101https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog
아이디=29101& productId=3255471& dis
유형=0& 하이라이트ProductsItemsFlag
=Y& fromSearch=1& 검색 유형 =
PROD& hasPromo=0
Hyclone FBS써모SH3091003https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog
아이디=29104& productId=11737973& dis
유형=0& 하이라이트ProductsItemsFlag
=Y& fromSearch=1& 검색 유형 =
PROD& hasPromo=0
Hyclone DPBS써모SH3002802 https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog
아이디=29104& productId=2434305& dis
유형=0& 하이라이트ProductsItemsFlag
=Y& fromSearch=1& 검색 유형
=프로덕션& hasPromo=0
Hyclone L-글루타민서모SH3003401 https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog
아이디=29104& productId=3311957& dis
유형=0& 하이라이트ProductsItemsFlag
=Y& fromSearch=1& 검색 유형
=프로덕션& hasPromo=0
Hyclone 펜 스트렙써모SV30010 https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/fsproductdetail?storeId=10652&productId=1309668
6& 카탈로그 ID=29104& matchedCat
No=SV30010& fromSearch=1&
searchKey=SV30010& 하이라이트Pro
ductsItemsFlag=Y& endecaSearch
Query=%23store%3DRE_SC%23nav%3D0%23rpp%3D25%23offSet%3D0%23keyWord%3DSV30010%2B%23searchType%3DPROD%23SWKeyList%3D%5B%5D& xrefPartType=시작& 저축= 0.0& xrefEvent=1407777949003_0
& 검색 유형=PROD& hasPromo=0
하이클론 행크스 BSS써모SH3003002https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog
아이디=29104& productId=3064595& dis
유형=0& 하이라이트ProductsItemsFlag
=Y& fromSearch=1& 검색 유형 =
PROD& hasPromo=0
LPS목록 생물학적 제제201http://www.listlabs.com/products-tech.php?cat_id=4&product_id=81&keywords
=LPS_from_%3Cem%3EEscherichia_coli%3C/em%3E_O111:B4
IFN-γPepro Tech Inc50-813-664https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?itemdetail='item'&storeId=10652&
productId=2988494& catalogId=29
104& matchedCatNo=50813664&
fromSearch=1& searchKey=뮤린+ifn+pepro+tech& 하이라이트ProductsItemsFlag
=Y& endecaSearchQuery=%23store%3DRE_SC%23nav%3D0%23rpp%3D25%23offSet%3D0%23keyWord%3Dmurine%2Bifn%2Bpepro%2Btech%23searchType%3DPROD%23SWKeyList%3D%5B%5D& xrefPartType=시작& 저축
=0.0& xrefEvent=1407778210608_
12& 검색 유형=PROD& hasPromo
=0
챔버 슬라이드써모177402https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog
아이디=29104& productId=2164545& dis
유형=0& 하이라이트ProductsItemsFlag
=Y& fromSearch=1& 검색 유형 =
PROD& hasPromo=0
96웰 광학 플레이트Thermo165306https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog
아이디=29104& productId=3010670& dis
유형=0& 하이라이트ProductsItemsFlag
=Y& fromSearch=1& 검색 유형 =
PROD& hasPromo=0
96웰 조직 배양 플레이트Fisher353072https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog
아이디=29104& productId=3158736& dis
유형=0& 하이라이트ProductsItemsFlag
=Y& fromSearch=1& 검색 유형 =
PROD& hasPromo=0
조직 배양 플라스트 T25피셔156367https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/fsproductdetail?storeId=10652&productId=127039
67& 카탈로그 ID=29104& matchedCat
No=12565351& fromSearch=1&
searchKey=156367& 하이라이트Produ
ctsItemsFlag=Y& endecaSearchQu
ery=%23store%3DRE_SC%23nav%3D0%23rpp%3D25%23offSet%3D0%23keyWord%3D156367%23searchType%3DPROD%23SWKeyList%3D%5B%5D& xrefPartType=시작& 저축
=0.0& xrefEvent=1407778974800_
0& 검색 유형=PROD& hasPromo
=0
Ted Pella EM 등급 포름알데히드Ted Pella18505
http://www.tedpella.com/chemical_html/chem3.htm#anchor267712 Triton X-100FisherBP151https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog
아이디=29104& productId=3425922& dis
유형=0& 하이라이트ProductsItemsFlag
=Y& fromSearch=1& 검색 유형 =
PROD& hasPromo=1
Alexa 488 - 단백질 접합 키트Life TechnologiesA20181
http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/A10235 염소 혈청MP BiomedicalsICN19135680https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog
아이디=29104& productId=2133236& dis
유형=0& 하이라이트ProductsItemsFlag
=Y& fromSearch=1& crossRefData
=ICN19135680=2& 검색 유형
=프로덕션& hasPromo=0
Vectashield 마운팅 미디어Vector LabsH1200https://www.vectorlabs.com/catalog.aspx?prodID=428
FITC-conjugated dolichosVector LabsFL-1031https://www.vectorlabs.com/catalog.aspx?prodID=188
LAMP1Developmental Studies Hybridoma Bankhttp://dshb.biology.uiowa.edu/LAMP-1
LysoTrackerLife에 대한 항체 기술L-7526https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/L7526?ICID=search-product
C57BL6 마우스Jackson Laboratories664http://jaxmice.jax.org/strain/000664.html
gp91 phox 녹아웃 마우스Jackson Labaoratories2365http://jaxmice.jax.org/strain/002365.html
iNOS 녹아웃 마우스Jackson Laboratories2609http://jaxmice.jax.org/strain/002609.html
나트륨 니트로프루스사이드ACROS OrganicsAC21164-0250 https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog
아이디=29104& productId=2627727& dis
유형=0& 하이라이트ProductsItemsFlag
=Y& fromSearch=1& 검색 유형 =
PROD& hasPromo=1
DETA NONOateACROS OrganicsAC32865-0250https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog
아이디=29104& productId=2252389& dis
유형=0& 하이라이트ProductsItemsFlag
=Y& fromSearch=1& 검색 유형 =
PROD& hasPromo=1
단클론 마우스 anti-Toxoplasma gondii AbFitzgerald Industries International10T19Ahttp://1degreebio.org/reagents/product/1069274/?qid=652947

참고문헌

  1. Scharton-Kersten, T. M., Yap, G., Magram, J., Sher, A. Inducible nitric oxide is essential for host control of persistent but not acute infection with the intracellular pathogen Toxoplasma gondii. J Exp Med. 185 (7), 1261-1273 (1997).
  2. Schluter, D., et al.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재인쇄 및 허가

이 JoVE 논문의 텍스트 또는 그림 재사용 허가 요청

허가 요청

태그

IFN

관련 논문