방법 논문

설계, 치료, 세포 도금 및 기능적으로 간 연결 회로의 구성, 모듈 형 신경 네트워크의 배양 표면

DOI:

10.3791/52572

⸱

2015년 4월 15일

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neurobiology, George S. Wise Faculty of Life Sciences, Tel-Aviv University, 2Department of Neuroscience and Brain Technologies, Istituto Italiano di Tecnologia, 3School of Electrical Engineering, Tel-Aviv University, 4School of Physics and Astronomy, Tel-Aviv University, 5Department of Informatics, Bioengineering, Robotics and System Engineering, University of Genova

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

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이 원고는 공간적으로 제한, 기능적으로 상호 연결된 신경 회로로 구성된 체외 모듈 형 네트워크에서 성장하는 프로토콜을 설명합니다. 마스크는 폴리머 기판 위에 배양 세포 접착을 촉진하는 단백질 패턴 층을 사용한다. 도금 뉴런 코팅 분야 자발적인 연결을 설정 및 전기 생리 활성을 나타내는에서 성장.

초록

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뇌는 조정 활성화 및 신경 어셈블리의 동적 통신을 통해 작동합니다. 가장 큰 의문은 가장 다양한 뇌 기능의 기초가 동적 모티프의 광대 한 레퍼토리는, 뇌 회로의 고정 위상 및 모듈 형 조직에서 나올 수있는 방법이다. 고유 실험 어려움을 제시 신경 회로의 생체 내 연구에 비해 체외 준비가 조작하고 실험 신경 시스템의 구조적, 역학적, 화학적 특성을 조사하기 위해 훨씬 더 큰 가능성을 제공합니다. 이 작품은 공간적으로 별개의, 기능적으로 상호 연결된 신경 어셈블리로 구성 모듈 형 네트워크의 성장 수있는 시험 관내 실험 방법을 설명합니다. 프로토콜 복잡도의 위상 다른 레벨에서 신경 네트워크의 2 차원 구조를 제어한다.

원하는 네트워크 패턴이 될 수 있습니다일반 커버 슬립 기판 내장 된 마이크로 전극 배열에 모두 달성했다. 미세 가공 된 구조물은 실리콘 웨이퍼 상에 양각 및 원하는 네트워크 아키텍처의 부정적인 특징을 통합 생체 적합성 고분자 스텐실을 만드는 데 사용된다. 스텐실은 세포 접착을 촉진하는 분자 층으로 표면 코팅 과정 동안 배양 기판 상에 배치된다. 스텐실 제거한 후, 뉴런 도금 이들은 자발적 코팅 분야로 재. 구획 간 거리가 감소함으로써, 격리 또는 상호 연결된 하나의 연결 회로를 얻을 수있다. 세포 생존을 촉진하기 위해, 세포는 배양 접시의 외주에 위치하고지지 신경 네트워크와 공 배양된다. 기판 매립 마이크로 전극 배열 및 칼슘 이미징을 사용하여 각각 얻어진 모듈러 네트워크 활동의 전기 생리 광학 녹음 제시된다. 각 모듈은 spont을 표시하는 동안aneous 글로벌 동기화가 모듈 간 동기화의 발생 회로들 사이의 연결 밀도에 의해 조절된다.

서론

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실험적이고 이론적 인 증거는 뇌 일시적 서로 다른 기본 성형 및 뇌의 상태와 상호 작용하는 동적 기능 유닛으로 간주 될 수있는 셀 어셈블리 1-5의 배위 활성화를 통해 동작 할 가능성을 지원한다. 기능 모듈 방식에 의존하고 또한 뇌 회로의 구조적 -6,7- 모듈러 조직과 관련된다. 어떻게 기능과 뇌 회로의 구조가 서로 서로를 형성하는 것은 여전히​​ 신경 과학의 주요 열려있는 질문 중 하나입니다. 이 질문에 대한 깊은 이해를 제공하기 위해, 그것이 해결하는 것이 가능하다, 여기서 적어도 부분적으로, 이러한 문제를 최적 실험 프레임 워크를 파악하는 것이 중요하다. 생체 내 실험에서 신경 네트워크의 시공간적 역학의 조작을 제어하기 때문에 체외 신경 네트워크 모델의 개발이 용이 ACC 인해 상당한 관심의 대상이며, 도전essibility, 모니터링, 조작 및 8,9 모델링. 최근, 진보 된 기판의 패터닝 방법에 의해 지원되는 기술에 대한 시험 관내 소정 모듈러 구조 (3)의 범위를 개발하기 위해 부과 된 토폴로지 (10)와 네트워크의 기능적 특성을 연구하는 신경 네트워크를 유도 할 수있다. 특히, 방법은 최근 4,11 물리적 제약을 부과하여 네트워크를 구성하는 데 사용 하였다. 실제로, 신경 네트워크의 구조 및 기능 사이의 관계를 연구하는 신경 세포의 상호 작용을 어셈블리 단순화하지만 그럴듯한 표현을 제공하기 위해, 시험 관내 시스템은 상호 접속 된 신경 하위 집단을 제공한다. 널리 연구 2D 균질의 연결을 문화는 회로의 자기 조직 응급 배선에 어떤 공간 제약을 부과하지 않습니다. 따라서 가능한 접근 방법은 말다툼에서 다른 신경 세포 인구의 위치를​​ 인위적으로 상호 연결된 셀 어셈블리입니다 모양ially 별개의 영역. 이 지역들 사이의 거리가 간 어셈블리 연결을 방지하지 않습니다. 네트워크 복잡성 상당한 오버 제어를 유지하면서 이러한 접근법은 동기화 모델 6,7,12의 풍부한 레퍼토리를 제공하는 것으로 나타났다.

모듈의 연결 조립체의 재현성 배양을 용이하게하기 위해, 프로토콜은 제시되고 설명된다 축삭 및 수상 돌기로 연결된 뉴런 네트워크 클러스터로의 자기 조직화를 조립한다. 의 연결을 문화의 물리적 제한에 대한 고분자 구조는 polydimtheylsiloxane (PDMS)에서 작성되었습니다. PDMS는 널리 가스 (13)에 생체 적합성, 투명성과 투과성 때문에 생물 의학 응용 프로그램에 사용되는 엘라스토머이다. PDMS 스핀 코팅 잭맨 등 알에서 전술 한 바와 같이 "마스터"에 액체 PDMS를. (16) T에 의해 2075 14,15 구조를 준비하고 미세 가공 SU8에서 제외됩니다그는 다른 크기의 간 연결 모듈로 구성되어 신경 네트워크를 패턴 화 달성 그들은 모두를 성공적으로 된 커버와 마이크로 전극 배열 (다자간) 17 ~ 20에서 얻어졌다. 모듈들 사이의 연결 밀도는 모듈들 사이의 일시적인 동기 상태로 균일 문화 전형적인 완전히 동기화 된 네트워크에서, 네트워크 동기화의 기능을 변경할 수있다.

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프로토콜

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절차는 관리 및 실험 동물의 사용을 위해 NIH 기준에 따라 수행하고, 텔 아비브 대학 동물 관리 및 사용위원회 (허가 번호 - L-14-019)에 의해 승인되었다.

인스 트루먼 트와 PDMS 1. 준비

  1. 웨이퍼 준비 (재료의 표를, 또는 미세 실험실에서 웨이퍼 주문), 메스와 핀셋 - 살균이 필요되지 않습니다.
  2. 다음의 조건에 따라 폴리 D 라이신 (PDL) 용액을 제조 : 4 ㎎ / 0.1 M 보레이트 완충액 ㎖, pH가 8 및 -20 ℃에서.
  3. 다음 절차에 따라 PDMS 스텐실을 준비합니다 :
    1. 베이스 10의 비율로 경화제를 함께 혼합함으로써 폴리 디메틸 실록산 (PDMS, 실리콘 엘라스토머)을 준비 : 1, 그 다음 약 5 분 동안이 물질을 교반한다.
    2. 15 분 동안 두 번 진공 챔버의 각 시간을두고 확인 거품이 사라 졌어요.
    3. 언제가스의 사용을 허용하도록 개방 질소 노브를 스피너에 실리콘 웨이퍼 (도 1a)를 배치하고, 이동하는 것을 방지하기 위해 진공을 사용 PDMS 스핀 코터를 준비 준비.
    4. 웨이퍼 위에 PDMS를 붓고 1,000 rpm에서 1 분간 스피너를 활성화 (약 100 μm의 높이를 만듭니다).
    5. 30 분 동안 100 ℃에서 핫 플레이트 상에 웨이퍼를 배치했다.
    6. PDMS이 강화되면, 파스퇴르 피펫을 사용하여, PDMS와 스텐실의 경계를 설명합니다. 30 분 동안 100 ℃에서 핫 플레이트 상에 웨이퍼를 배치했다.
    7. PDMS 경계가 강화되면, 경계에 따라 스텐실을 잘라 웨이퍼에서 실리콘 스텐실을 벗​​겨 메스를 사용 (하나의 패턴을 포함 제곱 PDMS).

2. 페트리 접시 및 커버 슬립 준비

  1. 다음 순서에 따라 23mm 정사각형 유리 커버 슬립을 준비하고 청소 :
    1. 증류수, 70 % 에탄올, 아세톤으로 세척 하였다.
    2. 질소 이소프로판올과 빠른 건조와 세척 할 것.
  2. 커버 슬립에 패턴 PDMS 스텐실을 배치하고 부드럽게 그들이 단단히 유리 표면에 부착되어 있는지 확인을 누릅니다. 15 분 동안 진공 챔버에 배치합니다.
  3. 스텐실에 PDL 1 ㎖를 삭제합니다. 두 번 20 분마다의 진공 챔버에 커버 슬립을 삽입하고, 건조 PDL O / N 두십시오.
  4. 지원 셀 네트워크를 만들 수 페트리 접시를 준비합니다 :
    1. RT에서 2 시간 동안 PDL 1 ㎖와 접시 (3.5 cm)의 표면을 커버. 피펫을 사용하여 PDL 드롭을 제거합니다.
    2. 증류수로 세척하고 건조 둡니다. 커버 슬립의 각 모서리에 실리콘 그리스의 아주 작은 방울을 놓습니다.
  5. 첨부 파일을 확인하기 위해 조심스럽게 페트리 접시 (즉, PDMS이 위를 향하도록한다)과 언론의 중심에 커버 슬립을 놓습니다.
  6. 조심스럽게 핀셋을 사용하여 커버 슬립에서 PDMS를 제거합니다. 멸균, 7 분 동안 UV 조명에 노출.
르 "> 3. 다중 전극 어레이 (MEA) 제조

  1. 이 순서 (자료 표)에서 청소 MEA :
    1. 농축 효소 세제 탭 및 초음파 처리에서 물을 3 회 반복한다.
    2. 증류수 3 회에 초음파 처리.
    3. 30 분 동안 UV 증류 3 회 (후드, 1000 μL 팁) 물과 장소 씻으십시오.
  2. 네트워크 준비 지원 :
    1. 설계 지원 네트워크 금형을 준비합니다.
      1. 12 웰 플레이트 (22mm 직경)에 PDMS를 붓고.
      2. PDMS 몰드 꺼내서 메스를 이용하여 경화 될 때, 링 모양을 만들 때 중앙에 구멍을 잘랐다.
      3. MEA (그림 2A)의 중심에 설계 지원 네트워크 금형을 넣고 실온에서 2 시간 동안 PDL과 표면의 나머지 부분을 커버한다.
    2. 피펫을 사용하여 PDL을 제거하고 증류수로 세척한다.
    3. 곰팡이를 제거하고 (그림 2A) 건조 둡니다.
  3. 다음과 같은 방법으로 MEA에 스텐실을 맞 춥니 다 :
    1. 지정된 마이크로 매니퓰레이터에 스텐실을 놓습니다. 정확하게 전극 패턴 구조를 맞추고 MEA 표면 (그림 2B)에 배치 될 때까지 스텐실을 낮추기 위해 거꾸로 현미경을 사용합니다.
      참고 : 잘 청소 MEA와 연락이 PDMS와 MEA 자체 사이의 경쟁 접착력을 제공합니다.
    2. 미세 조작기를 올리고, 필요한 경우가 MEA로부터 분리 방지 위에 PDMS 압력 소량 적용 핀셋을 사용한다.
    3. 조심스럽게 MEA 표면에 스텐실을 누르면 단단히 부착, 잘 정렬되어 있는지 확인하기 위해 현미경을 사용합니다. (도 2C-D).
  4. 15 분 동안 진공 챔버에서 MEA를 배치; 스텐실에 PDL의 1 ml의 드롭을 넣어.
  5. 20 분 각각 진공 챔버로 2 회를​​ 삽입합니다. 인큐베이터에서 O / N 건조 PDL을 남겨주세요.
  6. 도금하기 전에, 다자간 환경에서 PDMS에게 스텐실을 제거하고 w 멸균 사용하여 세척ater에. 7 분 동안 UV 조명 아래에 배치합니다.

4. 해​​부와 문화

  1. 헤르 조그 외. 2011 21에 기술 된 바와 같이 문화를 준비합니다.

5. 도금

  1. 혈구 (결과에서 논의 된 회로의 크기에 따라 최적의 농도)을 사용하여, 도금에 필요한 세포의 수를 계산한다.
    1. 반드시 계산 챔버 (혈구)를 확인 깨끗하고 그것에 커버 슬립 (청소 사용 알코올)을 배치합니다.
    2. 매체 (1:20 희석) 190 μL의 도금에서 세포 현탁액 10 μL 희석.
    3. 로드 (10) 카운팅 챔버의 에지 상으로 희석하고 셀 μL 천천히 자체를 채울 수 있도록 챔버 세포를 피펫.
    4. 거꾸로 현미경을 사용하여 혈구 그리드를 시각화. 다이렉트 카운팅함으로써 챔버 내의 세포 수를 (건강한 세포가 둥글게한다)을 결정. 큰 광장 witho 내에서 세포를 계산가장자리를 횡단하는 사람들을 UT.
    5. 세포의 농도를 계산한다 :
      세포의 총 수 / 1000 μL = 희석 배수 × × 104 (혈구의 영역) 계산 총 세포.
      참고 : 예를 들어, 희석 배수가 20이었고, 계산은 전체 셀 (100)과 같다 :
      100 × 20 × 104 = 0.1 × 10 7 세포 / μL 1000 또는 1 × 10 1백분의 6 μL. 0.75 × 106 세포 판형하기 위해, 세포 중 75 μl를 취할.
  2. 단일 MEA 또는 페트리 접시 당 도금에 필요한 세포의 수를 고려해야 응집을 방지하기 위해 세포를 재현 탁하고, patternate 영역의 상단에, 중앙에 그들을 플레이트 (필요한 경우에는 배지에 세포를 희석 할 수있다) . MEA를 들어, 중간에 100 μL 드롭을 배치합니다. 커버 슬립의 경우, 중간에 1000 μL 드롭을 배치합니다.
  3. 40 분 동안 37 ° C에서 도금 세포를 품어. 1까지, 도금 세포에 도금 매체 추가MEA mL 당 및 커버 슬립 당 ​​2 ml의.
  4. 0.5 펜 연쇄상 구균, 2 % B-27와 0.75 % 루타가 풍부한 신선한 성장 배지로 희석, 4 일마다 37 ° C로 유지하고.
  5. 또는 폐해를 방지하기 위해 다른 항 유사 분열 제 6/7 DIV에서, 섬 사이의 연결을 본 후, 10 ㎕의 매체에 희석 / ㎖ FUDR은 (12.5 ml의 MEM (최소 필수 중간 이글) 25 mg을 우리 딘 + 62.5 mg을 유리 딘) 자라.

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결과

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약 100 ㎛의 두께를 갖는 특징 실리콘 웨이퍼 상 SU8-2075 PDMS 몰드를 형성하기 위해 사용되었다. 패턴은 변의 길이와의 거리가 200 내지 700 ㎛의 (도 1b)를 가변하여, 여러 사이즈의 사각형으로 구성되었다. 사각형의 크기와 20 배 목표의 (측면 길이 <400 μm의와 섬에 대한) (측면 길이 <800 μm의와 섬에 대한) 10 배의 시야에 맞게 선택되었다. 세 개의 매개 변수, 즉 회로 사이의 도금 셀 밀도, 거리, 회로 '크기는 단층 또는 클러스터를 얻는 회로뿐만 아니라 그들의 부과 연결을 형성하기위한 결정이다. 그러나, 이들 파라미터들은 자발적 회로 '크기 증가 접속을 확립 확률, 두 회로 사이의 고정 된 거리 주어진 보낸 독립적이지. ~ 300의 작은 신경 모듈,이 작품에서 논의 된 예에서 X 300 μm의, 연결거리가 ~ 300보다 크지 때 설립되었다 - 400 μm의, 동안 많은 신경 모듈 ~ 거리가 작은 ~ 700 μm의 때 700 X 700 μm의이 연...

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토론

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기능적으로 상호 연결된 회로로 구성된 시험 관내에서 2D 모듈러 신경 네트워크를 성장 프로토콜을 설명한다. 절차는 세포 접착층을 패턴에 기초한다. 패터닝 PDMS 스텐실 원하는 네트워크 아키텍처의 음 재생 기능에 의해 달성된다. PDMS 스텐실 셀룰러 접착제 층이 증착되는 영역을 정의한다. 세포가 도금되면, 그들은 자발적으로 코팅 된 섬에 조립하고 활성 간 연결 회로에 자기 조직화. MEA의 칼슘 이미징을 사용하여 기록 기능 모듈 형 네트워크의 녹음이 제시되었다.

제시된 프로토콜은 정식으로 처음 다음 절차에 비해 수정되었습니다. 첫째, PDMS 스텐실 '정렬에 문제가 해결되어야했다. 정렬 (스텐실 표면을 만진 후,이 위치를 변경하지 않는 것이 좋습니다) 첫 번째 시도에서 달성해야하기 때문에,이 문제는 해결되었습니다수동 절차를 포기하고 MEA 기록 영역에서 정확한 공판 증착 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 수행하는 새로운 방법에 대한 옵트. 해결되어야하는...

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공개 사항

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저자가 공개하는 게 없다.

감사의 글

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이 작품은 유럽 프로젝트 BRIANBOW (FP7- 젊은 탐험가에 의해 지원되었다, 저자는 원고에 대한 유용한 의견을 박사 코포 Tessadori에게 감사를 표하고, 비디오에 사용 된 그래픽을 생산하는 그녀의 도움 실비아 Chiappalone 것입니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
PDMS, Sylgard 184Dow Corning
Nalgene 진공 챔버Thermo5305-0609
Poly-D-lysine PDLSigmaP7886
실리콘 그리스 - SILICAID 1010aidchim LtdH3375
스핀 코터Laurell - Technologies CorporationWS-650-23
12웰 배양 플레이트시그마CLS3336
5-플루오로-2'-데옥시우리딘시그마F0503
우리딘시그마U3003
MEA1060-Inv-BC다중 채널 시스템
TC02다중 채널 시스템
펜 연쇄상 구균생물학 산업 Beit Haemek03-033-1C
B-27Gibco17504044
glutaMAXGibco35050-038
MEM 최소 필수 매체 독수리생물학 산업 Beit Haemek01-025-1B
마이크로 전극 어레이 4Q다중 채널 시스템60-4QMEA1000iR-Ti-pr청소 설명서: http:// www.multichannelsystems.com
실리콘 웨이퍼microchemSU8-2075준비 프로토콜: http://www.microchem.com

참고문헌

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