배아 마우스 마음에 면역 형광을 이용하여 심근 개발 분석

심근 세포는 중간 선으로 마이그레이션 및 선형 심장 튜브 ^{1, 2를} 형성 한 후 개발하는 동안, 심장 수축 곧 시작합니다. 근절은 심근 내에서 기본 수축 단위; 이 고도의 조직 세포 골격 구조는 sarcomeric α-티닌 (S-α-티닌)와 M 라인에 고정 미오신 섬유 (그림 1)에 의해 Z 디스크에 고정 액틴 필라멘트를 포함하고 있습니다. 심근 세포가 성숙, sarcomeres는 셀을 가로 질러 연장 근원 섬유를 형성하기 위해 직렬로 조립한다. 근원 섬유는 인터 디스크에 의해 심근의 끝 부분에 고정되어, 같은 S-α-actinin의 ^3, adherens으로 Z-디스크 요소의 부분 집합을 과도 접합을 포함하는 세포 - 세포 접합부 구조 등 N-cadherin의 등의 접합 단백질 및 β 카테닌의, 간극 결합 단백질 및 데즈 모섬 (도 1) ^4. 길이 막, 말초 근원 섬유의 Z-디스크 따라costameres 통해 세포막에 부착; 이러한 전문 초점 유착 (도 1) ^4- 근원 섬유, 세포막 및 심근 추가적인 구조적지지를 제공하는 세포 외 기질 간의 앵커를 제공한다. 초기 심장 개발, 심근은 심실 공간으로 돌출 상대적으로 성숙 근원 섬유 ^(5)를 포함 trabeculae로 알려진 손가락 모양의 돌기에 배치되어있다. 심장 개발이 진행됨에 따라, 서브 외막 영역 심근 심실 벽을 포함하지만, 근절 및 근원 섬유 조립체 섬유주 심근 ^5,6- 비하여 지연되는 콤팩트를 형성하는 심근 증식.

근절 및 근원 섬유 조립체의 모델 배양 간단하지만 삼차원 환경 혈류 부족 심근 ^7-10, 및 기타 심장 세포와 접촉에 면역 연구는 크게 올생체에 존재에요. 배아의 중심부에 면역을 사용하여 고해상도 구조 연구는 기술적으로 도전이며, 몇몇 연구는 마우스 심장 개발하는 동안 인터 디스크와 costameres의 출현을 살펴 보았다. catenin의 β adherens 접합 단백질은 배아 하루 인터 디스크 (E) 17.5 ^(11), N-cadherin의 발현이 출생 후의 일 0 ¹³ 대 E18.5 ^(12)에 의한 인터 디스크를 나타낼 수있는 선형 구조 지역화 및 costameres이 검출 된 것으로 지역화 나타납니다 E18.5 ^{(14)하지만,} 이러한 단백질은 초기 개발 시점 ^11-13에서 확산 등을 지속적으로 막 분포를 표시합니다.

여기서 우리는 intercala의 출현을 포함하여 근원 섬유 및 심근 개발의 상세한 분석, 허용 면역 염색과 구분 마우스 배아 마음의 형광 현미경을위한 간단하고 재현성있는 방법을 설명테드는 초기 E12.5 및 E16.5에서 초기 costameres으로 디스크에 기록 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 근절 형성뿐만 아니라 근원 섬유 및 심근 성숙에 돌연변이의 효과를 프로빙 유용 할 수 있습니다.

참고 : 모든 실험 절차는 UCSF 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다.

1. 냉동 보존 및 배아 마우스 마음의 고정.

1.1) 배아의 마음을 스냅 동결

1. 최적의 절단 온도와 3.5 cm 페트리 접시와 7mm cryomolds 채우기 OCT () 매체 (재료 표 참조). 화학 후드, 액체 질소 2- 메틸 부탄 냉각.
2. 10cm 배양 접시, 3.5 cm 배양 접시에 PBS 10 ㎖로 인산 완충 식염수 (PBS)의 30 ml에 분배하고, 얼음에 모든 배양 접시를 놓습니다. 한 10cm 접시와 임신 한 마우스 당 여러 개의 3.5 cm 요리를 준비합니다.
3. 이전에 얼음처럼 차가운 PBS의 해부를 수행, ^{15 설명} 된대로 배아를 분리합니다.
4. 간단히, CO ₂ 마취 자궁 전위를 사용하여 임신 여성을 안락사.
   1. , 복부 절개를 무조건 혈관을 절단하여 자궁을 해부자궁의 내부 곡률 겨, 빙냉 PBS를 함유하는 페트리 접시 10cm 자궁 옮긴다.
   2. 얼음처럼 차가운 PBS를 포함하는 개인 3.5 cm 페트리 접시에 각각의 배아 및 전송 사이에 자궁을 잘라. ^{15 설명} 된대로 각 배아를 분리합니다.
   3. 미세 집게를 사용하여 심낭 캐비티를 열고 대동맥, 하대 정맥, 폐 혈관에서 절단하여 멀리 폐와 혈관에서 심장을 제거하고 OCT를 포함하는 3.5 cm 페트리 접시에 전송합니다.
   4. 심장이 다음 OCT를 포함하는 7mm 금형에 마음을 전송, 몇 초 동안 OCT에서 평형을 보자. 금형의 바닥에 마음의 전벽의 방향을.
5. 부드럽게 액체 질소 냉각 2- 메틸 부탄에 금형을 배치합니다. 주의 2- 메틸 부탄 액체 OCT의 심장에 닿지 않도록. OCT를 백색 고체가 될 때까지, 다음 드라이 아이스를 포함하는 얼음 양동이에 금형을 전송 동결. 다음 배아로 이동합니다.
6. WRAP는 냉동 절편 전까지 -80 ° C에서 박 및 저장소에 cryomolds.

1.2) 대안 : 파라 포름 알데히드 (PFA)는 고정, cryoprotecting 및 빛 간섭 단층 배아의 마음을 포함

1. 1X PBS에서 4 % PFA로 12 웰 조직 배양 판의 우물을 입력합니다.
2. 1.1.3에 설명 된대로 배아 마음을 해부하다. 잘 포함 4 % PFA로 각 마음을 놓고 4 ° CO / N에 고정한다.
3. Cryoprotection : 플라스틱 전송 피펫을 사용하여, PBS 1.5 ml의 15 % 자당을 함유하는 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브에 각각의 마음을 이동하고 마음이 튜브의 바닥에 침몰 할 때까지 부드럽게 (4 ° C에서 O / N에 몇 시간을 선동 ). PBS의 30 % 자당의 1.5 ml의 microcentrifuge 관 포함 1.5 ㎖에 각각의 마음을 전송하고 마음 (O / N에 몇 시간) 튜브의 바닥에 침몰 할 때까지 부드럽게 다시 4 ℃에서 교반.
4. 플라스틱 전송 피펫을 사용하여, 10월에 cryoprotected 마음을 배치하고 평형을 보자몇 분을 초과 크로스를 제거하려면 다음 OCT를 포함하는 7mm 금형에 마음을 전송합니다. 금형의 바닥에 마음의 전벽의 방향을.
5. 액체 질소 냉각 2- 메틸 부탄 또는 드라이 아이스 중 하나의 금형을 배치하여 OCT의 마음을 동결.
6. 냉동 절편을위한 준비가 될 때까지 -80 ° C에서 박 및 저장소에 cryomolds 랩.

2. 냉동 절편

1. -17 ℃로 설정 저온 유지 온도.
2. 장소는 저온 유지 챔버로 cryomolds 15 ~ 20 분 동안 온도 평형.
3. cryomold 전환 및 금형에서 심장 블록을 추방 부드러운 압력을 사용합니다. 성형 조직 블록의 상단에 마음의 전벽의 방향을.
4. 척 상의 OCT 큰 방울을 놓고 척에 고정하려면 OCT의 드롭에 심장 블록을 탑재합니다. 마음의 앞쪽 벽 척에서 멀리되도록 방향을 유지합니다.
5. 척을로드하고 그 장착저온 유지 장치 개체 홀더 상 예술 블록. 블레이드의 각도가 샘플에 대해 3-5 °가되도록 조정한다.
6. 양으로 대전 코팅으로 예비 처리 된 현미경 슬라이드 상에 10 ㎛의 섹션을 수집 (원료 표 참조). -80 ° C에서 저장하기 전에 완전히 건조시킵니다.

3. 면역 형광

1. 스냅인 동결 절편의 경우, 수정하고 실온에서 흄 후드에서 10 분 동안 아세톤에 조직을 Permeabilize 하시려면.
2. 스냅 냉동 및 PFA 고정 섹션의 경우, OCT를 제거하는 20 분 동안 PBS-0.1 % 트리톤 X-100에서 부화 및 PFA 고정 섹션을 Permeabilize 하시려면 할 수 있습니다.
3. PBS에 희석 1X 차단 버퍼에 45 분, 대한​​ 차단.
4. RT에서 45 분 동안 PBS-0.1 % 트윈 20 (100) (설명 참조) : 마우스에서 발생한 차 항체를 사용하는 경우, 당나귀 또는 염소 항 - 마우스 IgG (H + L) (1) 희석 일가 Fab 단편에서 배양한다.
5. RT 또는에서 2 시간 동안 1X 차단 버퍼에 희석 차 항체 또는 항체에 품어O / 4 ° C에서 N (특정 희석 용 재료 / 장비의 표 참조).
6. 실온에서 10 분 동안 1X PBS 세 번 절을 씻으십시오.
7. 1 희석 알렉사 플 루어 - 복합 이차 항체에 품어 : (500)를 빛으로부터 보호 실온에서 2 시간에 대한 버퍼를 차단합니다.
8. 빛으로부터 보호 실온에서 10 분 동안 1X PBS 세 번 절을 씻으십시오.
9. 옵션 : 다음, 핵 레이블을 PBS로 씻어 (빛으로부터 보호) RT에서 PBS에서 2000 : 훽스트 (Hoechst) 염료에 품어 1 희석.
10. 후 수정 실온에서 1 분 1 % PFA 섹션을 표시.
11. 커버 슬립와 취재 후 슬라이드의 각 끝에 매체의 두 방울을 배치에 의해 (핵이 이미 표시되어 있지 않은 경우 DAPI와) 마운트 안티 - 페이드 매체에 슬라이드. 인감 매니큐어 된 커버. 쇼핑몰 이미지에 준비가 될 때까지 4 ° C에서 빛으로부터 보호.

4. 공 촛점 이미징 및 이미지 분석

1. 적절한 레이저 파장, 카메라, 및 공 초점 현미경 INC 켭니다무대 발동기 및 z 모터를 luding. 이미지 소프트웨어 프로그램을 실행합니다. 각각 Hoechst-, 알렉사 488-, 알렉사 568 - 스테인드 섹션을 영상화 405, 488, 및 561 레이저 파장을 사용합니다.
   참고 : 우리의 하드웨어 및 소프트웨어 사양에 대한 자료 표를 참조하십시오.
2. 슬라이드 무대에서 제어 슬라이드 (거꾸로 현미경을 위해 아래로 커버 슬립)를 탑재합니다.
3. 4X 목적 사용, (재료 표 참조) 시료와 관심의 영역을 찾을 수 있습니다. 높은 배율 이미징 때 맵으로 사용할 이미지를 캡처합니다.
4. 슬라이드 단계로 최소한의 조정을 슬라이드를 제거합니다. 60 배 기름 침지 목표로 변경, (재료 표 참조) 목적에 기름의 작은 방울을 배치하고 슬라이드 무대에 (아래 커버 슬립) 슬라이드를 교체합니다.
5. 다시 샘플을 찾을 수 있습니다. 각 채널에 대한 원하는 레벨까지, 레이저 파워, 노출 시간, 및 비닝을 설정한다.
   참고 : 우리는 일반적으로 레이저 0.8의 힘, 100 밀리의 카메라 노출 시간, 2 비닝 (binning)을 사용 (자체전자 재료 표) 하드웨어 및 소프트웨어 사양; 최적의 설정은 각 실험에 대해 경험적으로 결정될 필요가있다.
   1. 최적의 설정이 결정되면, 현재 실험에서 모든 조직 섹션에 대해 동일한 설정을 사용한다. (이 정보는 해석에 사용된다), 각 채널에 대한 최적의 강도 범위를 유의 크기 히스토그램을 사용한다.
6. 다음 Z 스택의 상한값과 하한값을 선택 레이저 적절한 채널들을 선택 획득 기능을 사용하여 AZ 스택을 생성한다. 소프트웨어에 의해 제공되는 광학 슬라이스 두께의 절반 값 인 AZ 스택 스텝 사이즈를 선택한다. 이미지를 수집하기 위해 "실행"을 클릭합니다.
7. 피지 ⁽¹⁶⁾ 또는 이미지 분석을위한 비교 프로그램을 사용하십시오. 피지 내에서 사용자 지정 색상 모드 옵션과 별도의 창으로 분할 채널 Z 스택 파일을 엽니 다. 풀다운 메뉴 이미지에서 "밝기 / 명암 ​​대비를 조정합니다"도구를 엽니 다; 각 채널 내에서이야히스토그램 등 최적 강도 범위 4.5.1 결정. 모든 Z 스택에 이러한 채널의 범위를 적용하는 분석된다.
8. 화상 -> 컬러 풀다운 메뉴를 사용하여 하나의 합성 이미지로 개별 채널을 병합합니다.
9. 화상 -> Stacks-> Z 프로젝트 메뉴를 사용하여 합성 이미지에서 평평 Z 스택을 만듭니다. 이 이미지는 3D 이미지보다 훨씬 밝은 것입니다; 대조 시료는 과포화를 방지하고, 평탄 실험 Z 스택에 동일한 설정을 적용하는 히스토그램 강도 범위를 조정한다.
10. 3D 이미지를 생성하려면 먼저 사용하는 화상 -> Stacks-> 3D 프로젝트 메뉴 ^(17). x 축 또는 회전의 y 축 중 하나를 선택합니다. Z 스택 스텝 사이즈 미크론의 수와 동일한 슬라이스 간격을 설정한다. 원하는 총 회전을 선택한 다음 플러그인 풀다운 메뉴에서 이미지 J 3D 뷰어를 열 1로 회전 각도 증분을 설정합니다. 볼륨과 복합 4.8에서 생성 된 이미지 표시를 선택하고 다시 설정1 또는 2로 샘플링 인자.

스냅 냉동 및 아세톤 고정 마음에 다른 단백질의 공동 염색 6은 전형적인 결과를 통해 2도. 에 대한 항체 재현 표지 Z-디스크와 높은 특이성과 최소한의 배경 (그림 2A, 3A, 4A, 5A, 6A 및 6C)와 인터 디스크의-α는-티닌, 그림 6 보여주는 안티 - 마우스 IgG (H의 + L) 가의 Fab 단편 효과적으로 차단 내생 마우스 IgG는 항 마우스 이차 항체에 의해 결합. catenin의 β adherens 접합 단백질에 대한 항체는 심근 세포와 비 심근 세포 모두의 멤브레인을 결합하고,에서 예상대로 S-α-actinin의와 공동 지역화, E16.5 (그림 2C와 D)에서 추정 인터 디스크에서 발생 성인 심장 (18)의 β 카테닌 염색 패턴. β배아 마음에 1 인테그린 면역 특히 도전 종종 초점 유착 (14)를 식별하는 데 실패하지만, 이러한 연구에서 β1 인테그린 염색 가능성에 형성 초기 costameres을 반영하는 S-α-actinin의 표지 Z-디스크와 동일한 주기로 신호를 밝혀 E16.5 (그림 3D).

E12.5에서, S-α-actinin의 트로포 미오신 (근절 얇은 필라멘트 단백질) 면역이 S-α-actinin의 이러한 세포 (도 4A 및 5A에서 성숙한 근원 섬유와 일치 소주 심근 세포에서 일정한주기와 염색 패턴을 밝혀도 4B를 트로포)입니다. 아마도 인터 디스크를 나타내는 E12.5 마음에 소주 심근 세포에서 N-cadherin의 염색은 강렬한 S-α-actinin의 염색의 영역 (C - - D 그림 6A 그림 5B)와 colocalize 경향이 있었다. 에소주 심근 세포에 대비, 컴팩트 영역에서 S-α-actinin의 선형보다 더 작은 반점이 있었고, 트로포 미오신 염색 확산보다는 선형했다 (그림 4a 및도 4b). 따라서, 근절 어셈블리는 소주 심근에 비해 컴팩트 한 후에 발생할 수 있습니다. 또한, 컴팩트 한 영역에서의-α-actinin의 트로포 미오신의 차동 패턴은 얇은 필라멘트에 편입 트로포 미오신하는 근원 섬유 어셈블리 나중에 이벤트가 될 수 있지만 그 S-α-actinin의가, puncta의 초기 미숙 한 Z-디스크로 조직 좋습니다.

그림 7, 영화 1과 동영상 2는 PFA 고정 E12.5 배아 심장에서 전형적인 결과를 보여줍니다. 이들 예에서, 트랜스 제닉 RFPruby LifeAct - 배아가 촬상에 사용되었다; LifeAct-RFPruby 트랜스 (19)는 사상 굴지의 레이블하지만 PFA 고정이 필요합니다. S-α-티닌 표지 Z-디스크는 대부분의 영역에서 용이 시각화했지만 신호 대 잡음비가 decre이었다 스냅 냉동하는 마음 섹션 (그림 7A)를 비교 ased; 이 신호가 항원이 단백질 상호 링크에 의해 마스크 될 수있는 PFA - 고정 조직에서 S-α-actinin의 면역 형광 전형적인이었다. 그림 7b는 사상 굴지의 공동 시각화를 보여 근원 섬유 (화살촉) 내에서의-α-actinin의 immunolabeled 소주 근육 세포 (화살표)에 인접한 내막 세포 내부와 사상 말라. 입체 화상 재구성은 추가 정보를 공개 : 개별 심근 세포가보다 용이 심근 내 근원 섬유가 대략적으로 서로 평행하고, 분별하였으나, 개별 심근 세포들이 서로 (도 7C 및 D, 영화 1 및 무비 (2)에 다양한 각도로 배향되었다 ). 심 내막 세포와 심근 세포 사이의 근사치는 더 나은뿐만 아니라 입체 뷰에서 평가되었다.

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그림 2. S-α -actinin 및 배아 일 16.5에서 β 카테닌 면역. 심장이 적출, 스냅 냉동, 저온 절단, 아세톤 고정하고, S-α-actinin의 대한 (A) 마우스 단일 클론 클론 EA53 항체를 사용하여 면역 염색, 어떤 표시 심근 Z 디스크와 인터 디스크, 카테닌 β adherens 접합 단백질에 대한 (B) 토끼 polycloncal 항체. (C) 병합 된 이미지는 S-α-티닌 및 β의 카테닌 염색을 보여줍니다. (D) 확대 된 패널 C에서 관심의 영역을 ; 별표 (*) 표시는 S-α-티닌 및 β의 카테닌의 공동 현지화와 인터 디스크를 추정. 이미지는 AC 패널의 상부 좌측에서 외막 층과, 상기 주변 좌심실의 심근 벽 또는 콤팩트로부터 수득 하였다. 오 밖으로 강도 히스토그램 표시 범위 460-1600 (F 가능 65535) 모두 S-α-actinin의 / 488 nm의 β 카테닌 / 561 nm의 레이저 채널. 스케일 바 10 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3. S-α -actinin 및 배아 일 16.5에서 1 인테그린 면역을 β. 심장이 적출, 스냅 냉동, 저온 절단, 아세톤 고정하고, S-α-actinin의 대한 (A) 마우스 단일 클론 클론 EA53 항체를 사용하여 면역 염색과 인테그린 β1 초점 접착 단백질에 대하여 (B) 염소 폴리 클로 날 항체. (C) 병합 된 이미지는 심근의 β1 인테그린뿐만 아니라 비 심근 세포를 나타낸다. 참고 모두 확산 및심근 세포의 인테그린 신호 β1 반점 (D) Z-디스크에서 S-α-actinin의-염색 근처에 비슷한주기와 패널 C. 참고 반점,주기적인 β1 인테그린 염색 (화살표)에서 관심의 영역을 확대.; 이러한 구조는 costameres를 나타낼 수있다. 이미지는 컴팩트 좌심실 심근로부터 수득 하였다. β1 인테그린 / 561 nm의 레이저 채널의 S-α-actinin의 / 488 nm의 레이저 채널과 460-600에 대한 (수 65535 점 만점) 강도 히스토그램 표시 범위 460-1200. 스케일 바 10 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4. S-α -actinin 및 배아 일 12.5에서 트로포 미오신 면역 : 근원 섬유 조직의 섬유주 컴팩트 심근. 한배 새끼 배아로부터 하트가 적출은, 냉동, 저온 절단, 아세톤 고정하고, 근원 섬유 얇은 필라멘트에 대해 S-α-티닌 및 (B)의 마우스 단일 클론 항체에 대해 (A) 마우스 모노클 클론 EA53 항체를 이용하여 면역 염색 스냅 단백질 트로포 (발달 연구 하이 브리 도마 은행 CH1). 소주 (화살표) 및 소형 심근 (화살촉)가 표시됩니다. 조밀 층 (A)에 puncta에뿐만 아니라 선형 염색을 포함한 염색 패턴의 범위와 비교할 때 해면골 심근 정규 주기성 선형 S-α-티닌 염색을 참고. 또한 컴팩트 한 심근의 소주 심근 정기적 주기성하지만 더 확산 염색 선형 트로포 미오신 염색을합니다. 트로포 미오신 채널의 S-α-actinin의 채널과 460-1,000에 대한 (수 65535 점 만점) 강도 히스토그램 표시 범위 460-1,400. 스케일 바 10 μm의."https://www.jove.com/files/ftp_upload/52644/52644fig4large.jpg"대상 = "_ 빈">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5. S-α -actinin 및 배아 일 12.5에서 N-cadherin의 면역 형광 :. 소주 심근 세포의 근원 섬유와 인터 디스크 심장 적출, 스냅 냉동, 저온 절단, (A) 마우스 단일 클론 클론 EA53를 사용하여 아세톤 - 고정 및 면역 염색 S-α-티닌 및 초점 접착 단백질 N-cadherin에 대하여 (B) 토끼 폴리 클로 날 항체에 대한 항체. 0.2 μm의 광 슬라이스는 아리조나 스택으로 수집하고, Z 스택은 영상을 생성하도록 평탄화 하였다. (C) 병합 평탄화 스택 섬유주 심근 내에 N 카데 및 S-α-티닌 염색 양쪽을 표시 w로서엘 패널 C에서 관심의 훽스트 염료로 표지 핵 (D) 확대 된 지역.; 별표 S-α-티닌 및 N-cadherin의 공동 현지화와 인터 디스크를 표시합니다. S-α-actinin의 / 488 nm의 N-cadherin의 / 561 nm의 레이저 채널 모두에 대한 훽스트 (Hoechst) / 405 nm의 레이저 채널 (수 65535 점 만점)과 470-2,000 강도 히스토그램 표시 범위 470-1,200. 스케일 바 10 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 6. 안티 - 마우스 IgG (H + 1) 가의 Fab 단편 효과적으로 차단 내생 마우스 항 - 마우스 이차 항체에 의해 결합의 IgG. 배아 심장이 적출 된 E12.5, 스냅 아세톤 고정, 저온 절단 및 면역 염색, 냉동. (A) 합병 이미지 (수 65535 점 만점). 별표 노트 영역이있는 N-cadherin의 신호. 가능성이 초기 인터 디스크를 대표하는 소주 심근의 가로 끝에 제한 (B) N-cadherin의 전용 강도 히스토그램 표시 범위 480-2,500을 사용하여 채널입니다. (C)의-α -actinin 전용 강도 히스토그램 표시 범위 480-2,500을 사용하여 채널입니다. (DG) 섹션은 토끼 다 클론에 노출, 1X 차단 버퍼 만 (앤티 - 마우스 IgG 1가 Fab 단편 차단 단계)로 차단되었습니다N-cadherin의 만 (NO 마우스 모노클 차 항체), 세정하고, 알렉사 형석 488 항 마우스 알렉사 형석 586 항 - 토끼 이차 항체에 노출. (D)에 대한 일차 항체 크기 히스토그램 표시 범위 480-2500을 이용하여 화상을 병합. (E) N-cadherin의 전용 강도 히스토그램 표시 범위 480-2500를 이용하여 채널입니다. (F) S-α-actinin의 전용 강도 히스토그램 표시 범위 480-2,500을 사용하여 채널입니다. (G) S-α-actinin의 전용 채널 사용 항 - 마우스 IgG 1가 Fab 단편 차단 단계의 부재 하에서 내인성 마우스 IgG의 배경 검출 밝혀 고감도 크기 히스토그램 표시 범위 480-530이. (HK) 절편을 항 - 마우스 IgG이어서 1X 블로킹 완충액으로 차단시켰다 일가 Fab 단편은, N-cadherin의 (NO 마우스 모노클 차 항체), 다중 클론 토끼 세정 대 차 항체에 노출하고, 형석 알렉사 488 항 - 마우스 및 노출LEXA 형석 586 안티 - 토끼 보조 항체. (H) 크기 히스토그램 표시 범위 480-2,500을 사용하여 이미지를 흡수 합병. (I) N-cadherin의 전용 강도 히스토그램 표시 범위 480-2,500을 사용하여 채널입니다. (J) S-α-actinin- 전용 채널은 크기 히스토그램 표시 범위 480-2,500을 사용. (K) S-α-티닌 전용 배경 내인성 마우스 IgG의 검출 부족을 보여 고감도 크기 히스토그램 표시 범위 480-530을 이용하여 채널 때 항 - 마우스 IgG 가의 Fab 단편 차단 단계가 사용된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 7. S-α -actinin와 소주 CARDI에서 굴지의 조직S-α-티닌에 대한 마우스 단일 클론 클론 EA53 항체 Z-디스크와 인터 디스크에 라벨을 사용하는 동안 배아 일 12.5에서 omyocytes은. LifeAct-RFPruby 유전자 변형 마우스 라인은 사상 액틴 (19)를 시각화하는 데 사용되었다. 배아는 PFA 고정되었다. 0.2 μm의 광학 슬라이스 AZ 스택으로 수집 (A) 평평 Z 스택은 그 S-α-actinin의 얼룩은 스냅 냉동 및 아세톤 고정 부분 (그림 2-5)에 비해 PFA - 고정 조직에서 더 확산되었다 보여줍니다.. (B ) 평평 Z 스택은 사상 액틴과 모두의-α-actinin의 보여줍니다. 근원 섬유 (화살촉) 내에서 Z-디스크 사이에 국부적 인 사상 굴지의 형광. 필라멘트 액틴 형광도 해면골 근세포 (화살표) 라인 내막 세포에서 관찰되었다. (C) 적층 체의 상단에서 볼 때 해면골 심근의 3 차원도. (D)의 3 차원 도면해면골은 심근으로 스택의 바닥에서 볼. 강도 히스토그램 표시 범위 470-900 (수 65535 점 만점) 488 nm의 레이저 채널 A와 B의 561 nm의 레이저 채널 모두; C 및 D 스케일 바 10 μm의 두 채널의 표시 범위 460-800. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

영화 1. S-α -actinin 및 배아 일 12.5에서 소주 심근 세포의 액틴 조직의 360 ° 회전 3D 뷰. 그림 6에서 이미지 스택은 피지 이미지 분석 프로그램 내에서 이미지 J 3D 뷰어 플러그인을 사용하여 입체적으로 표현했다. 강도 히스토그램 표시 범위 470-800 (수 65535 점 만점) 488 nm에서 561 nm의 레이저 채널 모두. </ P>

영화 2. 배아 일 12.5에서 소주 심근 세포에 S-α -actinin과 액틴 조직의 선정 된 3D 뷰. 그림 6에서 이미지 스택은 피지 이미지 분석 프로그램 내에서 이미지 J 3D 뷰어 플러그인을 사용하여 입체적으로 표현했다. x, y, z 축 주위에 작은 회전이 비교적 심근 그러나 심근 세포 사이의 가장 열악한 내 근원 섬유 배향을 배향 하였다. 작은 회전도 심근 주위의-α-actinin의 부족 심 내막 세포의 근사치를 보여 주었다. 강도 히스토그램 표시 범위 470-800 488 nm에서 561 nm의 레이저 채널 모두 (수 65535 점 만점).

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