이 프로토콜은 마우스 종양 모델에서 종양 미세환경 내의 백혈구 하위 집합을 자세히 평가하는 방법을 설명합니다. Chemerin-발현 B16 흑색종 세포를 syngeneic 마우스에 피하로 이식했습니다. 그런 다음 종양 미세환경의 세포를 염색하고 유세포 분석으로 분석하여 상세한 백혈구 부분 집합 분석을 가능하게 했습니다.
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이 논문에서
요약
초록
종양 미세 환경에 침투 특수 면역 세포는 종양의 성장 및 생존을 조절한다. 악성 세포는 회피 또는 생존하고 번영하기 위해 항 종양 면역 반응을 파괴해야합니다. 종양 tolerogenic DC 모집, 면역 조절 T 세포 (Tregs), 및 세포 독성 항암 반응을 억제하는 골수 유래 억제 세포 (MDSC)를 포함한 면역 상이한 메커니즘 번호 "탈출"활용. 종양 억제에 참여할 수있는 모든 면역 자극 수지상 세포, 선천성 항 종양 면역 항구 자연 살해 세포 및 세포 독성 T 세포 : 반대로, 항암 효과기 면역 세포는 악성 종양 성장 및 팽창을 늦출 수있다. 프로와 항 종양 백혈구 사이의 균형은 궁극적으로 행동과 형질 전환 된 세포의 운명을 결정한다 인간의 임상 연구의 군중이를 부담했다. 백혈구 하위 집합 따라서, 상세한 분석 내종양 미세 환경은 점점 더 중요 해지고있다. 여기서 우리는 마우스 종양 모델에서 종양 미세 환경에 존재하는 백혈구 침투하는 서브 세트를 분석하기위한 방법을 설명한다. B16 마우스 흑색 종 종양 세포는 C57BL / 6 마우스에서 피하 접종 하였다. 지정된 시간에, 종양 주위의 피부는 일괄하여 절제 한 후 유동 세포 계측법 멀티 색상 염색 단일 세포 현탁액으로 처리됩니다. 백혈구 집합 마커의 다양한 사용하여, 우리는 제어 및 chemerin 발현 종양 사이의 백혈구 하위 집합을 침투의 상대적 비율을 비교할 수 있었다. 연구자들은 면역 종양 미세 환경에 존재하고 종양 성장의 전통적인 캘리퍼 크기 측정과 결합 될 때, 잠재적으로 그것들이 종양 성장에 면역 조성의 변화에 미치는 영향을 규명 할 수 공부 이러한 도구를 사용할 수있다. 이러한 기술은 모든 종양 모델에 적용 할 수있는 종양 미세 환경과의 C이 절제되고 처리 될 수있다.
서론
종양의 성장 및 홍보 및 회귀 사이의 균형은, 부분적으로 미세 1, 2에 존재하는 프로와 항 종양 침투 백혈구의 균형에 따라 달라집니다. (TME)를 종양 미세 환경을 연구 구체적 침투성 백혈구 아 집단을 식별하기 위해, 우리는 쥐 종양 모델에서 피하 종양의 평가 방법을 개발 하였다. 종양 미세 환경 연구의 중요성은 잘 알려져 있으며, 문헌에지지된다. 많은 연구 프로 및 항 종양 면역 세포 침윤의 밸런스가 마우스에서뿐만 아니라, (3,4-에서 검토) 인간 결합 연구뿐만 아니라, 종양 성장의 결과에 영향을 미칠 수 있음을 보여 주었다. 예를 들어, Curiel 등은. 난소 암 환자의 임상 결과는 종양 침윤 규제 CD4 + T 세포 (Tregs) (5)의 비율을 증가의 존재와 상관 관계가 있었다 악화 것으로 나타났다. 우리 자신의 작품 또한 아무런 효과를 보여 주었다또한, 상관 관계를 마우스 흑색 종 모델 6에 백혈구 아형의 비율 VEL 백혈구 화학 유인 물질은 종양 성장을 감소시켰다. 따라서, 종양 내의 백혈구의 서브 세트 상세한 분석은 더욱 광범위하게 인식되고 점차 중요.
백혈구 침투에 대한 종양 미세 환경을 평가하는 방법에는 여러 가지가 있습니다;....
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프로토콜
참고 : 모든 동물 실험은 승인 스탠포드, 팔로 알토 VA HCS, 보건 기관 AnimalCare 및 사용위원회 지침 국립 연구소에 따라 실시 하였다.
1. 샘플 수집 및 처리를위한 준비 (소요 시간 : ~ 10 ~ 15 분)
- 이전 6 설명한 바와 같이 쥐 B16F0 흑색 종 세포 피하이나 여성 C57BL / 6 마우스의 복부의 중앙선 근처 (0.5 × 10 6) 접종. 대안 적으로, (예를 들면 측면, 유방 지방 패드 등)을 추가로 해부 부위에서 종양 세포를 접종.
주 : 종양의 임의의 수 (주입 또는 자발적인)이 프로토콜을 사용하여 평가할 수있다. 예를 들어, 다른 일반적 / 6 결장 선 MC38, 루이스 폐 암종 (LLC) 및 전립선 TRAMP-C2 선을 포함 C57BL 동계에서 종양을 사용 하였다. 면역 결핍 생쥐에 접종 인간 이종 이식편도 이러한 방식으로 평가 될 수 있지만, P는 것을 주목해야한다종양 침윤 백혈구 rofiles 반드시 호스트 마우스의 면역 결핍 상태에 따라서 변경 될 것이다.- 전체 미디어 (예 : RPMI 10 % FBS 및 첨가제를 포함) 또는 다른 적절한 단백질 함유 버퍼 (예를 들어 ....
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결과
우리의 결과는 과발현 쥐 B16 종양에 chemerin의 강제 종양 침투 백혈구 (TILS)의 비율을 증가 것으로 나타났다. 또한 chemerin 발현과 연관된 종양 미세 환경 내에서 표시되는 백혈구 아형의 상대적인 비율의 변화가 확인되었다. Pachynski 등. (6) 허가를 다시 인쇄 할 수 있습니다.
도 1은 17 일 절제된 종양의 FACS 분석에 의해 결정되는 바와 같이, 대조군과 비교 chemerin 발현 종양 내의 총 CD45 + 세포 (TILS)에서 현저한 증가가 있었다는 것을 보여준다. 스테인드 사용, B16 종양, 종양 면역에 의해 CD45 + 세포를 침투의 증가를 확인 하였다 (그림 2) 저온 절단.
FACS 데이터의 추가 분석 여기서 cheme 종양에서 NK 세포, T 세포의 평균에 대해 증가, 도시.......
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토론
종양 미세 환경의 상세한 분석을 수행하는 메커니즘과 면역의 효과를 결정하는데 중요하다. 종양 침투 백혈구에 이러한 에이전트의 영향을 이해하는 인간의 임상 영역에서 immunotherapeutics의 증가 존재와 그들의 작용 메커니즘을 정의하는 필수가되고있다. 인간에서 종종 이와 주연 면역 반응의 분석을 획득하고 백혈구 서브셋 분석 종양 조직을 분석 및 임상 및 / 또는 로지스틱 어려움이 존재는 종종 수행된다. 연구자가 동물 모델에서 임상 연구를 허용 수행하면 더욱 완벽하게하여 임상 결과에 영향을 미칠 수있는 메커니즘에 추가 통찰력을 제공, 종양 자체 내에서 면역 시스템의 면역 조절제의 영향을 탐구한다.
우리의 기술은 종양 침투 백혈구의 상세한 분석을 할 수 있습니다. 전체 종양 미세 환경이 할 수 있기 때문에샘플링, 종양 내 면역 존재 이상의 글로벌 뷰는 평가 될 수있다. 그리고, 최종적으로, 친 종양 억제 세포 및 항 종양 이펙터 세포의 균형이 종양 성장 및 임상 결과
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공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
이 작품은 보조금 R01-CA169354에 의해 지원되었다 및 R01-047822 국립 보건원 (National Institutes of Health)과 보훈 (ECB)에서 우수상에서. RKP는 NIH T32 CA009287-30A1, ASCO 젊은 연구자 상, 캘리포니아 유방암 연구 프로젝트 원정대, 그리고 미국 암 협회 (American Cancer Society) 가르 연구 학술 그랜트에 의해 지원되었다; BAZ는 NIH 보조금 AI079320에 의해 지원되었다. JM은 NIH T-32 훈련 보조금 T32-AI07290- 25, T32-AI07290-24 및 미국 암 학회 (American Cancer Society) 박사후 PF-12-052-01-CSM에서 연구비에 의해 지원되었다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| RPMI | Cellgro | 10-040 | http://cellgro.com; 얼음 유지 |
| FBS | Cellgro | 35-011-CV | http://cellgro.com |
| 50 ml 원뿔형 튜브 | Falcon | 14-432-22 | fischersci.com |
| 40 μ m 필터 | 팔콘 | 08-771-1 | fischersci.com |
| 5ml 주사기 | BD | 14-823-35 | fischersci.com |
| 수술 용 가위 / 집게 | Roboz | RS-5910 | roboz.com |
| PBS | Cellgro | MT-21-030-CM | http://cellgro.com; 얼음 trypan |
| 블루 | Cellgro | MT-25-900-CI | fischersci.com |
| 혈구계 | Hausser Scientifice | 02-671-54 | fischersci.com |
| 살아있는/죽은 얼룩 | Life Technologies | L34957 | lieftechnologies.com |
| FlowJo 소프트웨어 | TreeStar, Inc | flowjo.com |
참고문헌
- Mantovani, A., et al. Chemokines in the recruitment and shaping of the leukocyte infiltrate of tumors. Semin Cancer Biol. 14 (3), 155-160 (2004).
- Zitvogel, L., Tesniere, A., Kroemer, G. Cancer despite immunosurveillance: immunoselection and immunos....
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재인쇄 및 허가
