3 차원 전체 두께 피부의 세대 동등한 및 자동화 부상

요약

이 프로토콜의 목표는 자연 피부와 유사한 3차원 전체 두께 피부를 구축하는 것입니다. 특별히 제작된 자동 상처 제거 장치를 사용하면 무균 상태를 유지하면서 정확하고 재현 가능한 상처를 생성할 수 있습니다.

초록

체외 모델은 피부 상처 치유 과정을 연구하기 위한 비용 효율적이고 윤리적인 대안입니다. 더욱이, 이러한 모델은 인간 세포를 사용함으로써 동물 모델보다 인간의 상처 상황을 더 잘 반영합니다. 2차원 모델은 세포 이동 및 증식과 같은 과정을 조사하는 데 널리 사용되지만, 상처 치유에 대한 더 깊은 지식을 얻기 위해서는 더 복잡한 모델이 필요합니다. 적절한 모델 시스템 외에도 정밀하고 재현 가능한 상처를 생성하는 것은 서로 다른 테스트 실행 간에 비교 가능한 결과를 보장하는 데 매우 중요합니다. 본 연구에서는 상처 치유에 대한 연구와 동등한 3차원 전체 두께의 피부의 생성을 보여줍니다. 모델의 피부 부분은 쥐꼬리 콜라겐 I형 하이드로겔에 내장된 인간 피부 섬유아세포로 구성되어 있습니다. 인간 표피 각질 세포를 접종하고 공기-액체 계면에서 배양 한 후, 모델 위에 다층 표피가 형성됩니다. 상처 치유 과정을 연구하기 위해 무균 환경에서 표준화된 상처를 생성하는 자동 상처 제거 장치를 추가로 개발했습니다.

서론

피부는 신체에서 가장 큰 기관이다. 그것은 외부 환경과 내부 장기 사이에 장벽을 만듭니다. 또한, 피부는 유체 손실, 환경 적 영향, 상처 감염으로부터 몸을 보호하고, ^체온을 조절 ^한 것을 돕는다. 인해 노출 된 위치에, 피부는 종종, 기계적, 열적 또는 화학적 외상에 의해 영향을 받는다. 피부 자체 수리의 일반적으로 사용하는 것은 아니지만, 감염, 산소, 정맥 자족 여러 지역 요인 손상된 상처 치유 될 수 있습니다. 상처 치유는 비만, 알코올 중독, 흡연, 약물, 영양, 당뇨병과 같은 질환 등의 전신적인 요인에 의해 방해 할 수있다. ⁽²⁾

(I) 염증 상, (II) 및 증식 (III) 리모델링 단계 : 상처 치유 과정은 3 단계로 나눌 수있다. 피부에 손상되면, 복잡한 신호 캐스케이드 상처의 폐쇄로 이어지는 시작합니다. ³손상 후 상처 출혈과 혈병이 형성된다. 섬유 아 세포는 혈액 응고로 이동하고 이후 년 동안 리모델링되어 새로운 조직으로 대체.

생물학적 과정의 기본 피부 복구 전류 이해는 제한된다. 작은 동물과 돼지 모델은 상처 치유를 연구하는 데 사용되었다. 그러나, 이러한 결과는 직접 종 특이 차이에 의해 인체에 전달 될 수 없다. 이러한 생체 내 모델에 추가하여, 상처 치료의 일부 양태들은 ⁴ 선택된 긁 모델 고도로 표준화. 불멸화 세포주 또는 일차 세포에 기초한 생체 외 단층 배양 스크래칭을 통해 상처 상황을 시뮬레이션에 의해 연구 할 수 있지만, 충분히 반영되지 않는다 복잡한 생체 내 생리. ⁵ 이차원 모델은 또한, 삼차원 인간 피부 등가물 피부병 연구 개발되어왔다. 이 모델의 피부 부분은 GE 있습니다nerated 탈세 포화 진피 ⁶ 콜라겐 히드로 겔, ^7,8 글리코 ⁹ 또는 합성 재료 등 다양한 지지체를 사용. ^(10)이 피부 등가물을 채용, 상피 간엽 상호 작용 ^(11)의 역할을, 재 상피화, 섬유 아세포 및 각질 세포 및 간 세포 누화 다른 성장 인자의 영향이 연구 될 수있다. 또한,이 모델은 섬유 아세포가 부상 영역으로 마이그레이션하는 방법과 화학 주성 인자가 조직 재생에 영향을 미치는 방법에 대한 새로운 지식을 습득하는데 유용하다. ⁽¹²⁾

상처 치유 모델 자체의 생성뿐만 아니라 도전이지만, 또한 모델의 고도로 표준화 상처 문제가 확립. 일반적인 기술은 상처 스크래치 테스트, ¹³ 화상, ¹⁴ 테이프 마모, ¹⁵ 열 손상, ¹⁶ 흡입 물집, ¹⁷ 액체 질소, ¹⁸ 레이저, ¹⁹ 있습니다 만들 수 있습니다 메스, ¹⁸ 메쉬 작업자 ⁶ 생검 펀치. 이러한 방법 ²⁰ 대부분 같은 함정이있다. 수동으로 구현 부상 표준화 및 여러 테스트를 사이에 재생하기 어렵습니다. 크기, 형상 및 상처의 깊이 연구 사이에서 변화하고, 따라서 연구 데이터의 품질이 저하. 정의 피부 상처 용 레이저의 사용은 비교적 용이하지만 표준화 화상 상처를 흉내 낸 상황에 이르게 할 수있다. 레이저에 의해 적용 열 괴사 조직으로 이어질 수 있습니다 단백질 변성, 혈소판 응집 또는 혈관 수축을 일으킬 수 있습니다.

대안적인 접근법에서, 우리는 우리가 멸균 조건 하에서 정확한 정의 및 피부 상처를 생성 할 수있는 자동화 된 상처 소자 (AWD)를 개발 하였다. 깊이 및 속도의 침투뿐만 아니라 드릴 헤드의 회전 수 등을 파라미터 상흔을 규제 할 수있다. 이 연구에서 우리는 집에서 개발 한 전체 두께 피부 등가물과 AWD를 결합 (피트Gangatirkar 등에 의해 발표 된 프로토콜에 비교할 SE). ⁽⁸⁾ 피부 상당의 피부 층은 내가 하이드로 콜라겐에 포함 된 인간 피부 섬유 아세포 (HDF)로 구성되어있다. 진피층에서 인간의 표피 각질 형성 세포 (HEK)은 시드입니다. 공기 - 액체 계면에서 2 주 이내에 HEK 여러 중요한 세포층과 각질층 이루어지는 표피를 구축. 이 모델의 생성 외에도,이 연구는 FTSE에 정의 된 정확한 상처를 만들 수있는 AWD를 사용하는 방법을 보여줍니다.

프로토콜

주 : 프로토콜 24 전층 피부 등가물의 제조를 위해 설계된다. 피부 섬유 아세포와 표피의 각질 형성 세포 인간 ^{21, 22} 동의서 사전 얻었다. 이전에 출판 된 프로토콜에 따라 피부 생검에서 분리하고, 연구는 율리우스 막시밀리안 대학 뷔르츠부르크의 인간 연구에 대한 기관 윤리위원회에 의해 승인되었다 (182 투표 / 10).

피부 구성 요소 1. 생산

1. 6 mg / ml의 최종 농도로 0.1 % 아세트산과 콜라겐 녹인다. 겔 중화 용액의 경우, 232.5 ml의 DMEM 배, 7.5 ml의 소 태아 혈청, 7.5 ㎖의 3 M HEPES, 2.5 ml의 콘드로이틴 설페이트 (5 ㎎ / ㎖)를 혼합한다. 얼음 젤 중화 솔루션과 콜라겐 솔루션을 유지합니다. 삽입 / 피부 당량 당 겔의 500 μl를 계산합니다.
   주 : 겔 중화 용액 콜라겐 용액 처리장의 두 부분과 혼합 될 수있는 바와 같이콜라겐의 양을 두 번 다시.
2. 24 웰 플레이트에 24 삽입을 놓습니다.
3. 10 ml의 DMEM, 270 XG에 5 분 동안 원심 분리기에 인간의 피부 섬유 아세포 (HDF)를 재현 탁하고 세포를 계산합니다. g X 270에서 5 분 동안 필요한 HDF의 양 (500 μL 콜라겐 젤 당 5 × 10 ⁴ 세포)와 원심 분리기 세포를 추출합니다.
4. 4 ml의 기포를 생성하지 않고 겔 중화 용액 냉각에 재현 탁 HDF를 조심스럽게 상층 액을 제거하고. 이 단계에서 콜라겐 젤의 조기 응고를 방지하기 위해 가능한 한 빨리 작업을해야합니다.
5. 콜라겐 용액 8ml를 가진 용액을 재현 탁.
6. 다단계 피펫으로 콜라겐 세포 혼합물을 가지고 각 삽입 빠르게 혼합물의 500 μl를 입력합니다. 인큐베이터에서 20 분 동안 젤을 품어 (37 ° C, 5 % CO ₂₎ 젤 굳어진합니다.
7. 웰당 2ml의 둘 베코 변형 이글 DMEM 배지 + 10 % 소 태아 혈청 (FCS)에서 겔을 담근다및 인큐베이터에서 24 시간 (37 ° C, 5 % CO _2)를 위해 그것을 품어.

인간의 표피 각질 형성 세포의 2. 추가 (HEK)

1. 24 시간 후 배지를 제거합니다. 50 ㎍ / ml의 최종 농도로 초순수 인간 피브로넥틴 단백질을 녹인다. 피브로넥틴 용액 25 μL에 해당하는 각각의 피부를 커버. 배양기에서 30 분 동안 젤을 인큐베이션 (37 ℃, 5 % CO _2).
2. 한편, 10 ㎖ KGM-2를 재현 탁 및 HEK KGM-2 + 5 %의 FCS 준비로 1 × ¹⁰⁶ 세포 / ml의 세포 농도를 설정한다. 각 겔에 씨앗 1 × 10 ⁵ HEK. 인큐베이터에서 45 분 (37 ° C, 5 % CO ₂₎ 세포가 준수 할 수 있도록 젤을 품어.
3. 인큐베이터에서 KGM-2 + 준비 5 % FCS와 문화를 (37 ° C, 5 % CO _2)와 젤을 담그지.

전체 두께 피부 등가물 3. 문화 (FTSE)

1. 6~7일에 대한 문화 FTSEFCS 농도 (5 %, 2 %, 0 % FCS)을 내림차순. 다음으로 낮은 FCS 농도가 2-3 일마다 매체를 변경합니다. 이를 위해, 완전히 매체를 제거하고 신선한 매체의 1.6 ml를 추가합니다.
2. 7 일에서 완전히 매체를 제거합니다.
   참고 : 그렇게하는 동안 피펫의 끝 FTSE 표면을 만지지 마십시오.
3. 모든 멸균 집게로 6 웰 플레이트의 한 우물에 삽입 놓습니다. FTSE 표면을 젖은 가지 않도록 잘 당 1.5 ml의 공수 매체를 추가합니다. 추가로 14 일 동안 2-3 일마다 중간 변경합니다.
   주 : 배지의 충전 레벨은 FTSE의 메 니스 커스에 달려있다.

4. 조직 학적 분석

1. 고정 및 FTSE의 파라핀 삽입
   1. 실온에서 2 시간 동안 조직을 신선한 24 웰 플레이트에 삽입을 전송하고 잘 1.6 ml의 각 % 파라 포름 알데히드 (4)를 추가하여 조직을 수정하고 배양, 배양 배지를 제거합니다. 주의! Paraformaldehyd이 독성, 흄 후드를 조작 할 수 있습니다. 이전조직 포함 카세트 FTSE. 물로 세척하여 남아있는 고정 제를 제거하고 상행 에탄올 농도를 사용하여 조직을 탈수.
   2. 중간에 수직 절단에 의한 피부 등가를 나눈다. 아래쪽 절단면과 파라핀 채워진 금속베이스 몰드의 두 조각을 놓는다. 백업으로 금형의 상단에있는 조직 카세트를 추가합니다.
   3. 적합한 현미경 슬라이드에 슬라이드를 장착, 3-5 μm의 조각을 잘라 straitening에 대한 40 ° C의 물을 욕조에 그들을 떠. 완전히 건조 조각.
2. 헤 마톡 실린 및 에오신 (H & E)과 면역 조직 화학 (IHC) 염색
   1. 장소는 랙에 슬라이드와 60 ° C에서 1 시간 동안 배양한다. 파라핀이 용융되어 있는지 확인합니다. 얼룩은 표준화 개요 염색으로 H & E와 조각을 재수.
   2. H & E 염색을 위해 에탄올 50 %, 4 배 탈 이온수, 1 배 헤 마톡 실린, 1X 염산-E 1X와 에탄올로 2 배, 에탄올로 3 배, 크 실롤으로 70 %를 96 %를 4 배 유리 염색 큐벳을 준비thanol (13.7 ml의 1 M 염산 광고 200 ml의 50 % 에탄올), 1X 탭 물, 1X 에오신 및 배 2- 프로판올 (100 ㎖ 탈 이온수에 1g의 에오신).
   3. 장소는 크 실롤의 I에서 10 분 deparaffinize과 슬라이드를 재수하는 크 실롤 II에서 10 분을 슬라이드. 딥 에탄올 50 % 에탄올 70 %와 3 배에서 3 배, 에탄올에 에탄올 96 % I, 배에 96 % II를 3 배를 슬라이드. 탈 이온수에서 슬라이드를 돌립니다. 헤 마톡 실린 염색, 염산 - 에탄올 딥 배를 구분합니다. 탈 물에 씻어. 청소법를 들어, 장소는 수돗물에 5 분을 슬라이드. 에오신 염색의 경우, 장소는 에오신에서 1 분 슬라이드 탈 이온수에 나중에 씻으십시오. 탈수 법, 딥 슬라이드 에탄올 96 % 에탄올에 70 %, 2 × 2 배 및 2- 프로판올 II에서 5 분 동안 2- 프로판올 I에서 5 분 동안 놓으 크 실롤에서 5 분 I 및 크 실롤 II에서 5 분. H & E 염색 한 후, 세포 핵은 빨간색으로 염색 블루, 세포질과 세포 외 기질에 염색.
   4. 항원 검색을 위해, 자일 렌으로 파라핀을 제거하고 염색에 대한 슬라이스 재수. 장소 조각증기 밥솥에 미리 가열 된 10 mM에서 20 분 구연산 완충액 (pH 6)에 대한 탈 파라핀과 재수 조각을 요리하고.
   5. 액체 구충제 슬라이드 마커 펜 또는 다이아몬드 스타일러스 세척 버퍼에 넣어 슬라이드 (PBS 버퍼 + 0.5 % Polysorbat 20)과 원 조각.
   6. 수분 챔버에서 슬라이드를 놓습니다. 각 슬라이스에 100 ㎕의 3 % 과산화수소 용액을 첨가하여, 내인성 퍼 옥시 다제를 차단. 주의! 피부와 눈에 접촉 한 경우, 대단히 유해 함. 개인 보호 장비를 처리합니다. 워시는 세탁 버퍼에 슬라이드.
   7. 차 항체를 적용하고 실온에서 1 시간 동안 배양한다. 세척은 세척 버퍼로 3 회 슬라이드. 여기부터, 샘플은 어둠 속에서 유지되어야한다.
   8. 결합 특이 항원 - 항체의 검출을 위해 비오틴 - 스트렙 타비 딘 탐지 시스템을 사용합니다.
   9. 1 분 동안 헤 마톡 실린 핵을 Counterstain과. 탈수 및 슬라이드를 탑재합니다.
   10. 역 현미경을 사용하여 이미지 샘플.

5. 자동 상처 장치의 사용에 의한 상해 (AWD)

1. 70 % 에탄올 및 자외선과 작업 영역을 소독하여 AWD를 준비한다. 원하는 크기의 드릴 헤드를 확인합니다 (예를 들어, 1mm)가 부착되어있다.
2. 멸균 집게를 사용하여 멸균 샘플 캐리어 플레이트의 지정된 영역으로 피부 등가물을 놓습니다. 드릴링 헤드 아래의 소켓에 샘플 캐리어 플레이트를 놓습니다.
3. 스핀 속도 : 다음과 같이 상처 매개 변수를 설정하는 제어 소프트웨어를 사용하여 15,000 RPM을; 침투 : 1.5 mm; 추진 : 100 Hz에서. 이들 파라미터는 개별적으로 각각의 샘플 유형에 대해 정의 될 필요가있다. 전송 AWD에 매개 변수 부상을 입었습니다.
4. 절차를 상처 시작합니다. 소켓에서 샘플 캐리어 플레이트를 제거합니다. 전송 멸균 집게를 사용하여 배양에 사용되는 인서트로 다시 FTSE 부상.
5. 중생의 조사를 위해 인큐베이터에 상처 FTSE의 문화 (37 ° C, 5 % CO _2)를 진행합니다. 알대체적으로, 언제든지 조직 학적 분석을위한 모델을 사용합니다.

결과

고립 된 HDF와 HEK는 형태와 일반적인 마커의 발현 모두 다르다. HEK의 형태가 볼일 형태에 의해 설명 될 수있는 반면 HDF는 전형적인 스핀들 형상의 형태를 보였다. 세포 FTSE 위해 사용하기 전에 면역 조직 화학 염색 (도 1)을 특징으로 하였다. HDF는 멘틴 (그림 1A), 섬유 아 세포 마커에 대한 긍정적이다. 차 HEK 매우 초기 분화 단백질 아세포-14 (그림 1B)하지만 거의없는 늦은 각질 세포의 분화 단백질 아세포-10 (그림 1C)을 표현한다.

초대 배양에 이어, 우리는 세포 배양 플라스크에서 세포를 분리하고 FTSE의 생성을 위해 그들을 사용. FTSE는 공기 - 액체 인터페이스 (그림 2B)에서 14 일 배양 한 다음 submers에서 칠일 매체 조건 (그림 2A)에 ...

토론

시험 관내 세포에서 세포가 보통 플라스틱 표면에 부착하는 이차원 세포 배양 물에서 확장된다. 그러나 이러한 배양 조건은 세포가 생체 내에서 성장하는 생리 학적 입체 조건을 반영하지 않습니다. 입체 조건에서 세포는 자연 세포 - 세포 및 세포 - 매트릭스 첨부 파일을 형성 할 수 및 3 차원으로 이동한다. 세포 이동 및 행렬 생성은 상처 치유의 핵심 요소로서, 특히 생체 내 상황 닮은 피부 상처 치유에서 의미있는 데이터를 생성하기 위해 요동한다.

인간 차 세포​​로 구성되어 우리가 개발 FTSE 이러한 조건을 모방하고 피부 및 피부의 표피층을 모두 반영하기 위하여. 공기 - 액체 계면에서 배양 2 주 동안 HEK 상이한 분화 단계 및 각질층에서 각질 세포의 여러 층으로 구성 표피를 형성한다. Furthermore, 진피층이 하이드로 겔은 I 콜라겐에 내장 HDF, 구성된다. 배양 시간 동안, HDF는 모델

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
트립신 EDTA (1:250) DPBS	PAA	L11-003	0.05%
s 인산염 완충 식염	시그마	D8537
콜라겐 (0.1% 아세트산에 6 mg/ml)	집에서
피브로넥틴 인간 단백질, 플라즈마 (50  &마이크로; g/ml)	Life Technologies	33016-015
인서트	Nunc	140627
6 웰 플레이트	Nunc	140685
24 웰 플레이트	Nunc	142485
현미경 슬라이드	R. Langenbrinck	03-0070
Fibroblasts culturing (500 ml):
DMEM, High glucose	Life Technologies	11965-092	89% (445 ml)
Fetal bovine serum	Bio &	FCS를 판매합니다. ADD.0500	10% (50 ml)
페니실린-스트렙토마이신 (10,000 U/ml)	Life Technologies	15140-122	1% (5 ml)
Keratinozyten Culture Medium (500 ml):
Keratinocyte Growth Medium 2	Promocell	C-20111	89% (445 ml)
각질세포 성장 매체 2 보충제팩	프로모셀	C-39011
페니실린-스트렙토마이신(10,000 U/ml)	라이프 테크놀로지	15140-122	1%(5ml)
Gel 중화 용액(250ml):
Dulbecco' s Modified Eagle Medium, L-Glutamine	PAA	G0001,3010	93%(232.5ml)
상어 연골에서 콘드로이틴 황산나트륨 염	Sigma	C4384-1g	1%(2.5ml)
태아 소 혈청	Bio &	FCS를 판매합니다. ADD.0500	3%(7.5ml)
HEPES	시그마	H3375-1kg	3% (7.5 ml)
피부 모델 잠수 매체 (500  ml):
Keratinocyte Growth Medium 2	Promocell	C-20111
각질세포 성장 매체 2 보충제팩	프로모셀	C-39011
태아 송아지 혈청	Bio &	FCS를 판매합니다. ADD.0500	5%-2%(25ml-10ml)
페니실린-스트렙토마이신 (10,000 U/ml)	Life Technologies	15140-122	1% (5 ml)
피부 모델 공기-액체 인터페이스 매체 (500 ml):
Keratinocyte Growth Medium 2
Keratinocyte Growth Medium 2 Supplement Pack	Promocell	C-39011	은 보충제만 추가합니다: 인슐린, 하이드로코르티손, 에피네프린, 트랜스페린, CaCl2
페니실린-스트렙토마이신 (10,000 U/ml)	Life Technologies	15140-122	1% (5 ml)
CaCl2 (300 mM)	Sigma	C7902-500g	0.62% (3.1 ml)
Histology:
IHC-Kit DCS SuperVision 2 HRP	DCS	PD000KIT
Vimentin 항체	Abcam	ab92547
CK14 항체	Sigma	HPA023040-100&마이크로; l
CK10 항체	Dako	M7002
Filaggrin 항체	Abcam	ab81468
H& E 염색 : < / 강>
Mayer ´ s Haemalaun	AppliChem	A0884,2500
Xylol	Sigma Aldrich	296325-4X2L
에탄올	Sigma Aldrich	32205-4X2.5L
HCl	Sigma Aldrich	H1758-500ML
Eosin	Sigma Aldrich	E4009-5G
2-Propanolol	Sigma Aldrich	I9516-500ML
마운팅 미디엄	시그마 Aldrich	M1289-10ML