우리는 인간 피부 생검에서 피부 상주 T 세포를 효율적으로 분리하는 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 유세포 분석 및 생체 외 배양을 위한 충분한 수의 생존 가능한 인간 피부 상주 림프구를 생성합니다.
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이 논문에서
요약
초록
인간의 피부는 중요한 장벽 기능을 가지고 있으며, 병원균에서 조직의 항상성 및 보호에 기여하는 다양한 면역 세포가 포함되어 있습니다. 피부 액세스 비교적 용이하기 때문에, 이는 주변 면역 조절 메카니즘을 연구하기위한 이상적인 플랫폼을 제공한다. 면역 상주 건강한 피부 실시 immunosurveillance 세포 있지만는 건선과 같은 염증성 피부 질환의 발달에서 중요한 역할을한다. 새로운 통찰력에도 불구하고, 다양한 염증성 피부 질환의 기초가되는 생물학에 대한 우리의 이해는 여전히 제한된다. 피부 생검 샘플로부터 분리 된 양질의 (하나의) 세포 집단이 필요하다. 지금까지 분리 절차 심각한 생존 세포의 충분한 수를 얻기의 부족에 의해 방해되어왔다. 분리 및 후속 분석 인해 수득 현재 분리 절차에 의해 야기되는 기계적 및 화학적 스트레스, 면역 세포 계통 마커의 손실에 의해 영향을받은단일 세포 현탁액. 여기서는 자동 조직 dissociator 및 콜라게나 제 처리를 사용하여 기계적 피부 분리를 조합하여 건강 관련 건선 모두 인간 피부 T 세포를 분리하는 개질 방법을 설명한다. 이 방법은 단일 세포 현탁액의 준비 시점에 CD4, CD8, Foxp3의와의 CD11c 대부분의 면역 계통 마커의 발현을 유지합니다. 성공적인 CD4 + T 세포의 분리 및 후속 표현형 및 기능 분석의 예는 도시된다.
서론
피부는 몸과 환경 사이의 기본 인터페이스로, 외부의 물리적, 화학적 및 상처, 자외선 및 미생물 등의 생물 모욕에 대한 방어의 첫 번째 라인을 제공합니다. 피부는 두 개의 주요 구획, 표피 및 진피를 포함하고, 랑게르한스 세포, 대 식세포, 수지상 세포, 및 약 200 억 메모리 T 세포를 포함하여 면역 세포의 다양한 전체 혈액량 한 거의 두 배가 존재를 포함 2. 증가하는 데이터 기관은 피부 조직의 항상성 동안 다양한 병리 적 상태 모두에서 중요한 면역 기능이 개념을 지원한다. 정상 피부에 상주 면역 세포 immunosurveillance 3을 수행하는 것으로 생각되고, 이러한 4 건선 같은 염증성 질환의 발달에 중요한 역할을하는 것으로 나타났다. 건선 병변 피부에서 CD4 +와 CD8 + 모두 T 세포가 OBS했다 침투erved하고는 CD4 및 CD8의 비율은 질병 상태 (5)에 따라 다르다는 것을 나타내었다. 그러나, 이러한 세포의 집단은 기존의 기술은 단지 소수의 세포를 분리 할 수 있기 때문에 연구하기가 어렵다.
인간 피부 T 세포의 분리를위한 현재 널리 사용되는 기술은 효소 처리로 기계적 ....
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프로토콜
참고 : 건강한 사람에서 피부 조직 검사가 과학적 사용을위한 구두 또는 서면 동의서 후 선택 과목 성형 수술을받은 개인의 복부 피부에 남은에서 얻었다. 인간의 피부의 사용은 승인 된 Radboud 대학 의료 센터, 네이 메헨, 네덜란드, 독일 에센 대학의 인간 연구를위한 의료 윤리위원회가 설정 한 규정에 따라한다.
인간의 피부에서 단일 세포 현탁액 1. 준비 (흐름 캐비닛에서 작업 멸균 이후 세포 배양 경우 필수)
- 세포 배양 배지를 준비 : 없음 혈청 RPMI 1640 + 페니실린 / 스트렙토 마이신 (ml의 최종 농도 100 단위 / 100 μg의 / ㎖, 각각) + 피루 베이트 (0.02 밀리미터)와 루타 (0.02 mM)을 추가.
- 완전 배지 준비 : 배양액 단계 1.1 + 10 % 인간 혈청 풀 (HPS)에서 제조; 4 ℃에서 저장한다. 우리 앞에 20 ° C ± 2 중간 가져와ING.
- 4mm 라운드 생검 펀치기구를 사용하여 피부 조직 검사를 구하여 최대 4 시간 동안 4 ° C ON에서 20 ° C ± 2에서 RPMI1640 전체 문화 매체에 보관합니다. 실험실에 도착하면 가능한 한 빨리 조직 검사를 처리합니다.
참고 : 피부의 이상 저장 셀 수율 및 세포 생존....
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결과
여기에 제시된 프로토콜은 단일 4mm 피부 조직 검사를 사용하는 경우 760 ± 178,000까지 615 (± SEM, 건강한 지원자의 피부를 평균) ± 2,200 사이는 인간의 피부에서 가능한 림프구 (± SEM, 건선 환자의 피부 병변을 의미) 얻을 것입니다.
CD45 + 세포의 종류는 CD4 + T 세포 (~ 45 %), CD8 + T 세포 (~ 30 %)을 포함 건강한 사람의 피부에서 유래 된 단일 세포 현탁액의 식별과의 CD11c + 수지상 세포 (~ 5 %했다 ) 몇 B 세포 (CD19 +의), NK 세포 (CD56 + CD3 반면, -), 또는 단핵구 / 대 식세포 (CD14 + 또는 CD1c +)가 관찰되었다 (도 1A). 이 방법은 인간의 피부 생검에서 C.......
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토론
여기서는 효율적으로 인간의 피부 생검으로부터 피부 상주 T 세포를 분리하는 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜의 장점은 가능한 림프구의 상대적으로 높은 수의 분리이고, 관련 표면 마커를 발현. 식별 된 셀의 서브 세트가 있었다 :하는 CD11c + 수지상 세포, CD4 + 및 CD8 + T 세포와 Foxp3의 + CD25 + 세포를 포함한다. 중요한 것은, 절연 피부 상주 T 세포의 생체 외 배양 잘 실현 후속 기능적 분석 하였다.
인간의 피부 조직의 구조적 일체 성을 유지하는 기능 외 부착 단백질의 분해 효소로 분해 기계적 결합하여 단일 세포 현탁액 내로 해리 될 수있다. 표피 및 진피의 디스 파제 기질 층 분리 이들 각 스킨 층의 세포 침투를 결정하기 위해 널리 사용되는 방법이지만, 우리는 디스 파제 처리 t 주도 눈치OA CD25 및 CD27의 세포 표면 발현.......
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공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
건선 환자의 피부 조직 검사는 친절 박사 안드레아스 Koerber 과학적인 사용을위한 구두 또는 서면 동의서 후 (에센, 독일의 대학 피부과 부서)에 의해 제공되었다.
XH도 NSFC 61263039과 NSFC 11101321에 의해 지원됩니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 일회용 생검 펀치 | 카이 유럽 | BP-40F | 4mm |
| 일회용 멸균 메스 | Dalhausen | 1100000510 | |
| gentleMACS C 튜브 | Miltenyi Biotech | 130-093-237 | 파란 모자, 해리 튜브로 사용됩니다. |
| gentleMACS 해리기 | Miltenyi Biotech | 130-093-235 | 자동 조직 해리기. 피부 생검의 해리를 위해 "프로그램 spleen_01"을 사용합니다. |
| 세포 여과기 | BD | 352350 | 70 &마이크로; m 나일론 |
| 96-웰 U-바닥 플레이트 | Greiner Bio-One | 650180 | |
| RPMI 1640 | Life Technologies | 22409-015 | |
| 나트륨 피루베이트 | Life Technologies | 11360-039 | |
| GlutaMAX | Life Technologies | 35050-061 | |
| 페니실린/스트렙토마이신 | Life Technologies | 15140-122 | |
| 인간 세포 | 사내에서 준비 | ||
| 콜라겐분해효소 I | Sigma-Aldrich | C2674 | Type 1-A, |
| DNase I | Calbiochem | 260913 | |
| PBS | B Braun | 3623140 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A4503-500G | |
| 고정성 생존도 염료(FVD) APC-eFluo780 | eBioscience | 에 적합한 통합 혈청(HPS)65-0865-18 | 세포 고정 전에 죽은 세포를 염색; 1:1,000 |
| 고정/투과화 농축액 | eBioscience | 00-5123-43 | |
| 고정/투과화 희석제 | eBioscience | 00-5223-56 | |
| 투과화 완충액 (10x) | eBioscience | 00-8333-56 | |
| BV421 마우스 anti-human CD45 | BD | 563879 | 클론: 하이30; 희석 인자 1:50 |
| FITC 마우스 anti-human CD14 | Dako | T0844 | 클론: TUK4; 희석 인자 1:50 |
| PE Mouse anti-human CD56 | Dako | R7127 | 클론: MOC-1; 희석 인자 1:50 |
| ECD Mouse anti-human CD3 | Beckman - Coulter | A07748 | 클론: UCHT1; 표면 염색을 위한 희석 인자 1:50; 세포 내 염색을 위한 희석 인자 1:25. |
| PC5.5 마우스 안티-휴먼 CD4 | Beckman - Coulter | B16491 | 클론: 13B8.2; 희석 인자 1:200 |
| PeCy7 마우스 안티-휴먼 CD11c | Beckman - Coulter | A80249 | 클론: BU15; 희석 인자 1:50 |
| APC 마우스 안티-휴먼 CD1c | Miltenyi Biotech | 130-090-903 | 클론: AD5-8E7; 희석 인자 1:10 |
| APC-AlexFluo700 마우스 안티-휴먼 CD8 | Beckman - 쿨터 | A66332 | 복제: B9.11; 희석 계수 1:400 |
| APC-AlexFluo750 마우스 반인간 CD19 | Beckman - Coulter | A94681 | 복제품: J3-119; 희석 계수 1:50 |
| PeCy7 마우스 반인간 CD25 | eBioscience | AD5-8E7 | 복제품: BC96; 희석 계수 1:50 |
| PE 쥐 항-인간 CLA | Miltenyi Biotech | 130-091-635 | 클론: HECA-452; 희석 인자 1: |
| eFluo450 쥐 항-인간 Foxp3 | eBIoscience | 48-4776-42 | 클론: PCH101; 세포 내 염색; 희석 인자 1:50 |
| AlexFluo488 마우스 항인간 IL-17A | eBioscience | 53-7179-42 | 클론: eBio64DEC17; 세포 내 염색; 희석 인자 1:50 |
| PeCy7 마우스 항인간 IFNg | eBioscience | 25-7319-41 | 클론: 4S. 나3; 세포 내 염색; Dilution Factor 1:400 |
| Flow-Count Fluorospheres | Beckman - Coulter | 7547053 | 카운팅 비드, 유세포 분석용 |
참고문헌
- Clark, R. A., et al. The vast majority of CLA+ T cells are resident in normal skin. J Immunol. 176, 4431-4439 (2006).
- Zaba, L. C., Fuentes-Duculan, J., Steinman, R. M., Krueger, J. G., Lowes, M. A. Normal human dermis contains ....
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