방법 논문

높은 처리량 정량 실시간 RT-PCR 분석 유형 I과 III 인터페론 하위 유형의 발현 양상을 결정하는

DOI:

10.3791/52650

⸱

2015년 3월 24일

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Biologics Evaluation and Research, US Food and Drug Administration, 2Center for Drug Evaluation and Research, US Food and Drug Administration

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 유형 I 및 III IFN 발현 시그니처 분석을 위한 고처리량 qRT-PCR 분석을 설명합니다. 이 분석은 이러한 유전자의 매우 유사한 전사체 간의 단일 염기쌍 차이를 구별합니다. 배치 조립 및 로봇 피펫팅을 통해 분석은 일관되고 재현성이 있습니다.

초록

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이 보고서에는 매우 특이적인 고정 핵산(LNA) 및 분자 비콘(MB) 프로브, 전사체 표준물질, 자동 다채널 피펫팅 및 플레이트 건조를 통합하는 384웰 플레이트 형식의 17개 인간 IFN 아형을 분석하기 위한 qRT-PCR 분석이 설명되어 있습니다. I형 인터페론(IFN), 특히 12개의 IFN-α 아형 간의 발현을 결정하는 것은 공유된 서열 동일성에 의해 제한됩니다. 마찬가지로, III형 IFN, 특히 IFN-λ2 및 -λ3의 서열은 매우 유사합니다. 이 분석은 17개의 인터페론 아형 전사체의 발현을 분석하기 위한 신뢰할 수 있고 재현 가능하며 상대적으로 저렴한 수단을 제공합니다.

서론

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유형 I과 III 인터페론 (IFN)는 모든 척추 동물 1 바이러스 및 기타 병원성 자극와 현재에 대한 면역 반응에 중요하다. 면역 및 비 면역 세포가 응답, IFN이뿐만 아니라, 표현하고 분비한다. 이러한 수신자 같은 수용체 (TLR), 스팅, 그리고 RIG-I 등의 선천성 면역 센서는 병원체 관련 분자 패턴 (PAMP) 3,4 탐지시 타입 I과 III IFN 발현을 유도한다. 인간에서, 내가 IFN 유형은 2,5 복잡한 IFNAR-1 / IFNAR2 수용체에 IFN-β, -ω, -κ 및 IFN-α의 12 하위 유형 및 바인딩을 포함한다. 유형 III IFN은 IFN-λ1, -λ2 및 -λ3을 포함하고 IL10RB / IL28RA 수용체 복합체 (2)에 결합한다. 클래식, 유형 I과 III IFN 다음 STAT1 / STAT2 이종를 모집하고 인터페론 자극 유전자 (ISG) 6의 전사를 시작 각각의 수용체 복합체에 결합한다. ISG 항 바이러스 및 항에서, 함수의 다양한 범위에 관여적응 면역 반응 (7)의 활성화에 증식 활동.

병원체가 회피 파괴 및 IFN 시그널링 경로의 요소를 하이재킹 진화 수많은 메카니즘은 선천성 면역 반응 8 IFN의 중요성을 보여준다. 예를 들어, 우두 바이러스는 야바 같은 질병 바이러스가 I과 III IFN 단백질 (10)를 입력 억제하는 당 단백질을 분비하는 동안 9 IFN 입력 담즙산이 IFNAR-동성와 미끼 수용체를 표현한다. 숙주 방어에서의 역할 외에, IFN 또한 암 감시 및 자동 염증성 질환의 숫자에 연루 유방암 세포에서 IFN의 발현을 사일런 싱 immunosurveillance (11)을 제한, IFN-α의 과잉 생산은 전신의 개발기구는 홍 반성 루푸스 (12), 및 STING의 잘못된 활성화 STING 관련 혈관에 IFN 과도한 양으로 인한 전신 염증에 이르게(13). 치료 적, IFN이 다발성 경화증 (14)을 치료하는 데 사용되며, 이러한 털 세포 백혈병 (18)과 만성 골수성 백혈병 (19) 등의 HBV (15)와 HCV 16, 17, 및 암과 같은 만성 바이러스 성 감염. 특정 생리 학적 과정에서 IFN의 관련성에 대한 질문은 지속적으로이 사이토 카인 가족의 유비쿼터스 특성을 알 수있다.

특히 IFN-α 아형, 종종 하나의 엔티티 20-23로보다는 밀접하게 관련 그룹,하지만 서로 다른 단백질로 간주됩니다 I IFN을 입력합니다. 척추 동물의 진화 (24)에 걸쳐 존재와 IFN-α 서브 타입을 포함하여 여러 IFN 종의 지속성, 이러한 서브 타입의 적어도 일부는 특정 또는 고유 기능을 가지고 있음을 시사한다. 이는 IFN 발현의 패턴 형성 및 해독 아형 (17)의 하나 이상의 특정 기능을 특성화하는 것이 도움이 될 수있다. t 공부의 도전그는 자신의 공유 시퀀스 정체성을 기반으로 I과 III IFN 하위 유형을 입력 : 열두 IFN-α 아형이> 50 % (25)을 공유하고 IFN-λ 아형 자신의 아미노산 서열의 81~96% (26)를 공유 할 수 있습니다. 설명 QRT-PCR 분석에서, 분자 표지 (MB) 및 잠금 핵산 (LNA) 형광 프로브는 매우 유사한 IFN 하위 유형 시퀀스 사이의 단일 염기 쌍의 차이를 구별하고, IFN 식 서명의 특성을 허용. 분석의 384 웰 플레이트 형식은 각각 성적 증명서 사본 번호와 ΔCq에 의한 분석을 가능하게 정량 (전사 기준) 및 반 정량적 (하우스 키핑 유전자 (HKG)) 조치가 모두 포함됩니다. 프라이머 / 프로브 (PR / 납)를 통해 건조 가능한 자동화 된 멀티 채널 피펫 팅하고, 장기 보존에 의해 용이하게 배치 조립체는, 분석의 재현성, 유틸리티, 실용성을 강화 플레이트 상에 설정한다.

이 프로토콜은 프로세스를 설명합니다384 잘 QRT-PCR 분석 플레이트 인간 IFN 서브 타입 (표 1)을 대상으로 최대 17 개국 PR / 납 세트와 (그림 1)의 제조. PR / Pb와 콘텐츠 소스 플레이트 (도 2) 로봇 멀티 채널 피펫을 사용하여 자동화 될 수있는 프로세스에서 여러 분석 384- 웰 플레이트를 제조하기 위해 사용되는 작업 세트. 초기 포커스 인간 IFN 식 서명을 연구하기위한 프로토콜을 만드는 동안,이 방법은 물론 붉은 털 원숭이에 적용되어왔다. 플레이트 레이아웃이 다소 상이하고, PR / 납 세트 (표 2)는 별개이지만, 인간의 붉은 털 플레이트를 만들기위한 전반적인 제조 방법은 동일하다. 프로토콜의 최소의 변경으로, 상기 방법은 밀접하게 관련된 유전자의 다른 그룹을 연구하는 분석법의 개발을 허용하기 위해 수행 될 수있다.

참조 그림 1과 아래 2

표 1 및 표 2를 참조 벨오우

프로토콜

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

기본 시리얼 희석 1. 준비 (그림 3A)

참고 : PR / 납 세트 대상 시퀀스를 포함 선형화 플라스미드의 직렬 희석 시리즈 QRT-PCR 분석을위한 양적 기준으로 사용됩니다. IFN 서브 타입에 대한 각각의 표준 용액을 희석 세트는 90 분석 판을 실행하기에 충분한 볼륨이 포함되어 있습니다. 검사에 사용 된 희석 표준 곡선의 네 점은 20-32 (표 3)의 범위의 값 CT를 커버하도록 선택된다.

  1. 해동은, 소용돌이, 그리고 간단히 표준 (50 PM)와 연어 정자 DNA (ssDNA를, 10 ㎎ / ㎖) 원액을 원심 분리기.
  2. 물 20.3 ㎖로 ssDNA를 51 μl를 혼합하여 17 표준 희석 세트의 ssDNA를 / 물 믹스를 준비합니다.
  3. 표준 희석 세트에 대해 하나의 8 관 PCR 스트립 레이블.
    참고 : 주식 솔루션의 표준 희석액의 제조 2 ~ 3 시간이 소요됩니다.
  4. F에 ssDNA를 / 물 혼합 190 μl를 분배IRST의 스트립 튜브와 나머지 5 개의 튜브에 ssDNA를 / 물 혼합 180 μL.
  5. 믹스 ssDNA를 / 물 190 μL와 튜브에 50 μM의 표준 재고에서 10 μl를 전송하여 1:20 희석을 수행; 와류 신속하고 PCR 스트립 원심 분리.
  6. 시리즈의 다음 튜브에 가장 최근에 희석 된 튜브에서 20 μl를 전송하여 1:10의 희석을 수행; 와류 신속하고 PCR 스트립 원심 분리.
  7. 희석 시리즈의 마지막 튜브까지 단계를 반복 1.6 표준을 받았다.
  8. 반복 각 표준에 대해 1.3 ~ 1.7 단계를 반복합니다.

아래 표 3 참조

프라이머 / 프로브 (잠 / PB)과 없음 템플릿 제어 2. 준비 (NTC) 근무하는 믹스 (그림 3B)

참고 : 각 1.7 ml의 PR / 납 재고 30 분석 플레이트를 만들 것입니다 재고 믹스 작업 128.6 μL 없음 템플릿 컨트롤 (NTC)를 작업 세트.

  1. 홍보 / PB가 근무하는 믹스를 설정 준비합니다.
    하지E : PR / 납 세트의 준비 및 NTC 근무하는 2 ~ 3 시간 소요됩니다 주식 솔루션에서 혼합합니다.
    1. 스톡 용액의 제조에 대하여 초순수 100 μM의 프라이머 및 프로브를 재현 탁.
    2. 열일곱 2 ml의 튜브까지 레이블; 분석에 포함 된 각 PR / 납 세트 하나.
    3. 해동은, 소용돌이, 그리고 간단히 프라이머 (100 μM), 프로브 (100 μM) 및 ssDNA를 (10 ㎎ / ㎖) 원액을 원심 분리기.
    4. 12.5 μL 전자 멀티 채널 피펫을 사용하여 모든 관에 ssDNA를 2 μl를 추가합니다. 해당 정방향 프라이머를 추가 리버스 프라이머, 각 PR / 납 재고 튜브를 작업 세트에 프로브. 붉은 털 원숭이 PR / 납 세트 인간의 IFN 서브 타입과 표 2를 대상으로 홍보 / PB 세트 표 1을 참조하십시오. 각 홍보의 볼륨을 일정하게 물을 추가 / PB 200 μL에게 주식 튜브를 작업 세트.
      주 : 추가의 프라이머, 프로브의 양 및 물 PR / 납의 필요한 최종 반응 농도에 의존설정합니다.
  2. NTC 근무하는 믹스를 준비합니다.
    1. NTC 작업 주식에 대한 라벨이 5 튜브 PCR 스트립은 혼합합니다.
    2. 각 홍보 / PB의 14.3 μL 적절한 NTC 근무하는 혼합 튜브로 설정 전송합니다. NTC 우물에 대한 PR / 납 세트 조합은 표 4를 참조하십시오. NTC 근무하는 각각의 물을 추가 128.6 μL에 최종 볼륨을 가지고 혼합합니다.
    3. 소용돌이 짧게 원심 분리기, 얼음 또는 장기 저장을 위해 -20 ° C에서 어둠 속에서 튜브를 배치합니다.

아래 표 4 참조

  1. 홍보 / PB가 작동 주식을 설정 희석.
    1. 각 홍보 / PB의 최종 볼륨을 가지고 물 1.5 ml의 추가, NTC 근무하는 믹스에 필요한 PR / 납 세트의 분취의 제거를 수행하면 1.7 ml의 재고 튜브를 작업 세트.
    2. 소용돌이 짧게 원심 분리기, 얼음 또는 장기 저장을 위해 -20 ° C에서 어둠 속에서 튜브를 배치합니다.
3. 자동화 된 멀티 채널 피펫을 사용하여 384 개 웰 분석 플레이트의 제조

  1. 384 웰 분석 플레이트, 분취에 대한 PR / 납 세트와 NTC 믹스의 96 웰 소스 판을 준비합니다.
    참고 : PR / 납 동작 스톡 믹스에서 소스 판의 준비 미만 1 시간이 소요됩니다. 각각의 96- 웰 플레이트 소스 여섯 384- 웰 분석 플레이트 (도 3C)를 만들기에 충분하다.
    1. 간단히 소용돌이 및 홍보 / PB가 작동 주식과 NTC 근무하는 믹스를 설정 원심 분리기.
    2. 냉장 96 웰 냉각 블록에서 새로운 96 웰 플레이트를 놓고 각 PR / 납 세트의 우물을 지정 또는 NTC는 우물 (그림 2 참조)가 나타납니다 섞는다.
    3. 250 μL 전자 멀티 채널 피펫을 사용하여 96 웰 플레이트에 물을 추가 모든 홍보에 물을 66 μl를 분배 / PB는 (대상 17 4 우물 제외)도 설정합니다. 4 대상 17 우물에 물 82.5 μl를 분배. 물론 모든 NTC 믹스에 물 27.5 μl를 분배.
    4. 올바른 PR / (PB)은 96 웰 플레이트의 지정 우물에 주식을 작업 세트 추가 올바른 PR / 납 54 μL가 (대상 17 4 우물 제외) 지정된 PR / 납 세트 우물에 주식을 작업 집합 분배. 대상 (17) 홍보 / PB의 67.5 μl를 분배하면 지정된 대상 17 PR / 납 세트 우물에 주식을 작업 집합. 지정된 우물에 올바른 NTC 근무하는 믹스의 22.5 μl를 추가합니다.
    5. 콘텐츠 웰의 바닥에 적용되기 위해서는 700 XG에서 1 분 동안 접착 씰 플레이트와 원심 분리기 96- 웰 플레이트 봉쇄.
    6. 96- 웰 플레이트 어댑터를 사용 볼텍스 믹서에서 96 웰 플레이트를 넣고 1000 rpm에서 1 분 동안 혼합한다. 원심 분리기 700 x g에서 5 분 동안 96 웰 플레이트.
    7. 같은 날에 사용하는 경우, 그렇지 않으면 사용할 때까지 -20 ℃에서 저장, 4 ° C에서 어둠 속에서 96 - 웰 소스 판을 보관하십시오.
  2. 자동화 된 멀티 채널 피펫을 사용하여 설정하는 PR / 납을 추가하여 384 웰 분석 플레이트를 준비합니다.
    참고 : 96 - 웰 소스 플레이트로부터 6 분석 플레이트의 제조 3 ~ 4 시간이 소요됩니다.
    1. 판을 만들기에 앞서, 4 ° C로 냉각 둥지를 사전 차리고 분당 20~25리터 (LPM) 사이에 불고 공기가 80 ° C에 125 ° C에 판 증발기 하단 열 블록을 미리 가열한다.
    2. 자동화 된 멀티 채널 피펫에 스위치를 두 번 소프트웨어 아이콘을 클릭하여 IFN 분석 판을 만들기위한 프로토콜을 엽니 다.
    3. 플랫폼을 설정하려면, 플랫폼 위치 1에서 완전히 전체 피펫 팁 상자를 배치, 위치 4의 96 웰 소스 판, 위치 (6)의 새로운 384 웰 플레이트는 재생 버튼을 눌러 실행을 시작합니다.
      참고 : 실행이 완료되면, 각이 잘 홍보 / PB 믹스의 5 μl를 포함합니다.
      참고 : ssDNA를의 최종 금액은 384 웰 분석 플레이트의 웰 당 추가 0.025 μg의입니다.
    4. 부드럽게 웰의 바닥에있는 유체를 보장하는 평평한 표면 384- 웰 분석 플레이트를 누르고 접착제를 적용판 인감.
    5. 원심 분리기 700 x g에서 1 분 동안 접시입니다. 판 드라이어로 384 웰 분석 플레이트를 배치, 접착제 플레이트 씰을 제거하고 우​​물 바로 위에 384 웰 매니 폴드를 놓습니다.
    6. 384 웰 분석 플레이트의 내용 건조, 새로운 접착제 플레이트 씰을 적용 할 때, 사용할 때까지 4 ° C에서 어둠 속에서 호일, 레이블 및 저장소에 포장.
      주 : 후판 6 개월 이상 4 ℃에서 저장 될 수있다.
    7. 반복 단계는 3.2.3-3.2.6 6 × 때까지 384 웰 분석 플레이트는 준비 또는 96 웰 소스 판의 액체가 거의 소모된다.
    8. 냉각 둥지를 끄고 소프트웨어를 닫고, 자동화 된 멀티 채널 피펫을 끕니다. 판 건조기의 전원을 끄십시오.

4.로드 및 384 웰 분석 플레이트를 실행

  1. 잘 HKG, ssDNA를, PCR 마스터 믹스, 물에 대한 PR / 납 세트로 구성 믹스를 두 개의 하우스 키핑 유전자 (HKG)를 준비, (건조 된 384 웰 분석 플레이트에 추가 할 그림 3D).
    참고 : 믹스의 준비 및 분석 플레이트를로드하는 것은 1 ~ 2 시간이 소요됩니다. 분석 플레이트를 실행하면보다 2 시간이 소요됩니다.
    1. 각 HKG 믹스 1.5 ML 튜브 레이블.
    2. 84.9 μL 물 ssDNA를 (10 ㎎ / ㎖)의 2 μl를 희석. 희석 된 ssDNA를 2 μL, 물 11.8 μL, 마스터 믹스 23 μL 및 HKG 홍보 / PR 각 튜브, 소용돌이, 간단히 원심 분리기로 설정 올바른 20 배의 9.2 μl를 추가합니다.
    3. 인간의 분석에 대한 HKG로 글리 세르 알데히드 -3- 인산 탈수소 효소 (GAPDH)과 유비퀴틴 C (UBC)를 사용 (재료 표 참조). 붉은 털 분석에 대한 HKG로 GAPDH와 18S 리보솜 RNA를 사용합니다.
      주 : 상기 분석을 수행하는 데 사용되는 HKG 유연하고 세포 유형에 적합한 유전자를 반영해야 테스트중인 GAPDH, UBC 및 18S는 일반적으로 사용되는 HKG의 예이다. 다른 HKG 더 적합 할 수 있습니다.
  2. 샘플 및 positi 준비잘 샘플 또는 양성 대조군의 cDNA, 마스터 믹스, 물 구성 믹스를 제어했습니다, 건조 된 384 웰 분석 플레이트에 추가 할 수 있습니다. 샘플을 준비하고 충분한 양의 양성 대조군 믹스 21 판 우물 (그림 3D)에 분배 할 수 있습니다.
    1. cDNA 합성에 앞서, DNase의 소화 단계 RNA 샘플을 준비하는 제조업체의 지침을 따르십시오.
    2. 제조업체의 지침을 다음의 RNase H (각 시료 24 μL의 최종 부피)으로 처리하여 RNA의 적어도 500 NG의 cDNA 합성에서 사전에 샘플 및 양성 대조군을 준비합니다. 사용할 때까지 -20 ℃에서 제조 된 cDNA를 저장합니다. 해동은, 소용돌이, 그리고 간단히 샘플의 cDNA를 원심 분리기.
    3. 마스터 믹스의 78.8 ㎕를 각 24 μL 샘플 및 양성 대조군 튜브에 물 54.8 μl를 추가합니다.
    4. 간단히 와동 및 원심 분리 튜브.
  3. 표준을 준비하고 NTC는 물론, 죄수를 혼합마스터 믹스 및 물 sisting은 건조 384- 웰 분석 플레이트 (도 3d)에 첨가한다. 기준을 잘 섞는다를 들어, 1.5 ML 튜브에 마스터 믹스 275 μL에 물 165 μl를 추가합니다. NTC는 잘 섞는다를 들어, 1.5 ML 튜브에 마스터 믹스의 52.5 μL 물 52.5 μl를 추가합니다. 간단히 와동 및 원심 분리 튜브.
  4. 믹스 및 샘플 로딩 건조 된 384 웰 분석 플레이트를 준비합니다.
    1. 700 x g에서 1 분간 건조 된 384 웰 분석 4 ° C 접시와 원심 분리기를 제거합니다.
    2. , 냉장 384 웰 냉각 블록에 접시를 놓고 접착제 플레이트 씰을 제거하고 다양한 믹스 및 샘플 (그림 1) 피펫 될 위치를 지정하는 판의 우물을 설명합니다.
  5. 표준 잘 믹스, 표준 384 웰 분석 플레이트를로드, NTC는 물론, 샘플, 긍정적 인 제어, HKG 믹스 (그림 3E)을 섞는다. 소용돌이 짧게 원심 분리기 모든 솔루션 플레이트에 분배하기 전에.
    1. 표준의 6 μL 잘 30 μL 전자 멀티 채널 피펫 각 표준에 잘 혼합 분배. 12.5 μL 전자 멀티 채널 피펫과 잘 지정에 올바른 표준 용액을 희석의 1.5 μl를 분배.
    2. NTC의 7.5 μL 잘 30 μL 전자 멀티 채널 피펫과 잘 각각 NTC에 혼합 분배. 30 μL 전자 멀티 채널 피펫으로 지정된 우물에 샘플의 7.5 μl를 분배. 12.5 μL 전자 멀티 채널 피펫으로 지정된 우물에 혼합 HKG 홍보 / PB의 2.5 μl를 분배.
    3. 30 μL 전자 멀티 채널 피펫 남은 물과 마스터 믹스 혼합물의 7.5 μL와 빈 우물을 채우기; 물 7.5 ㎕를 단독으로도 작동합니다.
    4. 700 × g으로 1 분간 광 접착 필름과 함께 원심 384- 웰 분석 플레이트 봉쇄. 2,600 rpm에서 2 분간 볼텍스 믹서에 밀봉 384- 웰 플레이트 와동및 X g 700에서 5 분 동안 원심 분리.
    5. , QRT-PCR 기계에 밀봉 된 384 웰 분석 플레이트를 놓고 분석 레이아웃 템플릿을 열고 실행을 시작합니다.
      참고 : 결과는 스프레드 시트 또는 분석을 위해 텍스트 파일로 내보낼 수 있습니다.
    6. 분석을 위해 다음과 같은 최적의 유전자 증폭기 반응 조건을 사용하여 : ⅰ) 50 ℃ 2 분, ⅱ) 95 ° C 10 분 동안, III)을 25 초 동안 95 ° C, ⅳ) 1 분 동안 59 ° C. 반복은 40 사이클 III 및 IV 단계를 반복합니다.
    7. 스프레드 시트 응용 프로그램 소프트웨어에 QRT-PCR 플랫폼에서 원시 데이터를 내 보냅니다. 선형성을 관찰하기위한 표준 곡선으로 설정 한 각 4 점 기준을 그린다. ΔCq을 계산하여 또는 네 개의 점 표준 곡선 (27)에 따라 복사 번호 분석을 수행합니다.

아래 그림 3 참조

결과

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QRT-PCR 분석은 세포 유형 및 다양한 상황에서 타입 I IFN 및 III의 발현 패턴을 분석하도록 구현 될 수있는 바와. 예를 들어, 인간의 타입 I IFN 및 III 식 서명 6 공여체 TLR 리간드 자극 된 말초 혈 단핵 세포 (PBMC)에서 분석 하였다; 폴리 I : C (25 ㎍ / ㎖), LPS (10 NG / ㎖), 이미 퀴 모드 (10 μM)과의 CpG 올리고 뉴클레오티드 (1 μM) (도 4). 데이터는 스프레드 시트 애플리케이션 소프트웨어를 사용하여 분석 및 단백질 서열 (27)의 계통에 따라 시계 방향으로 배열 된 IFN-α 아형과 레이더 차트로 제시 하였다. 인간 IFN 발현의 레이더 차트 세이 디자인에 혼입 분석의 두 가지 방법을 사용하여 계산 로그 스케일로 표시된다 : HKG (ΔCq)로 정규화 절대 된 CQ 값, 총 RNA의 마이크로 그램 (μg의) 당 템플릿의 수를 복사 . 카피 수의 값은 O 결과로부터 산출되는 FA 성적표의 표준 곡선. 데이터는 TLR 작용제에 의해 유발되는 인간 IFN 발현 서명 특정 리간드 것을 보여준다.

아래 그림 4 참조

인간 IFN 발현 서명을 알 수 있듯이, 유형의 발현 서명은 붉은 털 원숭이의 I과 III IFN은 특정 TLR 리간드했다. 3 시간 (도 5)을위한 C (50 ㎍ / ㎖), LPS (10 ㎍ / ㎖), 및 이미 퀴 모드 (10 ㎍ / ㎖) : 3 공여자 PBMC 폴리 I로 자극 하였다. 기준에 자극되지 않은 세포에서 IFN 아형 발현은 낮았다. C : IFN-γ 아형의 수에는 제한 LPS 및 폴리 I에 대한 응답으로 표현되었다. 대조적으로, 이미 퀴 모드에 응답하여 IFN 발현 높고 하위 표현식 넓은이었다. 세 TLR (28) 작용제 IFN-β와 IFN-λ1의 발현이 향상되었다.

아래 그림 5 참조

항상 "> figure-results-1
그림 1 :. 열일곱 PR / 납 세트와 384 웰 분석 플레이트의 레이아웃 대상 수는 PR / 납 집합을 의미한다. 네 점 표준 곡선 (어두운 회색 삼각형) 열 1-5에 추가됩니다. HKG PR / 납 세트 (흰색 배경), 컬럼 6, 7 나머지 컬럼에 8-24을 추가 열일곱 PR / 납 세트 중 하나에 특이된다. 샘플은 열 6-24 (검은 색 화살표)에서, 행 AP에 추가됩니다. 열 다섯의 맨 아래에있는 두 개의 우물 (O5, P5 참조)은 물과 마스터 믹스를받을 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 2. 열일곱 PR / 납 집합과 96- 웰 플레이트 소스 레이아웃 대상 번호 PR / Pb를 지칭설정합니다. 홍보 / PB 세트가 여러 우물에 추가 할 때 검은 색 화살표가 나타냅니다. NTC 믹스 지정된 우물 (어두운 회색 배경)에 추가됩니다. 대각선으로 두 개의 우물 (F3, G3)이 사용되지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 3 : QRT-PCR 분석 프로토콜의 특정 단계의 회로도 AE 다이어그램 프로토콜의 부분을 선택합니다.. (A) 단계 1 : 표준 희석액의 제조. (B) 2 단계 : PR / 납 및 NTC 근무하는 믹스의 준비. (C) 단계 3.1 : PR / 납 세트와 NTC 믹스의 96 잘 작동 주식 판의 준비. (D) 단계 4.1-3 : 384 웰 분석 플레이트를로드하는 믹스의 준비. (E) 세인트EP 4.5 : 384 웰 분석 플레이트로드. 다이어그램은 오른쪽 아래 왼쪽 상단에서 읽습니다. 인터페론 (IFN) 분석 용 시약은 -20 ℃로 저장되고, 왼쪽 칸에 표시됩니다; 프로토콜의 행 별도의 조치. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-4
도 4 :. 말초 혈 단핵 세포에서 인간 IFN 식 서명 (PBMC)는 TLR 리간드로 자극시키고, RNA는 QRT-PCR 분석을 위해 수확 하였다 자극 PBMC에 사용 TLR 리간드에 대한 응답으로 다르다. 피크 응답의 기하학적 수단은 I를 폴리 : C (25 ㎍ / ㎖) 8 시간 (적색 사각형), LPS (10 NG / ㎖)으로 4 시간 (녹색 삼각형), 이미 퀴 모드 (10 μM)로 16 시간을 연속적으로 ( 자주색 다이아몬드) 소비재 (1 μM)에서16 시간 (검은 색 원), 16 시간에서 비자극 제어 (파란색 원) 6 기증자 (왼쪽) HKG UBC ΔCq의 표현의 함수로 로그 (10) 규모에 표시되거나 RNA의 μg의 당 카피 수로 (오른쪽) . IFN-α 아형 아미노산 서열 유사성의 계통 플롯에 따라 정렬된다. 이 그림은 원래 면역학 및 세포 생물학 (27)에 게재되었다.

figure-results-5
그림 5 :. 말초 혈액 단핵 세포에서 붉은 털 원숭이 IFN 식 서명 (PBMC)를 (사각형, 다이아몬드, 그리고 삼각형으로 지정) 세 개의 붉은 털 원숭이에서 자극 PBMC에 사용되는 TLR 리간드에 대한 응답으로 다른 전혈에서 분리하고, C (50 ㎍ / ㎖) 또는 이미 퀴 모드 (10 ㎍ / ㎖) : 리포 폴리 사카 라이드 (LPS) (10 ㎍ / ㎖), 폴리 I로 자극. 세포는 OPE (0 시간에 수확N 모양) 또는 IFN 발현을 측정하는 TLR 자극 (폐쇄 모양의 3 시간) 후. 유형 I, II 및 III IFN의 성적 수준 (왼쪽) HKG GAPDH ΔCq의 표현의 기능 또는 사본 번호 / μg의 RNA를 (오른쪽)로 로그 (10) 규모에 표시됩니다. 이 그림은 원래 인터페론의 저널과 사이토 카인 연구 28 년에 출판되었다.

figure-results-6
표 1. 인간 IFN 프라이머 / 프로브 세트 시퀀스 및 반응 정보 이 테이블의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-7
표 2 :. 히말라야 원숭이 IFN 프라이머 / 프로브 세트 시퀀스 및 반응 정보 이 테이블의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

플라스미드 농도 (FM)
B C 디
IFN-α1 (25) 2.5 0.25 0.025
IFN-α2 (25) 2.5 0.25 0.025
IFN-α4 2,500 (250) (25) 2.5
IFN-α5 (25) 2.5 0.25 0.025
IFN-α6 (250) (25) 2.5 0.25
IFN-α7 (250) (25) 2.5 0.25
IFN-α8 (250) (25) 2.5 0.25
IFN-α10 (25) 2.5 0.25 0.025
IFN-α14 (25) 2.5 0.25 0.025
IFN-α16 (250) (25) 2.5 0.25
IFN-α17 (25) 2.5 0.25 0.025
IFN-α21 (25) 2.5 0.25 0.025
IFN-λ1 (25) 2.5 0.25 0.025
IFN-λ2 (25) 2.5 0.25 0.025
IFN-λ3 (250) (25) 2.5 0.25
IFN-β (25) 2.5 0.25 0.025
IFN-ω (250) (25) 2.5 0.25

표 3 : 표준 희석 세트 농도 정보를 제공합니다.

IFN PR / 납 세트 추가 물 볼륨 추가 (ML)
NTC 1 IFN-β, -ω, -λ3 85.7
NTC 2 IFN-α1, -α5 100.0
NTC 3 IFN-α2 114.3
NTC 4 IFN-α4 114.3
NTC (5) IFN-α7 114.3
NTC (6) IFN-α6, -α8, -α10 85.7
NTC (7) IFN-α14, -α16 100.0
NTC (8) IFN-α17 114.3
NTC (9) IFN-α21, -λ1 100.0
NTC (10) IFN-λ2 114.3

표 4 : NTC 근무하는 정보를 혼합합니다.

토론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 보고서는 설계, 배치 생산 및 연구 실험실 설정에서 매우 유사한 유전자의 집합의 전사를 측정하기위한 분석의 분석을 향해 접근 방법을 설명합니다. 여기에보고 높은 처리량 QRT-PCR 분석은 IFN-γ 및 측정 - 높은 특이 λ 하위 유형. 이 방법은 두 가지 주요 측면, 상동 유전자 가족의 구성원 및 홍보 / PB 세트가 미리로드 안정적이고 일관성있는 384 웰 분석 판의 제작을위한 생산 플랫폼의 개발을 구별 PR / 납 세트의 디자인을 포함한다. QRT-PCR 프로브는 자신의 특이성 (29)을 강화쪽으로 구조 (MB) 또는 화학 물질 (LNA) 접근 방식을 통합합니다. 서스 분석 (표 2)의 프라이머 세트의 두 들어, 증폭 불응 돌연변이 시스템 (ARMS)은 상기 특이성을 향상 30 프라이머 서열 내로 통합되었다. 그것은 enha에 엑손 - 엑​​손 접합을 대상으로 가장 좋습니다 동안유형 I 유전자는 인트론이 부족 IFN 때문에 QRT-PCR 반응의 후부 특이성이 가능하였습니다. 따라서, 게놈 DNA를 PCR 반응에서 증폭 할 것이고, 이후에 RNA 추출의 DNase 처리에 의해 분해되어야한다.

PR / 납 세트의 타깃 영역은 각각의 IFN에 대한 성숙 펩티드의 코딩 영역으로 제한되었다. 때문에 IFN-α 아형, 특히 성숙 펩타이드 지역 중 높은 서열의 유사성, 그것은 특이성을 확인하기 위해 감도를 손상 때때로 필요했다. 특히 다른 IFN-α 서브 타입에 비해 성숙한 펩타이드 성적은 네 개의 고유 한 염기가 IFN-α17와 사건이었다. 대상 IFN-α17 프로브 특이성을 제한하는 여러 아형의 성적 증명서를 결합하는 프라이머를 요구했다. 그 결과, PCR 반응시켜 PCR 시약 및 loweri의 상당한 부분을 차지하는만큼, IFN-α17 이외 아형을 증폭 할IFN-α17 대한 특이 적 프로브의 형광 신호의 진폭 겨. 이러한 IFN으로 매우 유사한 유전자 민감하고 특정 PR / 납 세트를 디자인으로 추가 과제는의 GenBank 데이터베이스에 주석 시퀀스는 디자인시 전체 또는 명시되지 않은 다른 항목이있을 수도 있다는 가능성이다. 다시이 새로 주석 서열 완벽 설계시에 데이터베이스의 시퀀스의 버전과 정렬되지 않은에서 IFN-α17위한 도전이었다. 잠을 설계 할 때 따라서 / (PB)은 예의 검토되지 않은 유전자 세트, 주기적으로 표적 유전자의 최신 주석 서열을 확인하는 것이 현명하다. 마지막으로, PR / 납 셋이 전사되지만 번역되지 될 수 가유를 증폭하지 않도록 할 필요가있다.

PR / 납 세트를 설계 한 후, 다음 과제는 17 개국 홍보 / PB의 PCR 조건을 최적화하는 것은 하나의 384 웰 플레이트에 설정합니다. 성적 표준 impor의 아르홍보 / PB 세트의 특이성을 테스트하고 수많은 다른 PCR 반응의 QRT-PCR 조건의 조화를 위해 필수적이 될에 TANT. 성적 기준에 대해 홍보 / PB 세트를 테스트하는 것은 효율성과 감도를 설정; 매우 유사한 발현 유전자를 발현하는 플라스미드 설정 PR / 납 선택적 기능 유전자의 전사를 측정하는 것을 보장 할 필요가있다. 전 사체 수준은 하우스 키핑 유전자 (ΔCq) 내지 반 정량 분석​​ 상대적인 이외에 정량적 분석 수단 (전 사체의 수)를 제공한다.

다중 384- 웰 분석 플레이트로 96 웰 플레이트에서 소스 로봇 멀티 채널 피펫은 정밀도와 플레이트 간 결과의 일관성을 개선한다. 수행이 플레이트에 분주 시약으로 건조 연어 정자 DNA (ssDNA를)를 안정화시키고 장기 기억 PR / 납 세트를 유지 담체로서 사용된다. 플레이트를 건조시켜 또한 반응의 볼륨이 작아결과적으로 귀중한 샘플을 보존하고 비싼 시약의 사용을 감소 재현 가능한 결과, 필요한. 이 단계를 통해, 판의 배치는 6 개월 이상 정밀도와 일관성을 제공하는 조립된다.

판 준비에 따라, 품질 관리 대책은 판의 배치의 일관성을 확인하는 것이 중요하다. 이를 위해, 표준의 추가로 네 세트 접시에 실행됩니다. "5 배 표준"판 성능을 추적하고 개인 판의 표준이 비교되는 데이터 세트를 생성합니다. 각 표준의 열 10 배 희석은 분석 설계시 사용되지만, 공간 고려 네 점은 각각의 분석 플레이트에 표준 곡선에 사용하고, 5 배 표준 플레이트에 대한 것을 요구한다. 또한, 양성 대조군은 플레이트의 무결성을 보장하기 위해 각 플레이트에 포함되어야한다.

일반적으로, 그것은 홍보 / PB의 하나에서 여섯 분석 플레이트를 준비하기 위해 3 ~ 4 시간 소요ource 판; 이 연구 실험실에서 하루에 열두 판을 준비 가능하다. 각 인간 IFN 하위 유형 분석 플레이트 열일곱 PR / 납 세트를 검사하고 다섯 실험 샘플을 수용 할 수 있기 때문에, 어셈블리의 어느 날 3060 실험 데이터 포인트를 생성 할 수있는 능력과 판의 배치를 생산하고 있습니다. QRT-PCR 플랫폼 원시 데이터가 처리 및 자동 분석 미리 디자인 템플릿을 채우기 위해 스프레드 시트 애플리케이션 소프트웨어에서 프로그램 스크립트를 사용하여 조립 될 수있다. 이 방법은 손에 데이터를 입력함으로써 방지 복사 오류를 최소화하고 조사 데이터 분석이 아닌 데이터 어셈블리에 초점을 맞출 수 있습니다. 여기에 설명 된 바와 같이, 높은 처리량이 QRT-PCR 분석은 인간 또는 붉은 털 원숭이 샘플 인터페론 아형의 발현을 측정하는 데 적용 할 수있는 다른 화학 종 또는 상동 유전자 세트를 사용하도록 구성 될 수있다. 플레이트 레이아웃의 유연성은 사용자가 프라이머를 변경할 수 있습니다 / 프로브의 유전자를 맞게 설정특정 세포 유형 또는 모델 시스템을 향한 관심. 이 분석은 면역 반응에 관여하는 신호 전달 메커니즘을 해명 병원체를 연구 세포 배양 모델에서 또는 질병 모델의 컨텍스트의 환자 샘플에서 IFN 식 서명을 측정하기 위해 적용될 수있다.

공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

VPM과 RLR은 IFN 및 IFN 하위 유형의 발현을 측정하고 로열티 수입을 얻는 기술의 공동 발명가입니다. 나머지 저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 작품은 CBER / FDA-NIAID / NIH 부처 간 계약 YI-AI-6153-01, FDA / CBER 교내 자금 및 FDA 의료 대책 이니셔티브에 의해 지원되었다. TCT는, MNB는 VPM은, LMS, 그리고 KDK는 미국 에너지 Departmen과 미국 사이의 부처 간 계약을 통해 과학 교육의 오크 리지 연구소에 의해 관리 생물 의약품 평가 연구 센터의 연구 참여 프로그램에 대한 약속에 의해 지원되었다 식품 의약품 안전청.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
0.2 ml PCR 튜브 스트립 Eppendorf (Westbury, NY, USA)E0030 124 286
12-channel 384 Equalizer Electronic Pipette, 0.5-12.5 ulThermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)14-387-139*Discontinued
12-channel 384 Equalizer Electronic Pipette, 1-30 ulThermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)14-387-137*Discontinued
12-channel Electronic Pipette, 5-250 ulThermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)14-387-118*중단된
2.0 ml 마이크로 원심분리기 튜브, 멸균Celltreat Scientific Products (Shirley, MA, USA)229446
8-채널 전자 피펫, 15-1250 ulThermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)14-387-115*중단된
일회용 시약 저장고 VWR International (Radnor, PA, USA)89094-66825mL reservoirs with 2 dividers
E-CentrifugeWealtec Corp. (Sparks, NV, USA)1090003
Eukaryotic 18S rRNA (18S)Applied Biosystems (Foster City, CA, USA)Hs99999901_s1Rhesus HKG Primer/probe set
Fixed Speed Mini VortexerThermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)02-215-360
가스 투과성 접착 플레이트 씰Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)AB-0580플레이트 준비 과정에서 사용되는 일회용 플레이트 씰 
Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH)FBR (Silver Spring, MD, USA)맞춤형주문 Human HKG Primer/probe set
Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH)Applied Biosystems (Foster City, CA, USA)Rh02621745_g1Rhesus HKG Primer/probe set
Hudson Solo 자동 멀티채널 피펫터 Hudson Robotics (Springfield, NJ, USA)800200384-well 냉각 nest로 수정
Linearized plasmids (IFN genes)Aldevron (Fargo, ND, USA)Custom OrderItem 3000, 3580; assay standards에 사용됨 
LNA 억제제Exiqon (Woburn, MA, USA)맞춤 주문품목 500100
LNA 프로브Sigma-Proligo (St. Louis, MO, USA)맞춤 주문재료 번호 VC00023
Matrix Filtered Pipet Tips, 12.5 ulThermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)14-387-193
Matrix Filtered Pipet Tips, 30 ulThermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)14-387-196
Matrix TallTip Extended Length Pipet Tips, 1,250 ulThermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)14-387-160
Matrix TallTip Extended Length Pipet Tips, 250 ulThermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)14-387-152
MicroAmp Optical 384-Well Reaction Plate with BarcodeApplied Biosystems (Foster City, CA, USA)4309849
MicroAmp Optical 96-Well Reaction PlateApplied Biosystems (Foster City, CA, USA)N8010560
MicroAmp Optical Adhesive FilmApplied Biosystems (Foster City, CA, USA)4311971qRT-PCR 실행 전에 플레이트를 밀봉하는 데 사용되는 접착 필름;
Microsoft Excel 2010 스프레드시트Microsoft(미국 워싱턴주 레드몬드) Office 2010Visual Basic 프로그래밍 언어 
MixMate Vortex MixerEppendorf (Westbury, NY, USA)5353 000.0142차원 플레이트 와류
장치 Molecular Beacon ProbesFBR (Silver Spring, MD, USA)맞춤 주문
PCR Cooler, 96웰 플레이트 및 PCR 튜브용 얼음 없는 냉장 보관 시스템Eppendorf (Westbury, NY, USA)Z606634-1EA
플레이트 건조기(매니폴드)Mechanical and Electrical Design Fabrications, NIH Office of Research Services (Bethesda, MD, USA)주문
주문 Primer setsFBR (Silver Spring, MD, USA)주문 주문
pUC57 플라스미드 DNAGenescript (Piscataway, NJ, USA)SD1176
Rnase-Free 1.5 ml Microfuge TubesLife Technologies (Grand Island, NY, USA)AM12400
RNase-free DNase 세트 (50)Qiagen (Valencia, CA, USA)79254
RNase HNew England Biolabs (Ipswitch, MA, USA)M0297L
RNeasy Mini Kit (250)Qiagen (Valencia, CA, USA)74106
Robot Tips (clear tip pre-sterilized pipet tips)Hudson Robotics (Springfield, NJ, USA)800350-S
Salmon Sperm DNA SolutionInvitrogen (Carlsbad, CA, USA)15632-011
SoftLinx 버전 VHudson Robotics (Springfield, NJ, USA)주문소프트웨어로 피펫팅 단계 프로그래밍
TaqMan Fast Universal PCR Master Mix (2x), no AmpErase UNGLife Technologies (Grand Island, NY, USA)4352042
ABgene 접착 플레이트 씰   Thermo-Fisher Scientific (미국 매사추세츠주 월섬)AB0580
Ubiquitin C (UBC)Applied Biosystems (미국 캘리포니아주 포스터 시티)Hs01871556_s1Human HKG Primer/probe set
Verso cDNA synthesis KitThermo-Fisher Scientific (미국 매사추세츠주 월섬)AB1453B
ViiA 7 Real-Time PCR SystemApplied Biosystems (미국 캘리포니아주 포스터 시티)4453536
Water-Ultra PureQuality Biological, INC. (미국 메릴랜드주 게이더스버그)351-029-101
Zipvap 384 (플레이트 드라이어 발열체)Glas-Col LLC (미국 인디애나주 테레호테)384-109A플레이트 드라이어
맞춤형

참고문헌

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