방법 논문

하이드로 겔은 구축 및 쥐 심근 경색 모델에서 치료를 제공하기 위해 접착제 접근을 섬유소 기반.

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DOI:

10.3791/52562

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2015년 6월 14일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Bioengineering, University of Illinois at Urbana-Champaign

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 하이드로겔 시스템과 피브린 기반 접착제를 사용하여 심근 경색의 줄기 세포 치료를 위한 불량한 세포 생착의 한계를 완화하는 것을 목표로 합니다. 이 접근법을 사용하면 경색 후 세포와 조직의 접촉을 유지할 수 있어 손상 부위에서 유익한 제제의 치료 잠재력을 높일 수 있습니다.

초록

쥐 MI 모델은 심혈관 질환 분야에서 널리 인정받고 있으며, in vivo1 치료의 효능을 테스트하기 위한 첫 번째 단계로 지속적으로 사용되어 왔습니다. 전통적으로 확립된 프로토콜은 동물에 대한 피해를 최소화하기 위해 더욱 세밀하게 조정되었습니다. 특히, 가슴 근육층은 단순히 절단하는 것이 아니라 놀리며, 흉곽 절개술에서 갈비뼈를 부러뜨리는 대신 늑간 절개술에 접근하여 흉곽의 무결성을 보존합니다. 이러한 변화로 동물에 대한 전반적인 스트레스가 감소합니다.

MI로 인한 손상을 완화하기 위한 줄기세포 치료법은 수년에 걸쳐 혈관신생 촉진 및 항세포사멸 효과에 대한 가능성을 보여주었습니다. 세포를 심장 표면으로 전달하는 현재의 접근 방식은 일반적으로 손상된 부위 근처, 관상 동맥 내 또는 말초 혈류2-4에 세포를 주입하는 것입니다. 세포가 손상된 심근에 서식하는 것으로 입증되었지만, 손상 부위의 생착이 불량하여 기능이 제한되어 혈류로 확산됩니다5. 이 원고는 세포로 캡슐화된 하이드로겔 패치를 사용하여 이러한 장애물을 극복하는 절차를 강조합니다. 패치는 수술 전에 제작되며 왼쪽 관상동맥 폐색 직후 손상된 심근에 배치됩니다. 패치를 제자리에 부착하기 위해 생체 적합성 외부 피브린 접착제를 패치 바로 위에 놓아 패치와 심장 표면 모두에서 건조시킬 수 있습니다. 이 접근법은 섬세한 세포 캡슐화 치료 구조의 적용을 위한 새로운 접착 방법을 제공합니다.

서론

심근 경색 (MI)는 주요 관상 동맥의 폐색으로 인한 심장의 영역에 혈액 차단으로 정의된다. MI 인한 손상으로 인해, 또는보다 구체적으로, 좌심실은 제대로 치는 심장의 기능을 감소 비 기능적 흉터 조직으로 생존 가능한 심장 조직의 리모델링이다. 이것은 행정 용적으로 알려진 모든 심장 박동, 및 박출계수 6라고도 각 심장 박동 심장 밖으로 펌핑되어 혈액의 백분율로 본체에 전달 될 ​​수있는 혈액의 체적 감소를 초래. 이들은, 다른 기능 감소와 함께, 적절한 기능을 유지하기 위해 심장의 나머지 부분에 변형을 증가시킨다. 이 두 번째 심장 마비에서 개인 (7)의 약 10 % 본 현상을 일으키는 종종이 증가 된 균주는 매우 심각한 될 수 있습니다.

의료 행위는 치료를 위해 진화하는 동안MI의 직후, 아니 기술은 저속, 정지, 또는 조직 리모델링의 부작용을 반전하기 위해 개발 없습니다. 줄기 세포 치료가 유망한 잠재력에도 불구하고, 이러한 치료 가능한 수단으로 부상 한 줄기 세포는 임상에서 성공적으로 검증되지 않았다. 그들의 결점 일설 유익한 세포 유리한 결과를 생성하는 5 충분히 경색 부위에서 유지되도록 할 수 없다는 것이다. 그것은 단순히 경색 부위에 주입 세포의 더 이상의 24 %가 생존하지 않고 손상된 사이트 1 일 인도 후 2에 남아 있음을 보였다. 세포의 보존이 문제를 해결하기위한 가능한 전망은 손상된 세포 또는 사이트로 전달 될 수있는 치료제, 하나를 캡슐화하는 생체 적합성 히드로 겔 시스템을 개발하는 것이다. 이 프로토콜의 선택의 하이드로 겔 인해 전지 밀봉 PR에 이전에 사용 된 폴리 (에틸렌 글리콜) 디 메타 크릴 레이트 인ocedures 그러나 캡슐화 할 수있는 임의의 하이드로 겔 8을 사용할 수있다. 직접 부상에 패치의 전달은 세포가 심근 근본적인 요인에 유익을 제공 할 수있는 시간의 길이를 증가, 장기간에 걸쳐 세포 간 조직의 접촉을 보장한다.

패치 접근법 병목 심장 표면에 패치를 부착하는 어려움이다. 많은 그룹은 기술, 심장 표면 9,10에 구조를 묶는 간단한 봉합되는 가장 널리 다양한 통해이를 극복했다. 이 구조는 강성 재료로 제조되는 경우의 수가 성공적으로 입증하지만 인해 높은 물 농도 패치 구조의 섬세한 특성상 하이드로 시스템에서 시도 할 때 실패했다. 이것을 극복하기 위해, 우리는 혈전 형성의 화학을 모방 피브린 접착제 외부 접착 시스템을 이용했다. 섬유소 접착제는 INC, 수많은 의료 수술에 사용되어왔다상처 밀봉 11-13로 제품의 생체 적합성을 강조, 경질 눈물, 기관지 누공, 각막 이식을 luding. 또한 섬유소하지만, 심장 패치 부착 접착제로서의 사용은 일반적으로 14 ~ 17 사용하지 좌심실 파열 및 관상 동맥 우회 수술 수술을 포함한 심장 다양한 목적을 위해 사용되어왔다. 심장 작용에 패치를 보장하기 위해 가능한 부착 시스템을 제공하는 단계, 외부 심장 패치의 외부에 직접 배치 될 수있는 생체 적합성 접착제 피브리노겐과 트롬빈 결과의 간단한 제제.

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프로토콜

절차 IACUC 프로토콜 번호 13302와 완벽한 호환성에 동물 자원의 분할에 의해 승인되었습니다.

1. 장비 준비

  1. 멸균을 위해 수술 전에 사용 된 모든 비 - 일회용 악기 압력솥.
  2. 용도 사이 유리 비드와 함께 살균 세션에서 여러 번 사용기구를 멸균.

2. 하이드로 겔 준비

  1. 해동 및 하이드로 겔 구조의 생성에 최소 24 시간 이전에 판 줄기 세포.
  2. 이전에 출판 (8, 18)를 상세하게 설명되었다 조형 장치를 이용하여 수술 (또는 유사 기기)에 전날 패치를 준비한다.
  3. 하이드로 겔을 만들려면, 먼저 원하는 패치의 컴퓨터 지원 설계 (CAD) 모델을 생성 및 조형 형식 (STL)에 디자인을 수출하고 있습니다.
  4. dissolvin에 의해 사전 겔 용액 만들기멸균 PBS 1X에 g의 폴리 (에틸렌 글리콜) 디 메타 크릴 레이트 (PEGDMA)를 20 % w / V 수용액을 얻었다. 동시에, 광개시제 1- [4- (2- 히드 록시에 톡시) 페닐] -2- 히드 록시 -2- 메틸 -1- 프로판 -1- 온 DMSO에 용해. / 0.5 V % w 마지막에 PEGDMA 솔루션 광개시제를 추가합니다. 가교 바로 전에, 세포 밀도의 원하는 100 ㎖를 추가한다. 참고 : 세포 / ㎖ 추천 6 10 × -2.0 5 10 × 2.0 사이의 세포 밀도를.
  5. SLA 플랫폼의 중심에 접시에 프리 겔 용액을 피펫 및 이전에 업로드 STL 포맷 디자인 SLA 소프트웨어를 실행.
  6. 장치로부터 패치를 제거하고 둘 베코 변성 이글 배지 5 % 소 태아 혈청 (FBS)으로 보충 (DMEM), 100 U / ㎖ 페니실린 하이드로 O / N을 배양하고, 세포를 조절하는 100 mg의 / ㎖ 스트렙토 마이신 있도록 패치 내의 환경.

3. 동물 준비 및 구강 intubati에

  1. 자신의 케이지 동료와 함께 자신의 정리 습관과 상호 작용의 결정에 따라 동물, 건강에 있는지 확인하는 절차에 앞서 각 마우스를 평가합니다. 참고 : 여성 8-10주 오래 C57BL / 6J 마우스는이 절차에 사용 된, 그러나, 임의의 마우스 연령 또는 유형이 사용될 수있다.
  2. 마취 챔버에 동물을 배치하고 1 L / 분 O 2 지원으로 5 % 이소 플루오 란에 노출. 발가락 핀치 반사에 의한 마취의 수준을 모니터링합니다.
  3. 동물이 제대로 마취되면, 무게 삽관 스탠드에 배치합니다.
  4. 동물의 흉강으로 광원을 직접 성대 후두 표면을 철회하고 노출 집게를 사용합니다. 조심스럽게 성대 사이에 20 G의 angiocath을 안내하고 원활 기관에 삽입합니다. 카테터는 작은 동물 인공 호흡기에 연결되면 흉강의 기계적인 움직임으로 적절한 삽입을 감지합니다.
  5. 토륨 환기 설정을 조정합니다제조자의 지침에 기초하여 동물의 체중 E.
  6. 삽관 후 저체온증을 방지하기 위해 가열 패드에 앙와위에서 동물을 배치합니다. 가열 패드가 40 ℃를 초과하지 않도록하십시오. 필요한 경우, 화상의 가능성을 최소화하기 위해 동물과 난로 사이의 배리어를 배치했다.
  7. 제모 크림의 사용을 통해 수술 부위에서 머리를 제거합니다. 적절한 살균을 위해 betadine 75 % 에탄올 3 교번하여 수술 부위를 소독. 다만 수술 부위를 노출하고, 절차를 수행하는 동안 건조를 방지하기 위해 눈에 수의사 연고를 배치 드레이프를 놓습니다.

4. 수술

  1. 개흉술 따라서, 흉골의 길이를 실행 흉골의 좌측에 피부 절개를 약 1cm을, 동물의 왼쪽에 수행된다.
  2. 두 단계로부터 기본 흉곽 근육 층을 분리 집게를 사용한다. 델라을 준수동물의 pectoralis 주요 근육을 나타냅니다 운 전압 라인. 기본 외부 경사 근육에서 분리 및 내측 철회, 약간이 근육을 들어 올립니다. 그 후, 동일한 방식으로 기본 흉곽로부터 외부 경사 근육을 확보하고, 제 3 및 제 4 리브 unobscured보기를 제공하는 측 방향으로 후퇴.
  3. 세 번째와 네 번째 갈비뼈 사이의 개흉술을 수행합니다. 조심스럽게 네 번째 늑골을 들어 올려 세 번째와 네 번째 갈비뼈 사이의 흉강을 엽니 다 cauterizer를 사용합니다. 더 캐비티를 열고 심장을 노출 견인기를 놓습니다.
  4. 마음의 얇은 심낭을 파열 집게를 사용합니다.
  5. 8-0 모노 필라멘트 나일론 봉합사와 왼쪽 관상 동맥을 결찰. 직접 좌심방의 하단부 아래, 약 4mm 마음의 정점에서 봉합사를 놓습니다. 심실의 심근 및 창백 수 투어 후 좌심방의 크기가 증가하여 적절한 봉합 위치가 결정다시 묶여있다.

5. 패치 배치 및 접착제

  1. 사용할 때까지 CO 2 조건을 37 ℃에서 패치를 유지하고 5 %.
  2. 부드럽게 평면 종단 주걱을 사용하여 패치를 들어 올려 부드럽게 경색의 사이트에서, 마음의 표면에 놓습니다.
    주 : 좌심실 빠지는 것을 방지하기 위해, 패치 가볍게 주걱 또는 집게의 쌍의 팁을 사용하여 접촉을 유지하여 제 위치에 유지 될 수있다.
  3. 트롬빈에 피브리노겐의 1 비율 : 4를 혼합하여 접착제를 준비합니다. 이 제제의 시작 후 통상 1 분 이내에, 두껍게하기 시작까지 반복 피펫으로 용액을 섞는다.
  4. 용액 점도가 원하는 레벨에 도달하면, 신속하게 패치 표면에 약 10 mL로 옮긴다. 참고 : 피브린 접착제의 응고 시간이 빠르다, 접착제의 효율적인 전송을위한 기회의 작은 창을 제공한다.

6. 봉합

    6-0 모노 필라멘트 나일론 봉합사를 사용하여 모든 폐쇄 봉합을 수행합니다.
  1. 3-4 개별 중단 봉합 리브 층을 닫습니다.
  2. 늑간 층의 완전 폐쇄하기 전에, 폐쇄가 완료된 후 흉강을 철수하고 적절한 흉부 내 압력을 다시 절개로 PE-10의 캐 뉼러를 삽입합니다.
  3. 3-4 개별 중단 봉합과 가슴 근육을 닫습니다.
  4. 연속 봉합선으로 피부 층을 인감.
  5. 완전 폐쇄 후, 캐 뉼러의 단부에 1.0 mL의 주사기를 연결하고 흉강 대피 사용.
  6. 봉합 사이트를 강화하기 위해 절개 사이트에 조직 접착제를 적용합니다.

7. 후 수술 적 치료

  1. 쥐에게 프레 노르 핀 (0.05-1.0 ㎎ / ㎏) 및 피하 직전 부흥 관상 동맥 결찰 및 20 분 이상 다음과 같은 카프로 펜 (2.2 ㎎ / ㎏)의 주입을 준다. 두 약물 수술 후 6 ~ 8 시간을 관리합니다다음 통증과 고통을 제어하기까지 3 일 동안 하루에 두 번 제공합니다.
  2. 지속적으로 처음 4 시간 다음 수술을 의식하고 매 시간마다 때까지 동물을 모니터링 할 수 있습니다. 진통제의 두 번째 복용량을 관리하는 두 번째 검진에게 수술 (2-4 시간 이상)의 밤을 수행합니다.
  3. 동물이 안정 나타날 때까지, 절차에 따라 두 번째 날 이후 매일 동물을 모니터링합니다.

심장 기능 및 조직학 8. 분석

  1. MI는 다음의 손상 정도를 결정하는 절차에 따라, 마우스 사주에 echocardiographs 수행.
  2. 흡입 마취의 유도를위한 마취 챔버 내에서 4-5%의 이소 플루 란과 쥐를 마취 및 유지 보수 마취 얼굴 마스크를 통해 다음 2 % 이소 플루 란.
  3. 제모 크림 이미징 영역을 지우고 뛰는 심장의 2D M 모드 심 초음파 검사를 얻기 위해 작은 동물 초음파를 사용하여 기능 매개 변수 ASSO를 기록그것으로 ciated.
  4. 그 다음 24 시간 동안 10 %의 포르말린 용액에 동물과 장소에서 하트를 수집 이산화탄소 챔버에서 쥐를 안락사. 24 시간 후, 70 % 에탄올에 마음을 전송하고 조직 처리 될 때까지 4 ℃에서 보관하십시오.
  5. 마음을 처리하고 파라핀 블록을 포함.
  6. 정점에서 시작 아트리움에서 끝나는, 심장의 심실 영역을 통해 5mm 부분을 잘라.
  7. 얼룩은 메이슨의 트리 크롬과 헤 마톡 실린 및 표준 프로토콜을 사용하여 에오신 염색 모두 조각을 절단.

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결과

수술하는 동안, 좌측 관상 동맥의 결찰이 폐색 된 동맥의 하류 희게 표시된 의해 식별 될 수있다. 매듭을 묶는 전에 테스트로, 봉합사는 적절한 위치에 있는지 확인하기 위해 잠시 동안 강화 될 수있다. 또한, 적절히 이길 좌심방의 능력에 거의 순간적인 감소 동맥 폐색의 결과 때문에, 좌심방이 시스템 내의 혈액의 역류에 응답하여 확대된다.

M 모드 심 초음파 측정 후 경색이 근육의 재건을 나타내는 왼쪽 벽 운동의 중단을 보여 빠르면 2와 일 촬영. 데이터로 만든 성적 계산은 경색 마음 구혈률의 감소와 뇌졸중 볼륨을 보여줍니다. 하트가 조직학을 위해 수집 된 실험의 종료시, 좌심실 명확한 팽창은 좌심실의 박형화와 함께 볼 수있다벽 및 심근 세포를 (도 1)를 작동하는 대신에 반흔 조직의 침착을 나타내며 콜라겐 침착.

또한, (도 2) 조직 학적 분석에 하이드로 겔의 존재...

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토론

쥐의 심근 경색 모델에이 방법으로, 우리는 다른 쥐의 심근 경색 기술과 관련된 비 심근 지역에 피해를 최소화하는 시스템을 개발했다. 이 지역은 기관 절개술에 의한 손상, 근육 층의 절단 및 흉강을 노출 리브의 파손을 포함한다. 우리는 이러한 변화는 수술시로, 갈비뼈와 근육 층을 포함, 주요 구조물의 많은 손상을 유지하는 데 걸리는 치료에 전체 수술 결과 덕분에 개선 있다고 생각합니다.

이는 하루에 단지 8-10 전체 수술 절차의 결과로, 일부 제한되는 최대의 시간 소모 특성과,이 기술에 있다는 것을 주목해야한다. 이것을 극복하기 위해, 제 인공 호흡기 절차가 동시에 두 동물에서 수행 될 수 있도록하기 위해 사용될 수있다. 또한, 이러한 늑간 혈관 등 주요 혈관 및개흉술을 수행 할 때 내부 흉부 동맥은 피해야한다. 이들 용기 중 하나 근처에 있으면, cauterizer 인해 파열...

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공개 사항

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

감사의 글

이 작품은 미국 육군 그랜트 (W81XWH-08-1-0701)과 칼레 재단 병원에서 원정대에 의해 투자되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
하버드 모델 687 마우스 인공 호흡기하버드 장치55-0001
Inintech Biosciences LLC 건조 유리 구슬 살균기피셔 사이언티픽NC9531961
라이카 MZ6 수술 현미경라이카
소작 키트쌍둥이 자리GEM 5917
섬세한 집게 - 0.4 mm 팁 각도정밀 과학 도구11063-07
Agricola 견인기 - 3.5cm 스프레드정밀 과학 도구17005-04
스프링 가위 - 2.5mm 블레이드 스트레이트정밀 과학 도구15000-08
Castroviejo 바늘 홀더 - 잠금 텅스텐 카바이드 포함 14cm정밀 과학 도구12565-14
아이리스 가위 - 섬세한 직선 10.5cm정밀 과학 도구14060-10
8-0 모노필라멘트 봉합Ethicon8730P
6-0 실크 봉합사Ethicon639G
트롬빈시그마T7009
피브리노겐시그마F3879
Vetbond 티슈 접착제3M1469SB
사

참고문헌

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재인쇄 및 허가

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