방법 논문

설계, 치료, 세포 도금 및 기능적으로 간 연결 회로의 구성, 모듈 형 신경 네트워크의 배양 표면

DOI:

10.3791/52572

⸱

2015년 4월 15일

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neurobiology, George S. Wise Faculty of Life Sciences, Tel-Aviv University, 2Department of Neuroscience and Brain Technologies, Istituto Italiano di Tecnologia, 3School of Electrical Engineering, Tel-Aviv University, 4School of Physics and Astronomy, Tel-Aviv University, 5Department of Informatics, Bioengineering, Robotics and System Engineering, University of Genova

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 원고는 공간적으로 제한, 기능적으로 상호 연결된 신경 회로로 구성된 체외 모듈 형 네트워크에서 성장하는 프로토콜을 설명합니다. 마스크는 폴리머 기판 위에 배양 세포 접착을 촉진하는 단백질 패턴 층을 사용한다. 도금 뉴런 코팅 분야 자발적인 연결을 설정 및 전기 생리 활성을 나타내는에서 성장.

초록

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

뇌는 조정 활성화 및 신경 어셈블리의 동적 통신을 통해 작동합니다. 가장 큰 의문은 가장 다양한 뇌 기능의 기초가 동적 모티프의 광대 한 레퍼토리는, 뇌 회로의 고정 위상 및 모듈 형 조직에서 나올 수있는 방법이다. 고유 실험 어려움을 제시 신경 회로의 생체 내 연구에 비해 체외 준비가 조작하고 실험 신경 시스템의 구조적, 역학적, 화학적 특성을 조사하기 위해 훨씬 더 큰 가능성을 제공합니다. 이 작품은 공간적으로 별개의, 기능적으로 상호 연결된 신경 어셈블리로 구성 모듈 형 네트워크의 성장 수있는 시험 관내 실험 방법을 설명합니다. 프로토콜 복잡도의 위상 다른 레벨에서 신경 네트워크의 2 차원 구조를 제어한다.

원하는 네트워크 패턴이 될 수 있습니다일반 커버 슬립 기판 내장 된 마이크로 전극 배열에 모두 달성했다. 미세 가공 된 구조물은 실리콘 웨이퍼 상에 양각 및 원하는 네트워크 아키텍처의 부정적인 특징을 통합 생체 적합성 고분자 스텐실을 만드는 데 사용된다. 스텐실은 세포 접착을 촉진하는 분자 층으로 표면 코팅 과정 동안 배양 기판 상에 배치된다. 스텐실 제거한 후, 뉴런 도금 이들은 자발적 코팅 분야로 재. 구획 간 거리가 감소함으로써, 격리 또는 상호 연결된 하나의 연결 회로를 얻을 수있다. 세포 생존을 촉진하기 위해, 세포는 배양 접시의 외주에 위치하고지지 신경 네트워크와 공 배양된다. 기판 매립 마이크로 전극 배열 및 칼슘 이미징을 사용하여 각각 얻어진 모듈러 네트워크 활동의 전기 생리 광학 녹음 제시된다. 각 모듈은 spont을 표시하는 동안aneous 글로벌 동기화가 모듈 간 동기화의 발생 회로들 사이의 연결 밀도에 의해 조절된다.

서론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

실험적이고 이론적 인 증거는 뇌 일시적 서로 다른 기본 성형 및 뇌의 상태와 상호 작용하는 동적 기능 유닛으로 간주 될 수있는 셀 어셈블리 1-5의 배위 활성화를 통해 동작 할 가능성을 지원한다. 기능 모듈 방식에 의존하고 또한 뇌 회로의 구조적 -6,7- 모듈러 조직과 관련된다. 어떻게 기능과 뇌 회로의 구조가 서로 서로를 형성하는 것은 여전히​​ 신경 과학의 주요 열려있는 질문 중 하나입니다. 이 질문에 대한 깊은 이해를 제공하기 위해, 그것이 해결하는 것이 가능하다, 여기서 적어도 부분적으로, 이러한 문제를 최적 실험 프레임 워크를 파악하는 것이 중요하다. 생체 내 실험에서 신경 네트워크의 시공간적 역학의 조작을 제어하기 때문에 체외 신경 네트워크 모델의 개발이 용이 ACC 인해 상당한 관심의 대상이며, 도전essibility, 모니터링, 조작 및 8,9 모델링. 최근, 진보 된 기판의 패터닝 방법에 의해 지원되는 기술에 대한 시험 관내 소정 모듈러 구조 (3)의 범위를 개발하기 위해 부과 된 토폴로지 (10)와 네트워크의 기능적 특성을 연구하는 신경 네트워크를 유도 할 수있다. 특히, 방법은 최근 4,11

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

프로토콜

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

절차는 관리 및 실험 동물의 사용을 위해 NIH 기준에 따라 수행하고, 텔 아비브 대학 동물 관리 및 사용위원회 (허가 번호 - L-14-019)에 의해 승인되었다.

인스 트루먼 트와 PDMS 1. 준비

  1. 웨이퍼 준비 (재료의 표를, 또는 미세 실험실에서 웨이퍼 주문), 메스와 핀셋 - 살균이 필요되지 않습니다.
  2. 다음의 조건에 따라 폴리 D 라이신 (PDL) 용액을 제조 : 4 ㎎ / 0.1 M 보레이트 완충액 ㎖, pH가 8 및 -20 ℃에서.
  3. 다음 절차에 따라 PDMS 스텐실을 준비합니다 :
    1. 베이스 10의 비율로 경화제를 함께 혼합함으로써 폴리 디메틸 실록산 (PDMS, 실리콘 엘라스토머)을 준비 : 1, 그 다음 약 5 분 동안이 물질을 교반한다.
    2. 15 분 동안 두 번 진공 챔버의 각 시간을두고 확인 거품이 사라 졌어요.
    3. 언제가스의 사용을 허용하도록 개방 질소 노브를 스피너에 실리콘 웨이퍼 (도 1a)를 배치하고, 이동하는 것을 방지하기 위해 진공을 사용 PDMS 스핀 코터를 준비 준비.
    4. 웨이퍼 위에 PDMS를 붓고 1,000 rpm에서 1 분간 스피너....

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

결과

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

약 100 ㎛의 두께를 갖는 특징 실리콘 웨이퍼 상 SU8-2075 PDMS 몰드를 형성하기 위해 사용되었다. 패턴은 변의 길이와의 거리가 200 내지 700 ㎛의 (도 1b)를 가변하여, 여러 사이즈의 사각형으로 구성되었다. 사각형의 크기와 20 배 목표의 (측면 길이 <400 μm의와 섬에 대한) (측면 길이 <800 μm의와 섬에 대한) 10 배의 시야에 맞게 선택되었다. 세 개의 매개 변수, 즉 회로 사이의 도금 셀 밀도, 거리, 회로 '크기는 단층 또는 클러스터를 얻는 회로뿐만 아니라 그들의 부과 연결을 형성하기위한 결정이다. 그러나, 이들 파라미터들은 자발적 회로 '크기 증가 접속을 확립 확률, 두 회로 사이의 고정 된 거리 주어진 보낸 독립적이지. ~ 300의 작은 신경 모듈,이 작품에서 논의 된 예에서 X 300 μm의, 연결거리가 ~ 300보다 크지 때 설립되었다 - 400 μm의, 동안 많은 신경 모듈 ~ 거리가 작은 ~ 700 μm의 때 700 X 700 μm의이 연.......

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

토론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

기능적으로 상호 연결된 회로로 구성된 시험 관내에서 2D 모듈러 신경 네트워크를 성장 프로토콜을 설명한다. 절차는 세포 접착층을 패턴에 기초한다. 패터닝 PDMS 스텐실 원하는 네트워크 아키텍처의 음 재생 기능에 의해 달성된다. PDMS 스텐실 셀룰러 접착제 층이 증착되는 영역을 정의한다. 세포가 도금되면, 그들은 자발적으로 코팅 된 섬에 조립하고 활성 간 연결 회로에 자기 조직화. MEA의 칼슘 이미징을 사용하여 기록 기능 모듈 형 네트워크의 녹음이 제시되었다.

제시된 프로토콜은 정식으로 처음 다음 절차에 비해 수정되었습니다. 첫째, PDMS 스텐실 '정렬에 문제가 해결되어야했다. 정렬 (스텐실 표면을 만진 후,이 위치를 변경하지 않는 것이 좋습니다) 첫 번째 시도에서 달성해야하기 때문에,이 문제는 해결되었습니다수동 절차를 포기하고 MEA 기록 영역에서 정확한 공판 증착 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 수행하는 새로운 방법에 대한 옵트. 해결되어야하는.......

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자가 공개하는 게 없다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 작품은 유럽 프로젝트 BRIANBOW (FP7- 젊은 탐험가에 의해 지원되었다, 저자는 원고에 대한 유용한 의견을 박사 코포 Tessadori에게 감사를 표하고, 비디오에 사용 된 그래픽을 생산하는 그녀의 도움 실비아 Chiappalone 것입니다.

....

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
PDMS, Sylgard 184Dow Corning
Nalgene 진공 챔버Thermo5305-0609
Poly-D-lysine PDLSigmaP7886
실리콘 그리스 - SILICAID 1010aidchim LtdH3375
스핀 코터Laurell - Technologies CorporationWS-650-23
12웰 배양 플레이트시그마CLS3336
5-플루오로-2'-데옥시우리딘시그마F0503
우리딘시그마U3003
MEA1060-Inv-BC다중 채널 시스템
TC02다중 채널 시스템
펜 연쇄상 구균생물학 산업 Beit Haemek03-033-1C
B-27Gibco17504044
glutaMAXGibco35050-038
MEM 최소 필수 매체 독수리생물학 산업 Beit Haemek01-025-1B
마이크로 전극 어레이 4Q다중 채널 시스템60-4QMEA1000iR-Ti-pr청소 설명서: http:// www.multichannelsystems.com
실리콘 웨이퍼microchemSU8-2075준비 프로토콜: http://www.microchem.com

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Buzsaki, G. Neural syntax: cell assemblies, synapsembles, and readers. Neuron. 68, 362-385 (2010).
  2. Meunier, D., Lambiotte, R., Bullmore, E. T. Modular and hierarchically modular organization of brain networks. Frontiers in Neuroscience. 4, 200(2010).

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재인쇄 및 허가

이 JoVE 논문의 텍스트 또는 그림 재사용 허가 요청

허가 요청

태그

PDMS

관련 논문