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방법 논문

돌이킬 수 및 가역 일방적 Ureteric 폐색의 쥐 모델

31.7K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/52559

⸱

2014년 12월 20일

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1MRC Centre for Inflammation Research, University of Edinburgh

이 논문에서

요약

비가역적 편측성 요관 폐색(unlateral ureteric obstruction, UUO)의 쥐 모델(murine model)은 절단된 요관을 방광으로 문합하여 요관 폐색이 완화되는 가역적 UUO 모델과 함께 제시됩니다. 이러한 모델은 신장 염증 및 흉터뿐만 아니라 조직 리모델링에 대한 연구를 가능하게 합니다.

초록

신장 폐색은 토착 신장 또는 이식된 신장에 영향을 미쳐 신장 손상 및 흉터를 유발할 수 있습니다. 여기에 제시된 것은 편측 요관 폐쇄(UUO)에 의해 유발되는 폐쇄성 신병증 모델이며, 이는 비가역적(UUO) 또는 가역적(R-UUO)일 수 있습니다. 비가역적 UUO 모델에서는 점점 더 심각한 신장 염증과 간질성 섬유성 흉터를 유발하기 위해 요관이 다양한 기간 동안 막힐 수 있습니다. 가역적 R-UUO 모델에서는 요관이 막혀 신증, 세뇨관 확장 및 염증을 유발합니다. 적절한 시간이 지난 후, 이전에 막혔던 요관을 문합하여 방광으로 막힌 요관을 외과적으로 되돌려 신장을 완전히 감압하고 방광으로 가는 소변 흐름을 회복할 수 있도록 합니다. 비가역적 UUO 모델은 질병의 발병 기전, 잠재적인 항염증 또는 항섬유화 요법의 검사를 포함하여 신장 염증 및 흉터의 다양한 측면을 조사하는 데 사용되었습니다. R-UUO의 보다 도전적인 모델은 일부 연구자들에 의해 사용되었으며, 해로운 자극을 제거한 후 손상되고 흉터가 있는 신장에서 염증 및 면역 과정 및 조직 리모델링을 연구할 수 있기 때문에 상당한 연구 잠재력을 제공합니다. 결과적으로, R-UUO 모델은 연구자에게 조직 복구의 주요 측면과 함께 신장 염증의 해결을 탐구할 수 있는 기회를 제공합니다. 이러한 실험 모델은 환자가 종종 감압이 필요한 신장 폐쇄를 가지고 나타나고 일반적으로 현재 치료 옵션이 없고 결국 말기 신부전으로 이어질 수 있는 심각한 잔여 신장 손상을 남기기 때문에 인간 질병과 관련이 있습니다.

서론

여기에 설명된 실험 모델의 전반적인 목표는 비가역적(UUO) 또는 가역적(R-UUO)일 수 있는 편측 요관 폐색(UUO)에 의한 폐쇄성 신병증을 유도하는 것입니다. UUO의 간단한 비가역적 모델이 제시되며, 이는 좌측 요관이 봉합사를 통한 결찰 또는 결찰 클립의 적용에 의해 영구적으로 막히는 것입니다. 그 결과 요관이 현저하게 확장되고 신장 혈류가 감소하고 사구체 여과가 이루어집니다. 신장 조직학은 세뇨관 확장과 점점 더 심각한 간질성 신장 염증 및 섬유증을 보여줍니다. 비가역적 UUO는 유용한 모델이며 신장 염증과 섬유증 모두에서 많은 연구자들이 채택했습니다. 1-4 UUO의 비가역적 모델은 약간의 외과적 전문 지식이 필요하지만, 비교적 간단하며 간질성 신장 손상의 발병 기전과 그에 따른 섬유증에 대한 통찰력을 찾는 데 자주 사용됩니다. 또한 Tapmeier et al.이 원래 설명한 방법의 수정을 사용하여 덜 자주 사용되는 R-UUO 모델이 제시됩니다. 5 R-UUO 모델은 염증 및 면역 과정, 세포 및 조직 재생뿐만 아니라 해로운 자극 제거 후 후속 조직 리모델링에 대한 연구에 대한 많은 미래 잠재력을 가지고 있습니다.

더 도전적인 R-UUO 모델은 흥미로운 결과를 얻었지만 여기에 설명된 것과 상당히 다른 수술 기술을 사용하는 일부 그룹과 함께 제한된 수의 연구자에 의해 사용되었습니다6,7. 제시된 R-UUO 모델에서, 요관은 원하는 수준의 부상 및 섬유증을 유도하기에 충분한 기간 동안 완전한 요관 폐쇄를 유도하도록 결찰됩니다: 여기에 설명된 방법에서 7일의 UUO가 선택되었습니다. 요관 폐쇄는 역전되고 신장은 마우스를 도태시키고 분석을 위해 신장을 제거하기 전에 연구자가 결정한 기간 동안 신장을 감압하도록 허용합니다: 염증 및 섬유증의 해결을 연구하는 경우 더 긴 기간이 선택되지만 여기에 설명된 방법으로 7일의 감압이 선택되었습니다. 여기에 설명된 방법은 상당한 수술 전문 지식이 필요하지만 다른 R-UUO 모델에 비해 몇 가지 이점을 제공합니다. 막힌 요관에 부드러운 벽으로 된 플라스틱 튜브를 적용하면 과도한 요관 팽창을 방지하고 이는 요관의 후속 조작 및 문합을 용이하게 합니다. 또한, 설명된 R-UUO 모델에서는 요관이 분리되어 잔류 요침전물 및 파편을 제거할 수 있습니다. 이것은 남아있는 요관 내강이 막히지 않고 방광을 문합하기 전에 특허를 받았음을 확인합니다.

비가역적 UUO 모델과 가역적 UUO 모델을 모두 통합한 실험은 연구자들에게 손상과 후속 해결 및 재생의 분자 및 세포 메커니즘에 대한 강력한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 따라서 여기에 설명된 R-UUO 모델은 염증 후 조직 리모델링 및 이를 조절할 수 있는 방법에 관심이 있는 연구자와 매우 관련이 있습니다.

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프로토콜

일반 지침 : 동물 실험은 동물에 의해 부과 된 지침과 규정에 따라 (과학적 절차) 법 1986이 프로토콜 많은에서 수행 할 수있는 동반 비디오 프로토콜 표준 UUO 및 R-UUO 모두이며, 수행되었다 마우스 균주. 첨부 된 비디오에서 두 절차는 남성 C57BL / 6 마​​우스 세 팔주에서 수행됩니다. 대표적인 결과 섹션에 제시된 데이터는 남성 FVB / N 마우스로부터 얻었다.

주 :이 프로토콜 및 표준 방법을 수행 UUO R-UUO 왼쪽 요관을 이용하여 비디오 정보를 수반하지만 동일한 기술을 쉽게 오른쪽 요관에 적용될 수있다.

1. 동물 준비 및 개복술

  1. 살균 (멸균) 장비 및 소모품 모든 절차를 수행합니다.
  2. 마취 복강 케타민 염산염 (70 ㎎ / kg) 및 medetomidine 염산염 (1 ㎎ / kg)을 주사마우스. 참고 : 결과 마취 평면의 지속 시간은 4 시간이며, 더 추가 마취가 필요하지 않습니다.
  3. 반사 예를 들어, 발가락 핀치의 손실에 의한 마취의 깊이를 확인합니다.
  4. 절개 주변 지역 모든 머리를 제거하고 희석 클로르헥시딘 솔루션의 응용 프로그램을 통해 수술을 위해 복부 피부를 준비합니다.
  5. 앙와위에서 가열 수술 패드에 마우스를 놓고 낮은 압정 접착 테이프를 사용하여 패드에 사지를 고정합니다.
  6. 절차 동안 가열 패드 수술의 결과로서 열 화상 흔적 마우스를 모니터링. 가능하면 비 전기 열원을 사용한다.
  7. 부 프레 노르 핀 염산염 (내지 0.06 ㎎ / kg)의 피하 주사에 의해 진통을 관리하고 각막 건조를 방지하기 위해 눈 윤활제를 적용합니다.
  8. 정중선 개복 및 복강에 접근하기 위해 조직 분리 가위를 사용하여 무 혈관의 백선 알바의 절개를.
  9. 마우스를 올려 놓와 콜리 브리를 삽입절개에 트랙터.

2. 일방적 Ureteric의 방해

  1. 멸균 면봉을 사용하여 복강의 오른쪽으로 장을 변위에 의해 왼쪽 요관을 노출하고 젖은 커튼로 커버.
  2. 각도 집게 격리하고 왼쪽 요관을 들어 올려 사용.
  3. ureteric 방해를 만들려면 아무 곳이나 방광 및 신장 골반 사이의 6 / O 검은 꼰 실크 봉합사로 두 번 왼쪽 요관을 결찰. 장기 실험을 위해, 모든 복부 수술에 대한 흡수성 봉합사를 사용합니다. 대안 적으로, 결찰 클립 요관에 적용될 수있다.
  4. 방광 요관으로부터 격리하기 위해 두 요관 봉합 사이를 나눈다.
  5. 조심스럽게 복강에 장을 교체합니다.
  6. 4 절에 나와있는 단계를 수행 - 수술 후 회복 및 관리는 절개를 닫고 마취를 반전 할 수 있습니다.

Reversibl 3. 준비전자 일방적 Ureteric의 방해

  1. 수술 마우스를 준비하고 단계 위의 1.1-2.2에서 설명하는대로 왼쪽 요관을 격리 할 것.
  2. 반전 될 수있는 ureteric 방해를 만들려면, 방광에 가까운 6 / O 검은 꼰 실크 봉합사로 두 번 왼쪽 요관을 결찰. 이는 요관 주위 장소에 부드러운 벽 플라스틱 튜브를 고정하는 데 사용되는만큼 상부 봉합사의 한쪽 끝을 남겨주세요.
  3. 그것은 그것이 요관에인가 될 수 있도록 오픈 스플레이 될 수 있도록 부드러운 벽의 플라스틱 튜브의 길이 5mm의 길이 방향 슬릿을 확인. 1mm와 2mm의 외경 내경 상관 벽으로 부드러운 실리콘 플라스틱 튜브가 사용될 수있다.
  4. 요관 주위에 부드럽게 부드러운 벽 플라스틱 튜브를 놓습니다. 이 요관 주위를 닫으면 긴 봉합 튜브의 슬릿의 중심에서 나온다 있는지 확인합니다.
  5. 요관을 둘러싸는 부드러운 벽으로 둘러싸인 튜브 주위에 6 / O 검은 꼰 실크 봉합사의 길이를 놓고 넥타이한 번. 이제 길이 방향으로는 이전에 묶여 봉합 위에 놓여 있도록 튜브를 통해, 튜브의 슬릿의 중심에서 신흥, 봉합의 긴 끝을 배치합니다.
  6. 튜브 및 요관 주위 장소에 긴 봉합 끝을 고정 두 번 튜브 주위에있는 봉합사를 묶어.
    주 : 요관 및 연질 플라스틱 배관 벽에 유착 형성을 방지하기 위해 접착 환원 액 배관 주변에 적용될 수있다.
  7. 조심스럽게 복강에 장을 교체합니다.

4. 수술 후 복구 및 관리

  1. 5 / O 검은 꼰 실크 봉합사를 사용하여 블랭킷 스티치와 복막을 닫고 금속 피부 클립을 사용하여 피부에 근접.
  2. 수술 후 감염의 위험을 최소화하기 위해, 복부 피부에 요오드 / 알코올 용액으로서 방부제 등을 적용한다.
  3. 피하 atipamezole 염산염 (2 ㎎ / kg)와 부분적으로 반대 마취.
  4. 1 ml의 피하 주사에 의해 유체를 관리 식염수를 따뜻하게.
  5. 이 의식을 회복 할 때까지 마우스를 모니터링합니다.
  6. 마우스가 24 시간 동안 29 ° C로 유지 가열 상자에 복구 할 수 있습니다. 적신 음식은 유체 및 영양 섭취를 장려하기 위해 제공 될 수있다.
  7. 장애물이 원하는 수준의, 일반적으로 7 일 유도하기 위해 복구하기 위해 마우스를 둡니다.
  8. 장기적 회복 실험에 지속적인 진통제를 제공한다. 마우스를 7 일 이상을 위해 회수 될 경우, 피부 클립을 수술 후 7 일 제거.
  9. 폐색 원하는 레벨이 유도되면, 하나 후술하는 바와 같이, 역방향 UUO, 경부 탈구에 의해 마우스를 안락사 조직 병리학 분석 신장을 모은다.

5 가역 일방적 Ureteric의 방해

  1. 단계에 설명 된대로 R-UUO가 수술을 위해, R-UUO을위한 준비를 마쳤습니다 마우스를 준비 수행하려면 10.1-1.7.
  2. 존재하는 경우, 피부 클립을 제거하고 분할 또는 복강에 접근하기 복막에 봉합사를 제거한다. 주 :이 요관 장기 실험 피부 클립 방해 되었다면 응용 다음 7 일 제거 된 것이다.
  3. 마우스를 준비 단계 1.8-2.2에서 설명한 바와 같이 왼쪽 요관을 격리.
  4. 각도 집게를 사용하여 형성 할 수있는 모든 육아 종성 조직에서 부드러운 벽 플라스틱 튜브를 무료.
  5. 메스 차단 된 요관 주위의 플라스틱 튜브를 들고 봉합을 잘라 튜브를 제거합니다.
  6. 왼쪽 신장에 수신증의 존재를 평가하여 성공적인 UUO을 확인, 신장은 창백 나타납니다.
  7. 봉합 사이의 요관을 나눈다.
  8. 멸균 거즈의 작은 조각에 부착 신장 수뇨관의 나머지 길이를 놓는다. 이것은 수뇨관에서 소모 시키게 뇨 침전물과 사균을 수집하는 데 사용할차 봉합 한 번 신우가 제거됩니다.
  9. 위의 요관을 분할하지만, 근처, 봉합사와는 신장이 거즈에 배출 할 수 있습니다. 방광에 가장 가까운 그대로, 낮은 봉합을 남겨주세요. 이은 소변이 방광과 복강으로 누출 없다는 것을 확인하는 것입니다.
  10. 요관과 신우가 배출되고 나면, 요관의 남은 길이의 끝에 긴 6 / O 검은 꼰 실크 봉합사를 적용합니다. 이것은 나중에 수행 방광 문합에 요관을 돕기 위해 사용됩니다.
  11. 방광 요관의 나머지 길이를 문합 아래 단계에 따라 :
    1. 그것의 원래 위치로 전방을 거짓말과 신장을 통해 거짓말을하도록 요관 돌립니다.
    2. 그것이 방광의 방향으로 나온다되도록 요관의 단부로부터 하나의 8 / O 폴리 아미드 모노 필라멘트 봉합사를 점착 2mm를 놓는다. 봉합사는 근육 코트에 남아 있고 요관 루멘를 입력하지 않도록주의하십시오. 시침 봉합 줘야L은 방광 요관을 고정하기 위해 사용될 수.
    3. 방광을 통해 채널을 생성하기 위해서는 방광의 정면 (복부) 벽쪽으로 종료하도록 방광을 통해 대각선으로 21G 바늘을 전달합니다.
    4. 21G 바늘의 경사에 눈 바늘을 휴식. 방광을 통해 눈의 바늘을 안내하는 21G 바늘을 사용합니다. 눈 바늘은 방광을 통해 요관을 위해 사용됩니다.
    5. 9 / O 시침 봉합사를 통과, 방광에서 밖으로 엔트리 포인트에 인접한 방광 벽을 통해 첫 절개를 통해, 단계 5.11.2에서 요관에 적용. 방광 요관이 통과되면 이는 방광 요관 앵커에 연결된다.
    6. 눈 바늘을 통해 단계 5.10에서 요관의 끝 부분에 적용되는 긴 6 / O 검은 꼰 실크 봉합사를 놓습니다.
    7. 조심스럽게 요관도 방광을 당겨을 보장하는 동안 방광 밖으로 눈 바늘을 철회.
    8. 요관은 일에서 나온다되면전자 블래 눈동자 바늘을 제거하고 다시 방광 수축을 방지 요관의 끝에 긴 봉합 클램프를 적용.
    9. 방광의 장소에서 요관을 고정하려면 단계 5.11.5에 적용되는 9 / O 폴리 아미드 모노 필라멘트 압정 봉합을, 넥타이.
    10. 단단히 방광 내 요관을 고정하기 위해 진입 점을 중심으로 두 위치에서 단계 5.11.2 및 5.11.5에 설명 된대로 추가 한 9 / O 폴리 아미드 모노 필라멘트 타이 봉합을 적용합니다.
    11. 열이 위의 뒷면을 사용하여 응급 요관의 더 많은 노출을 뒤로 살짝 방광 벽에 ​​밀어 넣습니다.
    12. 요관의 끝에있는 긴 봉합 위의 요관을 나눈다. 요관 방광의 몸으로 철회해야한다. 이 요관의 오픈 루멘을 확인, 방광의 구멍에서 흐르는 소변을 관찰하는 것이 일반적이다.
    13. 9 / O 폴리 아미드 모노 필라멘트 봉합사 방광에 상처 출구를 닫습니다.
  12. 조심스럽게에 장을 교체복강.
  13. 단계 4.1-4.8에서 설명하는대로 수술 후 치료를 제공합니다.
  14. 신장이 칠일 일반적으로 압축이 해제 될 때까지 마우스를 복구 할 수 있습니다.
  15. 실험 종료 시점에서, 경부 탈구에 의해 마우스를 안락사 및 조직 병리학 적 분석을 위해 신장을 모은다.

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결과

신장의 모양이 변경 현저 ureteric 폐쇄를 다음과는 창백한와 시간 촉진에 시제 (그림 1)가된다. 장애물과 신우 요관의 근위부의 증가 팽창이있다. 신장은 신장 피질과 수질의 현저한 얇아 결과 연장 방해 폐쇄성 신증 증가의 지속 시간으로 점점 위축된다. ureteric 폐색의 반전에 따라, 신장의 색 혈류 증가 및 조직 부종 해소 할 어두워진다. 그들은 연장 팽만의 기간 (그림 1)의 결과로 약간 '헐렁한'남아​​있을 수 있지만 신장 요관과 신우의 팽창이 가라 앉는다. 조직 손실의 정도 방해의 지속 기간에 의존 하겠지만 조직의 위축이 불가피 소자로 드 막혀 신장 대측 신장보다 전형적으로 작다.

정상이 아닌 조작 네이티브 신장의 조직 학적 많은 세관은 분명 (그림 2) 루멘 식별을 갖는 tubulointerstitium의 소형 세관에 둘러싸여 사구체을 보여준다. ureteric 폐색에게 신우 및 요관 ...

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토론

신장 폐쇄는 자연 신장 또는 이식된 신장에 영향을 미치고 신장 손상 및 흉터를 유발할 수 있습니다. R-UUO 모델은 환자가 종종 전립선 비대증, 후방 요도 판막 등에 이차적인 신장 폐쇄를 나타내기 때문에 현재 치료 옵션이 없고 결국 말기 신장 질환으로 이어질 수 있는 심각한 잔여 신장 손상이 있는 환자와 함께 감압이 필요한 경우가 많기 때문에 인간 질병과 관련이 있습니다. 8,9 여기에 자세히 설명된 모델은 비가역적 UUO와 R-UUO를 모두 연구할 수 있게 해줍니다. 비가역적 UUO를 사용하면 다양한 백혈구 및 매개체1-3,10 의 역할을 포함하여 염증 및 조직 손상을 연구할 수 있으며, R-UUO 모델에 대한 연구를 통해 연구자는 신장 손상 및 관련 조직 리모델링의 해결을 탐색할 수 있습니다. 6,7,11-15

다른 연구자들은 요관 폐쇄를 유도하고 역전시키기 위해 다양한 방법을 사용했습니다. R-UUO 모델의 첫 번...

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공개 사항

저자는 더 경쟁 또는 공개 할 이해 관계 충돌이 없습니다.

감사의 글

본 연구는 Kidney Research UK(ST4/2011), Cunningham Trust(CT11/14), Mrs AE Hogg Charitable Trust for Kidney Research 및 Renal Endowment Fund of the Royal Infirmary of Edinburgh의 보조금으로 지원되었습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
무딘 해부 가위Fine Science Tools14072-10
스프링 가위; 직선Fine Science Tools15000-10
톱니 집게Fine Science Tools11021-12
각도 집게 x 2Fine Science Tools00649-11
직선 집게Fine Science Tools00632-11
Colibri 3cm 와이어 견인Fine Science Tools17000-03
잠금 장치가 있는 Castroviejo 바늘 홀더Fine Science Tools12565-14
상처 클립 애플리케이터Fine Science Tools12031-07
7mm 상처 클립Fine Science Tools12032-07
잠금 장치가 있는 Castroviejo 마이크로 바늘 홀더Fine Science Tools12060-01
OPMI 피코 현미경Carl ZeissS100
Heat 전자 패드Cozee Comfortn/a
6/O 실크 꼰 봉합Harvard Apparatus72-3287
9/O Dafilon (폴리아미드) 봉합B-BraunG1111434
5/O 꼰 실크 봉합Harvard Apparatus51-7680
일반 베벨 바늘, 1 인치, 21GBecton, Dickinson and Company305175
1ml 주사기 슬립 팁Becton, Dickinson and Company300184
Wypall 종이 면봉Kimberley-ClarkL40살균 (오토 클레이브)
면봉Johnson and Johnsonn / a살균 (오토 클레이브)
일반 커튼GuardianCB03멸균 (오토클레이브)
연질 벽 실리콘 고무 튜브실리콘 튜브 - 내경 1.0 mm; 외경 2.0 mm; 벽 두께 0.6 mm
(Lacri-Lube) 백색 연질 파라핀 57.3 %, 미네랄 오일 42.5 % 및 라놀린 알코올 0.2 %Allergan Ltd21956GB10X
(Videne) 포비돈 - 요오드 10 %Ecolab LtdPL 04509/0041
(Vetalar V) 케타민 염산염화이자 동물 건강VM 42058/4165100mg/ml 용액
(도미토) 메데토미딘 염산염오리온 파마VM 06043/40031mg/ml
(베터지식) 부페르노르핀 염산염알스토 동물 건강VM 00063/40020.3mg/ml
(안티세단) 아티파메졸 하이드로코라이드오리온 파마VM 06043/40045mg/ml
(숙련자) 4% 이코덱스트린박스터접착 환원 용액
NaCl 0.9%BaxterFKE1323
기 사 사 사

참고문헌

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