이 프로토콜은 유형 I 및 III IFN 발현 시그니처 분석을 위한 고처리량 qRT-PCR 분석을 설명합니다. 이 분석은 이러한 유전자의 매우 유사한 전사체 간의 단일 염기쌍 차이를 구별합니다. 배치 조립 및 로봇 피펫팅을 통해 분석은 일관되고 재현성이 있습니다.
방법 논문
높은 처리량 정량 실시간 RT-PCR 분석 유형 I과 III 인터페론 하위 유형의 발현 양상을 결정하는
이 논문에서
요약
초록
이 보고서에는 매우 특이적인 고정 핵산(LNA) 및 분자 비콘(MB) 프로브, 전사체 표준물질, 자동 다채널 피펫팅 및 플레이트 건조를 통합하는 384웰 플레이트 형식의 17개 인간 IFN 아형을 분석하기 위한 qRT-PCR 분석이 설명되어 있습니다. I형 인터페론(IFN), 특히 12개의 IFN-α 아형 간의 발현을 결정하는 것은 공유된 서열 동일성에 의해 제한됩니다. 마찬가지로, III형 IFN, 특히 IFN-λ2 및 -λ3의 서열은 매우 유사합니다. 이 분석은 17개의 인터페론 아형 전사체의 발현을 분석하기 위한 신뢰할 수 있고 재현 가능하며 상대적으로 저렴한 수단을 제공합니다.
서론
유형 I과 III 인터페론 (IFN)는 모든 척추 동물 1 바이러스 및 기타 병원성 자극와 현재에 대한 면역 반응에 중요하다. 면역 및 비 면역 세포가 응답, IFN이뿐만 아니라, 표현하고 분비한다. 이러한 수신자 같은 수용체 (TLR), 스팅, 그리고 RIG-I 등의 선천성 면역 센서는 병원체 관련 분자 패턴 (PAMP) 3,4 탐지시 타입 I과 III IFN 발현을 유도한다. 인간에서, 내가 IFN 유형은 2,5 복잡한 IFNAR-1 / IFNAR2 수용체에 IFN-β, -ω, -κ 및 IFN-α의 12 하위 유형 및 바인딩을 포함한다. 유형 III IFN은 IFN-λ1, -λ2 및 -λ3을 포함하고 IL10RB / IL28RA 수용체 복합체 (2)에 결합한다. 클래식, 유형 I과 III IFN 다음 STAT1 / STAT2 이종를 모집하고 인터페론 자극 유전자 (ISG) 6의 전사를 시작 각각의 수용체 복합체에 결합한다. ISG 항 바이러스 및 항에서, 함수의 다양한 범위에 관여적응 면역 반응 (7)의 활성화에 증식 활동.
병원체가 회피 파괴 및 IFN 시그널링 경로의 요소를 하이재킹 진화 수많은 메카니즘은 선천성 면역 반응 8 IFN의 중요성을 보여준다. 예를 들어, 우두 바이러스는 야바 같은 질병 바이러스가 I과 III IFN 단백질 (10)를 입력 억제하는 당 단백질을 분비하는 동안 9 IFN 입력 담즙산이 IFNAR-동성와 미끼 수용체를 표현한다. 숙주 방어에서의 역할 외에, IFN 또한 암 감시 및 자동 염증성 질환의 숫자에 연루 유방암 세포에서 IFN의 발현을 사일런 싱 immunosurveillance (11)을 제한, IFN-α의 과잉 생산은 전신의 개발기구는 홍 반성 루푸스 (12), 및 STING의 잘못된 활성화 STING 관련 혈관에 IFN 과도한 양으로 인한 전신 염증에 이르게(13). 치료 적, IFN이 다발성 경화증 (14)을 치료하는 데 사용되며, 이러한 털 세포 백혈병 (18)과 만성 골수성 백혈병 (19) 등의 HBV (15)와 HCV 16, 17, 및 암과 같은 만성 바이러스 성 감염. 특정 생리 학적 과정에서 IFN의 관련성에 대한 질문은 지속적으로이 사이토 카인 가족의 유비쿼터스 특성을 알 수있다.
특히 IFN-α 아형, 종종 하나의 엔티티 20-23로보다는 밀접하게 관련 그룹,하지만 서로 다른 단백질로 간주됩니다 I IFN을 입력합니다. 척추 동물의 진화 (24)에 걸쳐 존재와 IFN-α 서브 타입을 포함하여 여러 IFN 종의 지속성, 이러한 서브 타입의 적어도 일부는 특정 또는 고유 기능을 가지고 있음을 시사한다. 이는 IFN 발현의 패턴 형성 및 해독 아형 (17)의 하나 이상의 특정 기능을 특성화하는 것이 도움이 될 수있다. t 공부의 도전그는 자신의 공유 시퀀스 정체성을 기반으로 I과 III IFN 하위 유형을 입력 : 열두 IFN-α 아형이> 50 % (25)을 공유하고 IFN-λ 아형 자신의 아미노산 서열의 81~96% (26)를 공유 할 수 있습니다. 설명 QRT-PCR 분석에서, 분자 표지 (MB) 및 잠금 핵산 (LNA) 형광 프로브는 매우 유사한 IFN 하위 유형 시퀀스 사이의 단일 염기 쌍의 차이를 구별하고, IFN 식 서명의 특성을 허용. 분석의 384 웰 플레이트 형식은 각각 성적 증명서 사본 번호와 ΔCq에 의한 분석을 가능하게 정량 (전사 기준) 및 반 정량적 (하우스 키핑 유전자 (HKG)) 조치가 모두 포함됩니다. 프라이머 / 프로브 (PR / 납)를 통해 건조 가능한 자동화 된 멀티 채널 피펫 팅하고, 장기 보존에 의해 용이하게 배치 조립체는, 분석의 재현성, 유틸리티, 실용성을 강화 플레이트 상에 설정한다.
이 프로토콜은 프로세스를 설명합니다384 잘 QRT-PCR 분석 플레이트 인간 IFN 서브 타입 (표 1)을 대상으로 최대 17 개국 PR / 납 세트와 (그림 1)의 제조. PR / Pb와 콘텐츠 소스 플레이트 (도 2) 로봇 멀티 채널 피펫을 사용하여 자동화 될 수있는 프로세스에서 여러 분석 384- 웰 플레이트를 제조하기 위해 사용되는 작업 세트. 초기 포커스 인간 IFN 식 서명을 연구하기위한 프로토콜을 만드는 동안,이 방법은 물론 붉은 털 원숭이에 적용되어왔다. 플레이트 레이아웃이 다소 상이하고, PR / 납 세트 (표 2)는 별개이지만, 인간의 붉은 털 플레이트를 만들기위한 전반적인 제조 방법은 동일하다. 프로토콜의 최소의 변경으로, 상기 방법은 밀접하게 관련된 유전자의 다른 그룹을 연구하는 분석법의 개발을 허용하기 위해 수행 될 수있다.
참조 그림 1과 아래 2
표 1 및 표 2를 참조 벨오우
프로토콜
기본 시리얼 희석 1. 준비 (그림 3A)
참고 : PR / 납 세트 대상 시퀀스를 포함 선형화 플라스미드의 직렬 희석 시리즈 QRT-PCR 분석을위한 양적 기준으로 사용됩니다. IFN 서브 타입에 대한 각각의 표준 용액을 희석 세트는 90 분석 판을 실행하기에 충분한 볼륨이 포함되어 있습니다. 검사에 사용 된 희석 표준 곡선의 네 점은 20-32 (표 3)의 범위의 값 CT를 커버하도록 선택된다.
- 해동은, 소용돌이, 그리고 간단히 표준 (50 PM)와 연어 정자 DNA (ssDNA를, 10 ㎎ / ㎖) 원액을 원심 분리기.
- 물 20.3 ㎖로 ssDNA를 51 μl를 혼합하여 17 표준 희석 세트의 ssDNA를 / 물 믹스를 준비합니다.
- 표준 희석 세트에 대해 하나의 8 관 PCR 스트립 레이블.
참고 : 주식 솔루션의 표준 희석액의 제조 2 ~ 3 시간이 소요됩니다. - F에 ssDNA를 / 물 혼합 190 μl를 분배IRST의 스트립 튜브와 나머지 5 개의 튜브에 ssDNA를 / 물 혼합 180 μL.
- 믹스 ssDNA를 / 물 190 μL와 튜브에 50 μM의 표준 재고에서 10 μl를 전송하여 1:20 희석을 수행; 와류 신속하고 PCR 스트립 원심 분리.
- 시리즈의 다음 튜브에 가장 최근에 희석 된 튜브에서 20 μl를 전송하여 1:10의 희석을 수행; 와류 신속하고 PCR 스트립 원심 분리.
- 희석 시리즈의 마지막 튜브까지 단계를 반복 1.6 표준을 받았다.
- 반복 각 표준에 대해 1.3 ~ 1.7 단계를 반복합니다.
아래 표 3 참조
프라이머 / 프로브 (잠 / PB)과 없음 템플릿 제어 2. 준비 (NTC) 근무하는 믹스 (그림 3B)
참고 : 각 1.7 ml의 PR / 납 재고 30 분석 플레이트를 만들 것입니다 재고 믹스 작업 128.6 μL 없음 템플릿 컨트롤 (NTC)를 작업 세트.
- 홍보 / PB가 근무하는 믹스를 설정 준비합니다.
하지E : PR / 납 세트의 준비 및 NTC 근무하는 2 ~ 3 시간 소요됩니다 주식 솔루션에서 혼합합니다.- 스톡 용액의 제조에 대하여 초순수 100 μM의 프라이머 및 프로브를 재현 탁.
- 열일곱 2 ml의 튜브까지 레이블; 분석에 포함 된 각 PR / 납 세트 하나.
- 해동은, 소용돌이, 그리고 간단히 프라이머 (100 μM), 프로브 (100 μM) 및 ssDNA를 (10 ㎎ / ㎖) 원액을 원심 분리기.
- 12.5 μL 전자 멀티 채널 피펫을 사용하여 모든 관에 ssDNA를 2 μl를 추가합니다. 해당 정방향 프라이머를 추가 리버스 프라이머, 각 PR / 납 재고 튜브를 작업 세트에 프로브. 붉은 털 원숭이 PR / 납 세트 인간의 IFN 서브 타입과 표 2를 대상으로 홍보 / PB 세트 표 1을 참조하십시오. 각 홍보의 볼륨을 일정하게 물을 추가 / PB 200 μL에게 주식 튜브를 작업 세트.
주 : 추가의 프라이머, 프로브의 양 및 물 PR / 납의 필요한 최종 반응 농도에 의존설정합니다.
- NTC 근무하는 믹스를 준비합니다.
- NTC 작업 주식에 대한 라벨이 5 튜브 PCR 스트립은 혼합합니다.
- 각 홍보 / PB의 14.3 μL 적절한 NTC 근무하는 혼합 튜브로 설정 전송합니다. NTC 우물에 대한 PR / 납 세트 조합은 표 4를 참조하십시오. NTC 근무하는 각각의 물을 추가 128.6 μL에 최종 볼륨을 가지고 혼합합니다.
- 소용돌이 짧게 원심 분리기, 얼음 또는 장기 저장을 위해 -20 ° C에서 어둠 속에서 튜브를 배치합니다.
아래 표 4 참조
- 홍보 / PB가 작동 주식을 설정 희석.
- 각 홍보 / PB의 최종 볼륨을 가지고 물 1.5 ml의 추가, NTC 근무하는 믹스에 필요한 PR / 납 세트의 분취의 제거를 수행하면 1.7 ml의 재고 튜브를 작업 세트.
- 소용돌이 짧게 원심 분리기, 얼음 또는 장기 저장을 위해 -20 ° C에서 어둠 속에서 튜브를 배치합니다.
- 384 웰 분석 플레이트, 분취에 대한 PR / 납 세트와 NTC 믹스의 96 웰 소스 판을 준비합니다.
참고 : PR / 납 동작 스톡 믹스에서 소스 판의 준비 미만 1 시간이 소요됩니다. 각각의 96- 웰 플레이트 소스 여섯 384- 웰 분석 플레이트 (도 3C)를 만들기에 충분하다.- 간단히 소용돌이 및 홍보 / PB가 작동 주식과 NTC 근무하는 믹스를 설정 원심 분리기.
- 냉장 96 웰 냉각 블록에서 새로운 96 웰 플레이트를 놓고 각 PR / 납 세트의 우물을 지정 또는 NTC는 우물 (그림 2 참조)가 나타납니다 섞는다.
- 250 μL 전자 멀티 채널 피펫을 사용하여 96 웰 플레이트에 물을 추가 모든 홍보에 물을 66 μl를 분배 / PB는 (대상 17 4 우물 제외)도 설정합니다. 4 대상 17 우물에 물 82.5 μl를 분배. 물론 모든 NTC 믹스에 물 27.5 μl를 분배.
- 올바른 PR / (PB)은 96 웰 플레이트의 지정 우물에 주식을 작업 세트 추가 올바른 PR / 납 54 μL가 (대상 17 4 우물 제외) 지정된 PR / 납 세트 우물에 주식을 작업 집합 분배. 대상 (17) 홍보 / PB의 67.5 μl를 분배하면 지정된 대상 17 PR / 납 세트 우물에 주식을 작업 집합. 지정된 우물에 올바른 NTC 근무하는 믹스의 22.5 μl를 추가합니다.
- 콘텐츠 웰의 바닥에 적용되기 위해서는 700 XG에서 1 분 동안 접착 씰 플레이트와 원심 분리기 96- 웰 플레이트 봉쇄.
- 96- 웰 플레이트 어댑터를 사용 볼텍스 믹서에서 96 웰 플레이트를 넣고 1000 rpm에서 1 분 동안 혼합한다. 원심 분리기 700 x g에서 5 분 동안 96 웰 플레이트.
- 같은 날에 사용하는 경우, 그렇지 않으면 사용할 때까지 -20 ℃에서 저장, 4 ° C에서 어둠 속에서 96 - 웰 소스 판을 보관하십시오.
- 자동화 된 멀티 채널 피펫을 사용하여 설정하는 PR / 납을 추가하여 384 웰 분석 플레이트를 준비합니다.
참고 : 96 - 웰 소스 플레이트로부터 6 분석 플레이트의 제조 3 ~ 4 시간이 소요됩니다.- 판을 만들기에 앞서, 4 ° C로 냉각 둥지를 사전 차리고 분당 20~25리터 (LPM) 사이에 불고 공기가 80 ° C에 125 ° C에 판 증발기 하단 열 블록을 미리 가열한다.
- 자동화 된 멀티 채널 피펫에 스위치를 두 번 소프트웨어 아이콘을 클릭하여 IFN 분석 판을 만들기위한 프로토콜을 엽니 다.
- 플랫폼을 설정하려면, 플랫폼 위치 1에서 완전히 전체 피펫 팁 상자를 배치, 위치 4의 96 웰 소스 판, 위치 (6)의 새로운 384 웰 플레이트는 재생 버튼을 눌러 실행을 시작합니다.
참고 : 실행이 완료되면, 각이 잘 홍보 / PB 믹스의 5 μl를 포함합니다.
참고 : ssDNA를의 최종 금액은 384 웰 분석 플레이트의 웰 당 추가 0.025 μg의입니다. - 부드럽게 웰의 바닥에있는 유체를 보장하는 평평한 표면 384- 웰 분석 플레이트를 누르고 접착제를 적용판 인감.
- 원심 분리기 700 x g에서 1 분 동안 접시입니다. 판 드라이어로 384 웰 분석 플레이트를 배치, 접착제 플레이트 씰을 제거하고 우물 바로 위에 384 웰 매니 폴드를 놓습니다.
- 384 웰 분석 플레이트의 내용 건조, 새로운 접착제 플레이트 씰을 적용 할 때, 사용할 때까지 4 ° C에서 어둠 속에서 호일, 레이블 및 저장소에 포장.
주 : 후판 6 개월 이상 4 ℃에서 저장 될 수있다. - 반복 단계는 3.2.3-3.2.6 6 × 때까지 384 웰 분석 플레이트는 준비 또는 96 웰 소스 판의 액체가 거의 소모된다.
- 냉각 둥지를 끄고 소프트웨어를 닫고, 자동화 된 멀티 채널 피펫을 끕니다. 판 건조기의 전원을 끄십시오.
4.로드 및 384 웰 분석 플레이트를 실행
- 잘 HKG, ssDNA를, PCR 마스터 믹스, 물에 대한 PR / 납 세트로 구성 믹스를 두 개의 하우스 키핑 유전자 (HKG)를 준비, (건조 된 384 웰 분석 플레이트에 추가 할 그림 3D).
참고 : 믹스의 준비 및 분석 플레이트를로드하는 것은 1 ~ 2 시간이 소요됩니다. 분석 플레이트를 실행하면보다 2 시간이 소요됩니다.- 각 HKG 믹스 1.5 ML 튜브 레이블.
- 84.9 μL 물 ssDNA를 (10 ㎎ / ㎖)의 2 μl를 희석. 희석 된 ssDNA를 2 μL, 물 11.8 μL, 마스터 믹스 23 μL 및 HKG 홍보 / PR 각 튜브, 소용돌이, 간단히 원심 분리기로 설정 올바른 20 배의 9.2 μl를 추가합니다.
- 인간의 분석에 대한 HKG로 글리 세르 알데히드 -3- 인산 탈수소 효소 (GAPDH)과 유비퀴틴 C (UBC)를 사용 (재료 표 참조). 붉은 털 분석에 대한 HKG로 GAPDH와 18S 리보솜 RNA를 사용합니다.
주 : 상기 분석을 수행하는 데 사용되는 HKG 유연하고 세포 유형에 적합한 유전자를 반영해야 테스트중인 GAPDH, UBC 및 18S는 일반적으로 사용되는 HKG의 예이다. 다른 HKG 더 적합 할 수 있습니다.
- 샘플 및 positi 준비잘 샘플 또는 양성 대조군의 cDNA, 마스터 믹스, 물 구성 믹스를 제어했습니다, 건조 된 384 웰 분석 플레이트에 추가 할 수 있습니다. 샘플을 준비하고 충분한 양의 양성 대조군 믹스 21 판 우물 (그림 3D)에 분배 할 수 있습니다.
- cDNA 합성에 앞서, DNase의 소화 단계 RNA 샘플을 준비하는 제조업체의 지침을 따르십시오.
- 제조업체의 지침을 다음의 RNase H (각 시료 24 μL의 최종 부피)으로 처리하여 RNA의 적어도 500 NG의 cDNA 합성에서 사전에 샘플 및 양성 대조군을 준비합니다. 사용할 때까지 -20 ℃에서 제조 된 cDNA를 저장합니다. 해동은, 소용돌이, 그리고 간단히 샘플의 cDNA를 원심 분리기.
- 마스터 믹스의 78.8 ㎕를 각 24 μL 샘플 및 양성 대조군 튜브에 물 54.8 μl를 추가합니다.
- 간단히 와동 및 원심 분리 튜브.
- 표준을 준비하고 NTC는 물론, 죄수를 혼합마스터 믹스 및 물 sisting은 건조 384- 웰 분석 플레이트 (도 3d)에 첨가한다. 기준을 잘 섞는다를 들어, 1.5 ML 튜브에 마스터 믹스 275 μL에 물 165 μl를 추가합니다. NTC는 잘 섞는다를 들어, 1.5 ML 튜브에 마스터 믹스의 52.5 μL 물 52.5 μl를 추가합니다. 간단히 와동 및 원심 분리 튜브.
- 믹스 및 샘플 로딩 건조 된 384 웰 분석 플레이트를 준비합니다.
- 700 x g에서 1 분간 건조 된 384 웰 분석 4 ° C 접시와 원심 분리기를 제거합니다.
- , 냉장 384 웰 냉각 블록에 접시를 놓고 접착제 플레이트 씰을 제거하고 다양한 믹스 및 샘플 (그림 1) 피펫 될 위치를 지정하는 판의 우물을 설명합니다.
- 표준 잘 믹스, 표준 384 웰 분석 플레이트를로드, NTC는 물론, 샘플, 긍정적 인 제어, HKG 믹스 (그림 3E)을 섞는다. 소용돌이 짧게 원심 분리기 모든 솔루션 플레이트에 분배하기 전에.
- 표준의 6 μL 잘 30 μL 전자 멀티 채널 피펫 각 표준에 잘 혼합 분배. 12.5 μL 전자 멀티 채널 피펫과 잘 지정에 올바른 표준 용액을 희석의 1.5 μl를 분배.
- NTC의 7.5 μL 잘 30 μL 전자 멀티 채널 피펫과 잘 각각 NTC에 혼합 분배. 30 μL 전자 멀티 채널 피펫으로 지정된 우물에 샘플의 7.5 μl를 분배. 12.5 μL 전자 멀티 채널 피펫으로 지정된 우물에 혼합 HKG 홍보 / PB의 2.5 μl를 분배.
- 30 μL 전자 멀티 채널 피펫 남은 물과 마스터 믹스 혼합물의 7.5 μL와 빈 우물을 채우기; 물 7.5 ㎕를 단독으로도 작동합니다.
- 700 × g으로 1 분간 광 접착 필름과 함께 원심 384- 웰 분석 플레이트 봉쇄. 2,600 rpm에서 2 분간 볼텍스 믹서에 밀봉 384- 웰 플레이트 와동및 X g 700에서 5 분 동안 원심 분리.
- , QRT-PCR 기계에 밀봉 된 384 웰 분석 플레이트를 놓고 분석 레이아웃 템플릿을 열고 실행을 시작합니다.
참고 : 결과는 스프레드 시트 또는 분석을 위해 텍스트 파일로 내보낼 수 있습니다. - 분석을 위해 다음과 같은 최적의 유전자 증폭기 반응 조건을 사용하여 : ⅰ) 50 ℃ 2 분, ⅱ) 95 ° C 10 분 동안, III)을 25 초 동안 95 ° C, ⅳ) 1 분 동안 59 ° C. 반복은 40 사이클 III 및 IV 단계를 반복합니다.
- 스프레드 시트 응용 프로그램 소프트웨어에 QRT-PCR 플랫폼에서 원시 데이터를 내 보냅니다. 선형성을 관찰하기위한 표준 곡선으로 설정 한 각 4 점 기준을 그린다. ΔCq을 계산하여 또는 네 개의 점 표준 곡선 (27)에 따라 복사 번호 분석을 수행합니다.
아래 그림 3 참조
결과
QRT-PCR 분석은 세포 유형 및 다양한 상황에서 타입 I IFN 및 III의 발현 패턴을 분석하도록 구현 될 수있는 바와. 예를 들어, 인간의 타입 I IFN 및 III 식 서명 6 공여체 TLR 리간드 자극 된 말초 혈 단핵 세포 (PBMC)에서 분석 하였다; 폴리 I : C (25 ㎍ / ㎖), LPS (10 NG / ㎖), 이미 퀴 모드 (10 μM)과의 CpG 올리고 뉴클레오티드 (1 μM) (도 4). 데이터는 스프레드 시트 애플리케이션 소프트웨어를 사용하여 분석 및 단백질 서열 (27)의 계통에 따라 시계 방향으로 배열 된 IFN-α 아형과 레이더 차트로 제시 하였다. 인간 IFN 발현의 레이더 차트 세이 디자인에 혼입 분석의 두 가지 방법을 사용하여 계산 로그 스케일로 표시된다 : HKG (ΔCq)로 정규화 절대 된 CQ 값, 총 RNA의 마이크로 그램 (μg의) 당 템플릿의 수를 복사 . 카피 수의 값은 O 결과로부터 산출되는 FA 성적표의 표준 곡선. 데이터는 TLR 작용제에 의해 유발되는 인간 IFN 발현 서명 특정 리간드 것을 보여준다.
아래 그림 4 참조
인간 IFN 발현 서명을 알 수 있듯이, 유형의 발현 서명은 붉은 털 원숭이의 I과 III IFN은 특정 TLR 리간드했다. 3 시간 (도 5)을위한 C (50 ㎍ / ㎖), LPS (10 ㎍ / ㎖), 및 이미 퀴 모드 (10 ㎍ / ㎖) : 3 공여자 PBMC 폴리 I로 자극 하였다. 기준에 자극되지 않은 세포에서 IFN 아형 발현은 낮았다. C : IFN-γ 아형의 수에는 제한 LPS 및 폴리 I에 대한 응답으로 표현되었다. 대조적으로, 이미 퀴 모드에 응답하여 IFN 발현 높고 하위 표현식 넓은이었다. 세 TLR (28) 작용제 IFN-β와 IFN-λ1의 발현이 향상되었다.
아래 그림 5 참조
항상 ">
그림 1 :. 열일곱 PR / 납 세트와 384 웰 분석 플레이트의 레이아웃 대상 수는 PR / 납 집합을 의미한다. 네 점 표준 곡선 (어두운 회색 삼각형) 열 1-5에 추가됩니다. HKG PR / 납 세트 (흰색 배경), 컬럼 6, 7 나머지 컬럼에 8-24을 추가 열일곱 PR / 납 세트 중 하나에 특이된다. 샘플은 열 6-24 (검은 색 화살표)에서, 행 AP에 추가됩니다. 열 다섯의 맨 아래에있는 두 개의 우물 (O5, P5 참조)은 물과 마스터 믹스를받을 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 열일곱 PR / 납 집합과 96- 웰 플레이트 소스 레이아웃 대상 번호 PR / Pb를 지칭설정합니다. 홍보 / PB 세트가 여러 우물에 추가 할 때 검은 색 화살표가 나타냅니다. NTC 믹스 지정된 우물 (어두운 회색 배경)에 추가됩니다. 대각선으로 두 개의 우물 (F3, G3)이 사용되지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : QRT-PCR 분석 프로토콜의 특정 단계의 회로도 AE 다이어그램 프로토콜의 부분을 선택합니다.. (A) 단계 1 : 표준 희석액의 제조. (B) 2 단계 : PR / 납 및 NTC 근무하는 믹스의 준비. (C) 단계 3.1 : PR / 납 세트와 NTC 믹스의 96 잘 작동 주식 판의 준비. (D) 단계 4.1-3 : 384 웰 분석 플레이트를로드하는 믹스의 준비. (E) 세인트EP 4.5 : 384 웰 분석 플레이트로드. 다이어그램은 오른쪽 아래 왼쪽 상단에서 읽습니다. 인터페론 (IFN) 분석 용 시약은 -20 ℃로 저장되고, 왼쪽 칸에 표시됩니다; 프로토콜의 행 별도의 조치. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 4 :. 말초 혈 단핵 세포에서 인간 IFN 식 서명 (PBMC)는 TLR 리간드로 자극시키고, RNA는 QRT-PCR 분석을 위해 수확 하였다 자극 PBMC에 사용 TLR 리간드에 대한 응답으로 다르다. 피크 응답의 기하학적 수단은 I를 폴리 : C (25 ㎍ / ㎖) 8 시간 (적색 사각형), LPS (10 NG / ㎖)으로 4 시간 (녹색 삼각형), 이미 퀴 모드 (10 μM)로 16 시간을 연속적으로 ( 자주색 다이아몬드) 소비재 (1 μM)에서16 시간 (검은 색 원), 16 시간에서 비자극 제어 (파란색 원) 6 기증자 (왼쪽) HKG UBC ΔCq의 표현의 함수로 로그 (10) 규모에 표시되거나 RNA의 μg의 당 카피 수로 (오른쪽) . IFN-α 아형 아미노산 서열 유사성의 계통 플롯에 따라 정렬된다. 이 그림은 원래 면역학 및 세포 생물학 (27)에 게재되었다.
그림 5 :. 말초 혈액 단핵 세포에서 붉은 털 원숭이 IFN 식 서명 (PBMC)를 (사각형, 다이아몬드, 그리고 삼각형으로 지정) 세 개의 붉은 털 원숭이에서 자극 PBMC에 사용되는 TLR 리간드에 대한 응답으로 다른 전혈에서 분리하고, C (50 ㎍ / ㎖) 또는 이미 퀴 모드 (10 ㎍ / ㎖) : 리포 폴리 사카 라이드 (LPS) (10 ㎍ / ㎖), 폴리 I로 자극. 세포는 OPE (0 시간에 수확N 모양) 또는 IFN 발현을 측정하는 TLR 자극 (폐쇄 모양의 3 시간) 후. 유형 I, II 및 III IFN의 성적 수준 (왼쪽) HKG GAPDH ΔCq의 표현의 기능 또는 사본 번호 / μg의 RNA를 (오른쪽)로 로그 (10) 규모에 표시됩니다. 이 그림은 원래 인터페론의 저널과 사이토 카인 연구 28 년에 출판되었다.
표 1. 인간 IFN 프라이머 / 프로브 세트 시퀀스 및 반응 정보 이 테이블의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
표 2 :. 히말라야 원숭이 IFN 프라이머 / 프로브 세트 시퀀스 및 반응 정보 이 테이블의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 플라스미드 농도 (FM) | ||||
| B | C | 디 | ||
| IFN-α1 | (25) | 2.5 | 0.25 | 0.025 |
| IFN-α2 | (25) | 2.5 | 0.25 | 0.025 |
| IFN-α4 | 2,500 | (250) | (25) | 2.5 |
| IFN-α5 | (25) | 2.5 | 0.25 | 0.025 |
| IFN-α6 | (250) | (25) | 2.5 | 0.25 |
| IFN-α7 | (250) | (25) | 2.5 | 0.25 |
| IFN-α8 | (250) | (25) | 2.5 | 0.25 |
| IFN-α10 | (25) | 2.5 | 0.25 | 0.025 |
| IFN-α14 | (25) | 2.5 | 0.25 | 0.025 |
| IFN-α16 | (250) | (25) | 2.5 | 0.25 |
| IFN-α17 | (25) | 2.5 | 0.25 | 0.025 |
| IFN-α21 | (25) | 2.5 | 0.25 | 0.025 |
| IFN-λ1 | (25) | 2.5 | 0.25 | 0.025 |
| IFN-λ2 | (25) | 2.5 | 0.25 | 0.025 |
| IFN-λ3 | (250) | (25) | 2.5 | 0.25 |
| IFN-β | (25) | 2.5 | 0.25 | 0.025 |
| IFN-ω | (250) | (25) | 2.5 | 0.25 |
표 3 : 표준 희석 세트 농도 정보를 제공합니다.
| IFN PR / 납 세트 추가 | 물 볼륨 추가 (ML) | |
| NTC 1 | IFN-β, -ω, -λ3 | 85.7 |
| NTC 2 | IFN-α1, -α5 | 100.0 |
| NTC 3 | IFN-α2 | 114.3 |
| NTC 4 | IFN-α4 | 114.3 |
| NTC (5) | IFN-α7 | 114.3 |
| NTC (6) | IFN-α6, -α8, -α10 | 85.7 |
| NTC (7) | IFN-α14, -α16 | 100.0 |
| NTC (8) | IFN-α17 | 114.3 |
| NTC (9) | IFN-α21, -λ1 | 100.0 |
| NTC (10) | IFN-λ2 | 114.3 |
표 4 : NTC 근무하는 정보를 혼합합니다.
토론
이 보고서는 설계, 배치 생산 및 연구 실험실 설정에서 매우 유사한 유전자의 집합의 전사를 측정하기위한 분석의 분석을 향해 접근 방법을 설명합니다. 여기에보고 높은 처리량 QRT-PCR 분석은 IFN-γ 및 측정 - 높은 특이 λ 하위 유형. 이 방법은 두 가지 주요 측면, 상동 유전자 가족의 구성원 및 홍보 / PB 세트가 미리로드 안정적이고 일관성있는 384 웰 분석 판의 제작을위한 생산 플랫폼의 개발을 구별 PR / 납 세트의 디자인을 포함한다. QRT-PCR 프로브는 자신의 특이성 (29)을 강화쪽으로 구조 (MB) 또는 화학 물질 (LNA) 접근 방식을 통합합니다. 서스 분석 (표 2)의 프라이머 세트의 두 들어, 증폭 불응 돌연변이 시스템 (ARMS)은 상기 특이성을 향상 30 프라이머 서열 내로 통합되었다. 그것은 enha에 엑손 - 엑손 접합을 대상으로 가장 좋습니다 동안유형 I 유전자는 인트론이 부족 IFN 때문에 QRT-PCR 반응의 후부 특이성이 가능하였습니다. 따라서, 게놈 DNA를 PCR 반응에서 증폭 할 것이고, 이후에 RNA 추출의 DNase 처리에 의해 분해되어야한다.
PR / 납 세트의 타깃 영역은 각각의 IFN에 대한 성숙 펩티드의 코딩 영역으로 제한되었다. 때문에 IFN-α 아형, 특히 성숙 펩타이드 지역 중 높은 서열의 유사성, 그것은 특이성을 확인하기 위해 감도를 손상 때때로 필요했다. 특히 다른 IFN-α 서브 타입에 비해 성숙한 펩타이드 성적은 네 개의 고유 한 염기가 IFN-α17와 사건이었다. 대상 IFN-α17 프로브 특이성을 제한하는 여러 아형의 성적 증명서를 결합하는 프라이머를 요구했다. 그 결과, PCR 반응시켜 PCR 시약 및 loweri의 상당한 부분을 차지하는만큼, IFN-α17 이외 아형을 증폭 할IFN-α17 대한 특이 적 프로브의 형광 신호의 진폭 겨. 이러한 IFN으로 매우 유사한 유전자 민감하고 특정 PR / 납 세트를 디자인으로 추가 과제는의 GenBank 데이터베이스에 주석 시퀀스는 디자인시 전체 또는 명시되지 않은 다른 항목이있을 수도 있다는 가능성이다. 다시이 새로 주석 서열 완벽 설계시에 데이터베이스의 시퀀스의 버전과 정렬되지 않은에서 IFN-α17위한 도전이었다. 잠을 설계 할 때 따라서 / (PB)은 예의 검토되지 않은 유전자 세트, 주기적으로 표적 유전자의 최신 주석 서열을 확인하는 것이 현명하다. 마지막으로, PR / 납 셋이 전사되지만 번역되지 될 수 가유를 증폭하지 않도록 할 필요가있다.
PR / 납 세트를 설계 한 후, 다음 과제는 17 개국 홍보 / PB의 PCR 조건을 최적화하는 것은 하나의 384 웰 플레이트에 설정합니다. 성적 표준 impor의 아르홍보 / PB 세트의 특이성을 테스트하고 수많은 다른 PCR 반응의 QRT-PCR 조건의 조화를 위해 필수적이 될에 TANT. 성적 기준에 대해 홍보 / PB 세트를 테스트하는 것은 효율성과 감도를 설정; 매우 유사한 발현 유전자를 발현하는 플라스미드 설정 PR / 납 선택적 기능 유전자의 전사를 측정하는 것을 보장 할 필요가있다. 전 사체 수준은 하우스 키핑 유전자 (ΔCq) 내지 반 정량 분석 상대적인 이외에 정량적 분석 수단 (전 사체의 수)를 제공한다.
다중 384- 웰 분석 플레이트로 96 웰 플레이트에서 소스 로봇 멀티 채널 피펫은 정밀도와 플레이트 간 결과의 일관성을 개선한다. 수행이 플레이트에 분주 시약으로 건조 연어 정자 DNA (ssDNA를)를 안정화시키고 장기 기억 PR / 납 세트를 유지 담체로서 사용된다. 플레이트를 건조시켜 또한 반응의 볼륨이 작아결과적으로 귀중한 샘플을 보존하고 비싼 시약의 사용을 감소 재현 가능한 결과, 필요한. 이 단계를 통해, 판의 배치는 6 개월 이상 정밀도와 일관성을 제공하는 조립된다.
판 준비에 따라, 품질 관리 대책은 판의 배치의 일관성을 확인하는 것이 중요하다. 이를 위해, 표준의 추가로 네 세트 접시에 실행됩니다. "5 배 표준"판 성능을 추적하고 개인 판의 표준이 비교되는 데이터 세트를 생성합니다. 각 표준의 열 10 배 희석은 분석 설계시 사용되지만, 공간 고려 네 점은 각각의 분석 플레이트에 표준 곡선에 사용하고, 5 배 표준 플레이트에 대한 것을 요구한다. 또한, 양성 대조군은 플레이트의 무결성을 보장하기 위해 각 플레이트에 포함되어야한다.
일반적으로, 그것은 홍보 / PB의 하나에서 여섯 분석 플레이트를 준비하기 위해 3 ~ 4 시간 소요ource 판; 이 연구 실험실에서 하루에 열두 판을 준비 가능하다. 각 인간 IFN 하위 유형 분석 플레이트 열일곱 PR / 납 세트를 검사하고 다섯 실험 샘플을 수용 할 수 있기 때문에, 어셈블리의 어느 날 3060 실험 데이터 포인트를 생성 할 수있는 능력과 판의 배치를 생산하고 있습니다. QRT-PCR 플랫폼 원시 데이터가 처리 및 자동 분석 미리 디자인 템플릿을 채우기 위해 스프레드 시트 애플리케이션 소프트웨어에서 프로그램 스크립트를 사용하여 조립 될 수있다. 이 방법은 손에 데이터를 입력함으로써 방지 복사 오류를 최소화하고 조사 데이터 분석이 아닌 데이터 어셈블리에 초점을 맞출 수 있습니다. 여기에 설명 된 바와 같이, 높은 처리량이 QRT-PCR 분석은 인간 또는 붉은 털 원숭이 샘플 인터페론 아형의 발현을 측정하는 데 적용 할 수있는 다른 화학 종 또는 상동 유전자 세트를 사용하도록 구성 될 수있다. 플레이트 레이아웃의 유연성은 사용자가 프라이머를 변경할 수 있습니다 / 프로브의 유전자를 맞게 설정특정 세포 유형 또는 모델 시스템을 향한 관심. 이 분석은 면역 반응에 관여하는 신호 전달 메커니즘을 해명 병원체를 연구 세포 배양 모델에서 또는 질병 모델의 컨텍스트의 환자 샘플에서 IFN 식 서명을 측정하기 위해 적용될 수있다.
공개 사항
VPM과 RLR은 IFN 및 IFN 하위 유형의 발현을 측정하고 로열티 수입을 얻는 기술의 공동 발명가입니다. 나머지 저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.
감사의 글
이 작품은 CBER / FDA-NIAID / NIH 부처 간 계약 YI-AI-6153-01, FDA / CBER 교내 자금 및 FDA 의료 대책 이니셔티브에 의해 지원되었다. TCT는, MNB는 VPM은, LMS, 그리고 KDK는 미국 에너지 Departmen과 미국 사이의 부처 간 계약을 통해 과학 교육의 오크 리지 연구소에 의해 관리 생물 의약품 평가 연구 센터의 연구 참여 프로그램에 대한 약속에 의해 지원되었다 식품 의약품 안전청.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 0.2 ml PCR 튜브 스트립 | Eppendorf (Westbury, NY, USA) | E0030 124 286 | |
| 12-channel 384 Equalizer Electronic Pipette, 0.5-12.5 ul | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 14-387-139 | *Discontinued |
| 12-channel 384 Equalizer Electronic Pipette, 1-30 ul | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 14-387-137 | *Discontinued |
| 12-channel Electronic Pipette, 5-250 ul | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 14-387-118 | *중단된 |
| 2.0 ml 마이크로 원심분리기 튜브, 멸균 | Celltreat Scientific Products (Shirley, MA, USA) | 229446 | |
| 8-채널 전자 피펫, 15-1250 ul | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 14-387-115 | *중단된 |
| 일회용 시약 저장고 | VWR International (Radnor, PA, USA) | 89094-668 | 25mL reservoirs with 2 dividers |
| E-Centrifuge | Wealtec Corp. (Sparks, NV, USA) | 1090003 | |
| Eukaryotic 18S rRNA (18S) | Applied Biosystems (Foster City, CA, USA)Hs99999901_s1 | Rhesus HKG Primer/probe set | |
| Fixed Speed Mini Vortexer | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 02-215-360 | |
| 가스 투과성 접착 플레이트 씰 | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | AB-0580 | 플레이트 준비 과정에서 사용되는 일회용 플레이트 씰 |
| Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) | FBR (Silver Spring, MD, USA) | 맞춤형 | 주문 Human HKG Primer/probe set |
| Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) | Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) | Rh02621745_g1 | Rhesus HKG Primer/probe set |
| Hudson Solo 자동 멀티채널 피펫터 | Hudson Robotics (Springfield, NJ, USA) | 800200 | 384-well 냉각 nest로 수정 |
| Linearized plasmids (IFN genes) | Aldevron (Fargo, ND, USA) | Custom Order | Item 3000, 3580; assay standards에 사용됨 |
| LNA 억제제 | Exiqon (Woburn, MA, USA) | 맞춤 주문 | 품목 500100 |
| LNA 프로브 | Sigma-Proligo (St. Louis, MO, USA) | 맞춤 주문 | 재료 번호 VC00023 |
| Matrix Filtered Pipet Tips, 12.5 ul | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 14-387-193 | |
| Matrix Filtered Pipet Tips, 30 ul | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 14-387-196 | |
| Matrix TallTip Extended Length Pipet Tips, 1,250 ul | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 14-387-160 | |
| Matrix TallTip Extended Length Pipet Tips, 250 ul | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 14-387-152 | |
| MicroAmp Optical 384-Well Reaction Plate with Barcode | Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) | 4309849 | |
| MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate | Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) | N8010560 | |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) | 4311971 | qRT-PCR 실행 전에 플레이트를 밀봉하는 데 사용되는 접착 필름; |
| Microsoft Excel 2010 스프레드시트 | Microsoft(미국 워싱턴주 레드몬드) | Office 2010 | Visual Basic 프로그래밍 언어 |
| MixMate Vortex Mixer | Eppendorf (Westbury, NY, USA) | 5353 000.014 | 2차원 플레이트 와류 |
| 장치 Molecular Beacon Probes | FBR (Silver Spring, MD, USA) | 맞춤 주문 | |
| PCR Cooler, 96웰 플레이트 및 PCR 튜브용 얼음 없는 냉장 보관 시스템 | Eppendorf (Westbury, NY, USA) | Z606634-1EA | |
| 플레이트 건조기(매니폴드) | Mechanical and Electrical Design Fabrications, NIH Office of Research Services (Bethesda, MD, USA) | 주문 | |
| 주문 Primer sets | FBR (Silver Spring, MD, USA) | 주문 주문 | |
| pUC57 플라스미드 DNA | Genescript (Piscataway, NJ, USA) | SD1176 | |
| Rnase-Free 1.5 ml Microfuge Tubes | Life Technologies (Grand Island, NY, USA) | AM12400 | |
| RNase-free DNase 세트 (50) | Qiagen (Valencia, CA, USA) | 79254 | |
| RNase H | New England Biolabs (Ipswitch, MA, USA) | M0297L | |
| RNeasy Mini Kit (250) | Qiagen (Valencia, CA, USA) | 74106 | |
| Robot Tips (clear tip pre-sterilized pipet tips) | Hudson Robotics (Springfield, NJ, USA) | 800350-S | |
| Salmon Sperm DNA Solution | Invitrogen (Carlsbad, CA, USA) | 15632-011 | |
| SoftLinx 버전 V | Hudson Robotics (Springfield, NJ, USA) | 주문 | 소프트웨어로 피펫팅 단계 프로그래밍 |
| TaqMan Fast Universal PCR Master Mix (2x), no AmpErase UNG | Life Technologies (Grand Island, NY, USA) | 4352042 | |
| ABgene 접착 플레이트 씰 | Thermo-Fisher Scientific (미국 매사추세츠주 월섬) | AB0580 | |
| Ubiquitin C (UBC) | Applied Biosystems (미국 캘리포니아주 포스터 시티) | Hs01871556_s1 | Human HKG Primer/probe set |
| Verso cDNA synthesis Kit | Thermo-Fisher Scientific (미국 매사추세츠주 월섬) | AB1453B | |
| ViiA 7 Real-Time PCR System | Applied Biosystems (미국 캘리포니아주 포스터 시티) | 4453536 | |
| Water-Ultra Pure | Quality Biological, INC. (미국 메릴랜드주 게이더스버그) | 351-029-101 | |
| Zipvap 384 (플레이트 드라이어 발열체) | Glas-Col LLC (미국 인디애나주 테레호테) | 384-109A | 플레이트 드라이어 |
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