인간 유방암 조직과 세포주에서 Mammosphere 형성 분석

요약

부유 유방구 분석은 현탁 상태에서 생존하고 마우스에 이식했을 때 향상된 종양 형성을 보여주는 줄기 유사 유방암 세포의 하위 집합을 조사할 수 있습니다. 이 프로토콜은 생체 내 종양 형성의 대용물인 구 형성 능력의 편리한 체외 측정을 제공하는 동시에 줄기 관련 전사 환경의 분석을 용이하게 합니다.

초록

건강한 조직 많은 혈액 및 고형 악성 종양과 유사하게이 더욱 분화 된 자손을 발생주기 동안 자기 - 갱신 줄기 같은 암세포의 서브 세트로, 계층 적으로 구성하는 것으로 생각된다. 이해 및 향상된 화학 치료 및 비 - 조혈 종양 부피에 비해 전파 저항을 가질 수있다 유방암 이러한 암 줄기 세포를 표적으로는, 중요한 연구 분야가되고있다. mammosphere 분석이 또한 널리 향적 sphere-를 식별하는 능력을 위해 사용되었다 : CD44, CD24, 및 ALDH 활성 포함 마커 전향 면역 결핍 생쥐에 주입 할 때 향상된 발암 표시 세포를 분리하는 (FACS)를 정렬 형광 활성화 된 세포를 사용하여 평가할 수있다 하나의 줄기 세포와 같은 세포 클론 개발을 형성한다. 여기에서 우리는 세포 라인 또는 기본 환자 샘플, 자신의 계대 및 구 F를 추정하는 계산에서 mammospheres의 적절한 배양 방법을 간략하게 설명orming 효율 (SFE). 먼저 우리는 적절한 계획과 mammosphere 실험의 해석에 주요 고려 사항과 함정에 대해 설명합니다.

서론

줄기 같은 암 줄기 세포가 이끄는 종양 세포 계통의 존재는 크게 종양 이질성에 대한 우리의 이해에 추가했다. 종양의 일부 표현형 다양성 유전자 구별 클론의 클론 생장에서 발생 않지만, 실질적인 성분은 후생 유전 학적 차이에 기인하는 것으로 나타난다 : 암 세포가 특정 유전자의 활성화 또는 억제를 통해 줄기, 전구 및 분화 상태 사이 (가역적 때때로) 전환 할 수 식 프로그램 ^1-3. 이것은 현재 조절 성 요소를 제공하는 암, 간질 또는 면역 인접 셀로부터 측 분비와 함께 그 결과의 분비 신호와 세포에서 발현되는 유전자 발현 프로그램을 반영 셀 고유 또는 외인성 인자를 반영하고있다 같은 정도로서 microenviromental 조건 저산소증 ^2,4,5.

혁신적인 혈통 추적 방법이지만이들 생체 내 틈새 ^(6)에 추정되는 암 줄기 세포를 연구 할 수있는 능력 전진 ^{- 8} 구 - 형성 분석법 적어도 사용 분석 조건 하에서, 줄기 세포처럼 행동하도록 유방암 세포 잠재력을 추정 인기 편리한 접근 남아있다. 그것은 종종 더 mesenchymal- 상피 대응하도록 제안되어 막 마커 CD44 및 CD24 ⁹ 및 효소 ALDH (알데히드 탈수소....

프로토콜

절차는 다음과 윤리적 임페리얼 칼리지, 런던에 의해 승인되었습니다.

인간 유방암 세포주에서 차 Mammospheres의 1 세대

참고 : 멸균 문화 후드에서 다음 단계를 수행하십시오.

1. Mammosphere 미디어 2 mM의 L- 글루타민이 보충 된 DMEM / F12, 100 U / ㎖ 페니실린, 100 U / ml의 스트렙토 마이신을 함유하는 준비한다. 10 NG / ml의 재조합 인간 염기성 섬유 아세포 성장 인자 (bFGF; R & D 시스템) 및 1X B27 보충제 20 NG / ml의 재조합 인간 상피 성장 인자 (시그마 EGF)을 첨가하여 사용 직전에 완료 매체를 준비한다.
2. (또는 원하는 유방암 세포주 70-80 % 컨 플루 언스 (confluence)에) 부착 MCF-7 또는 MDA-MB-231 세포를 함유하는 플라스크 대기음 매체는 1X PBS에 두 번 세척하고, 세포를 Trypsinize.
3. 실온에서 5 분 동안 원심 분리기 (200) XG 세포. mammosphere 미디어의 1-5 ml의 디 캔트 뜨는에 resuspend 세포. 피펫40 μm의 셀 스트레이너 캡 필터 상하 필요한 사용하는 경우, 단일 세포 현탁액을 ....

결과

다른 샘플이나 다른 치료를 실시 그 시드 초기 세포 정상화 후 형성 mammospheres> 40 μm의 수에 따라 다를 수 있습니다. 세중에서 재배 각각의 치료를위한 mammosphere 형성 효율 (MFE)를 계산합니다. 이것은 다른 시드 밀도 실험을 비교 할 수 있습니다. 데이터는 가장 이상적 양성 및 음성 대조군으로, 막대 그래프에 표시하고, 삼중 웰 걸친 표준 편차를 표시한다. 지속적으로 60-80% 합류 사이에 비 부착 판에 부착 된 세포를 전송합니다. 조심 셀 카운팅 정확하게 치료의 효과를 정량화에 필수적이다. 이 중요한 단계가 아니라 같은 처리는 별도로 여러 현탁액을 준비하여 결과에 기여하고 변화의 정도를 예측. 측정 된 세포 농도가 같은 우물에서 크게 다른 경우, 귀하의 계산 방법 (그림 2) 정제 고려하십시오.

토론

기본 및 보조 mammospheres의 성공적인 평가는 세포가 최소한의 구 집합으로, 단일 클론에서 양식을 mammospheres 충분히 낮은 밀도에서 도금되는에 의존합니다. 그러나 너무 낮은 밀도가 너무 적었 mammospheres 통계적 처리의 효과를 구별하기 위해 형성 할 수있다. 파종 밀도가 그들의 영역 형성의 효율에 상당히 다를 수 있기 때문에 사용 된 각각의 세포주에 대해 최적화되어야한다 (낮은 E-cadherin의 표현들은 덜 안정하고 짧은 기간 mammosphere 배양 물 ^(18)을 형성 할 수있다). 이 최적화 단계는 단일 세포의 클론 성장에서 가장 기본 및 보조 구 형성 결과를 확인해야합니다. 웰 당 하나의 셀을 도금 전적으로 mammosphere 클론 형성을 보장하는 유일한 방법이며, 새롭게 도출 된 샘플 ^(13)의 자기 갱신 / 분화 속도를 정량화 추천 할 수있다. 그러나이 방법은 복잡 요인을 앓고 : mammosphere 형성1 %의 효율은 96 웰 플레이트 당 .......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
DMEM/F12	Lonza	CC-3151
2 mM L-글루타민	시그마 Aldrich	G8540
100 U/ml 페니실린 & 스트렙토마이신	시그마 알드리치	P4083
20 ng/ml 재조합 인간 표피 성장 인자 (EGF)	시그마 알드리치	E9644
20 ng/ml 재조합 인간 염기성 섬유아세포 성장 인자 (bFGF)	R& D 시스템	233-FB-025
1x B27 보충제	Invitrogen	17504-044
인산염 완충 식염수(PBS)	Thermo Scientific	12399902
0.5% 트립신/0.2% EDTA	시그마 알드리치	59418C
태아 종아리 혈청	First Link UK	02-00-850
트리판 블루	시그마 알드리치	93595
낮은 부착성 6웰 플레이트	Corning	CLS3814
Collagena 유형 1A	, Sigma Aldrich	C9891
Hyaluronidase	Sigma Aldrich	H3506
멸균 면도날	Fisher Scientific	12443170
멸균 메스	Fisher Scientific	11758353
멸균 마이크로 해부 가위	시그마 Aldrich	S3146

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