탈수초 질환은 리솔레시틴을 중추신경계에 국소적으로 적용하여 동물에서 모델링할 수 있습니다. 쥐의 척수에 리솔레시틴을 한 번 주입하면 시간이 지남에 따라 자발적으로 복구되는 병변이 생성됩니다. 목표는 탈수초화 및 재수초화와 관련된 요인을 연구하고 수리를 강화하기 위한 에이전트를 테스트하는 것입니다.
이 논문에서
요약
초록
다발성 경화증은 손실 희소 돌기 아교 세포, 미엘린, 축삭 신경 및 플라크 형성을 함유하는 것을 특징으로 중추 신경계의 염증성 탈수 초성 질환이다. 재유 수화 새로운 미엘린 수초가 형성 희소 돌기 아교 세포로 증식, 채용, 및 희소 돌기 아교 세포 전구 세포의 분화에 후속하여 생성된다 내인성 수리기구이며, 또한 축삭 손상으로부터 보호 할 필요가있다. 현재, 다발성 경화증의 치료 용 치료제는 모든 염증의 재발을 감소하지만 불가역 신경 하락 진행을 방해하지 않는 비정상적인 질환의 면역 성분을 대상. 이 재유 수화 촉진 전략이 질병의 진행을 지연 아마도 신경 학적 증상을 역전 할 수있는 개발 될 것이 매우 필수적이다. 탈수 초화의 여러 동물 모델 실험자가 면역 뇌척수염과 curprizone을 포함하여, 존재; 그러나, LIMI있다재유 수화 공부에 대한 자신의 사용 테이션. 보다 강력한 방법은 설치류의 척수 백질로 세제 리소 레시틴 포함한 중추 신경계 독소의 국소 주입,이다. 이러한 프로토콜에서는, 마우스의 복부 백색질로 주입 리소 레시틴 관련된 수술 절차가 빠르고, 비용 효율적이며, 시판보다 추가적인 물질이 필요 없다는 것을 보여준다. 이 절차는 또한 후보 재유 수화 촉진 치료제 스크리닝 전임상 도구로서뿐만 아니라, 재유 수화 과정에 참여 정상적인 사건을 연구를 위해 중요하다.
서론
다발성 경화증 (MS)은 면역 세포 침윤 및 손실 미엘린, 희소 돌기 아교 세포, 신경 세포 축삭 플라크를 포함하는 것을 특징 중추 신경계 (CNS)의 만성 탈수 초성 질환이다. 대부분의 환자들은 죄 사함의 기간 다음에 신경 다양한 증상을 동반 염증 재발로 구성된 질병 코스가있다. 이러한 환자의 절반 이상이 결국 뚜렷한 재발하지만 계속 신경 감소와 보조 진보적 인 단계로 전환. 그것은이 점진적 저하 축삭 손상 및 손실에 의한 것으로 여겨진다 만성 탈수 초화에 의해 부분적으로 기여했다. 손실 수초를 복원하는 전략 따라서 질병의 진행을 지연 아마도 신경 학적 증상을 역전 유망한 치료 방법으로 간주됩니다.
재유 수화 새로운 수초가 채용 희소 돌기 아교 세포 전구 세포에서 생성된다 CNS에서 내인성 수리 응답이다수초 형성 희소 돌기 아교 세포로 분화 (개 OPC). 재유 수화는 1-3, 그러나, 그 효율성은 감소 나이 4 매우 강력한 것으로 동물 모델에서 나타났다. 그것은 MS 환자 5의 대부분 불완전하지만 실제로, 재유 수화는 인간에서 발생합니다. MS에 대한 모든 현재 사용 가능한 약물은 주로 재발을 줄이는 효과가 있지만, 크게 질병의 진행을 지연하지 않는, 질병의 비정상적인 면역 구성 요소를 대상으로. MS의 관리를위한 치료 전략의 차세대 진행 및 재발 모두 6을 방지하기 위해 내인성의 재유 수화 면연 향상 기술 진보를 통합 할 것이다.
하나의 방법은 탈 공부 및 CNS의 재유 수화는 척수 백질 1,3,7에 세제 리소 포스파티딜콜린 (리소 레시틴)의 직접 분사를 포함한다. 이 절차는 잘 특징 demyelinat을 생산부상 주로 대 식세포 / 미세 아교 세포의 침윤 및 활성화 8,9, 반응 astrogliosis, 축삭 항상성 / 축삭 손상 및 OPC 증식 및 마이그레이션 (10)의 섭동의 구성을 보내고. 병변은 예상 몇 주간의 기간 동안 진화 완전히 remyelinating의 결국 할 수있다. 이 방법은 탈과 재유 수화에 관련된 이벤트의 안무를 공부에 특히 유용했다. 또한,이 탈수 초성 모독 다음 수리 가속화 후보 요법 전임상 시험을위한 도구로서 채용되고있다.
프로토콜
참고 :이 절차에 사용 된 동물은 동물 관리에 캐나다위원회 (CCAC) 지침에 따라 마음에 든다고했다. 윤리는 캘거리 대학의 동물 관리위원회에 의해 승인되었다.
1. 주입 주사기를 준비
- (하여 pH 7.4 PBS) 및 매장 작은 분취 량에서 -20 ° C (75 μL)에 인산 완충 식염수에 1 % 용액에 리소 레시틴 녹인다. RT에 유리 병을 녹여.
주 : 리소 레시틴이 불용 인 경우, 균일 한 용액을 형성하기 위해 약 30 분 동안 초음파 세척기 (40 kHz로)에서 튜브를 초음파 처리. - 섬세한 팁을 손상을 방지하기 위해 매우 조심 미리 뽑아 유리 모세관을 처리합니다. 10 μL 주입 주사기의 너트를 풀어 페룰 정합 단부 정렬하고 모세관 원추형 페룰 (도 1)에 꼭임을 보장이 페룰이어서 모세관의 평평한 단부에 그것을 스레드. isoprop와 주사기를 씻어일 알코올과 플런저를 제거합니다. 건조되면, 주입 주사기에 꽉 니들 어셈블리 손을 조입니다.
- 프라이밍 주사기에 금속 허브 바늘을 연결합니다. 피어스 바늘 고무 디스크를베이스로 아래로 밀어 넣습니다. 리소 레시틴과 프라이밍 주사기를 입력합니다. 액체가 바늘의 끝에서 보일 때까지 조심스럽게 프라이밍 주사기를 우울. 이것은 기포가 주입 주사기로 도입되지 보장한다.
- 주입 주사기로 프라이밍 주사기의 금속 허브 바늘을 삽입합니다. 모세관이 솔루션을 끝으로 채울 때까지 고무 디스크와 함께 회사 인감 만들기, 천천히 프라이밍 주사기를 우울. 동시에 공기 방울을 도입하지 않고 주입 주사기의 배럴을 채우기 위해 누르면서 조심스럽게 프라이밍 주사기를 제거합니다. 주입 주사기로 플런저를 삽입하고 플런저가 부드럽게 눌려로 솔루션은 모세관의 끝에서 흘러 확인합니다.
주 : 기포가 모자에서 볼 수있는 경우illary 또는 주사기를 주입 주사기 제제는 처음부터 반복한다. 분사 장치에 연속 유체는 정확한 주입량을 보장하는 것이 중요하다. - 정위 미세 조작기의 팔에 완성 된 주입 주사기를 연결합니다. 이 완료 장치는 리필 할 필요가 전에 15 ~ 20 동물을 주입 할 수있을 것입니다.
- 프라이밍 주사기에 남아있는 리소 레시틴을 폐기하십시오. 철회 및 이소 프로필 알코올을 여러 번 우울, 및 금속 바늘 허브를 분리. 다시 채우기 전에 증발 프라이밍 주사기에 남아있는 이소 프로필 알코올 몇 시간을 기다립니다.
2. 수술을 위해 동물을 준비
참고 :이 절차는 여성 C57BL / 6 마우스, 세 8~10주에 대해 설명한다.
- 케타민 (200 ㎎ / ㎏)과 자일 라진 (10 ㎎ / ㎏)의 제도적 동물 보호 규정에 따라 복강 내 주사하여 동물을 마취. 계획주사 마취를 사용하는 경우 동물은 약 1 시간 동안 마취를합니다.
- 동물 깊이 단단히 발을 집어 마취되어 있는지 테스트합니다. 제대로 마취 동물은 핀치에 응답하지 않습니다.
- 가위를 사용하여 귀 가까이에 동물의 등쪽면에 2 ~ 3 ㎠로 영역을 면도. 귀 손상되지 않도록주의하십시오.
- 거즈 패드에 적용되는 70 % 에탄올로 청소 영역을 닦습니다. 모든 잘린 머리를 제거한 다음 확인합니다. 요오드 영역 소독.
- 건조 과정에 걸쳐 방지하기 위해 눈에 바셀린을 적용한다.
- 절차를 시작할 준비가 될 때까지 가열 회수 챔버에 동물을 유지.
3. 수술 절차를 수행
참고 : 절차의 모든 단계에 대한 적절한 무균 기술을 확인합니다. 이 장갑, 머리망, 마스크 및 커튼의 적절한 사용을 포함한다. 모든 도구는 마 contac에 오기 전에 소독해야한다동물과 t.
- 정위 프레임에 동물을 이동, 등쪽면이 위로, 척추의 만곡을 과장 접힌 종이 타월로 중간 부분에서 상승. 수술 테이프로 팔과 꼬리를 고정하고 치아 클램프로 머리를 고정합니다. 안정화 귀 바는이 절차가 필요하지 않습니다.
- 바로 귀 아래에서 시작하여 꼬리 방향으로 절단, 3cm의 중간 선 절개를 만들기 위해 메스를 사용합니다.
- 2 개의 대형 지방 구조 사이의 격차를 찾아이 떨어져 가져 오기 위해 각 손에 미세 집게를 사용합니다. 수술 부위를 엽니 다 견인기를 확산.
- 수술 현미경, T2 척추의 저명한 가지 프로세스를 찾습니다 (참고 :이 기능은 C57BL / 6 마우스 변형의 특징이다). 더 나은 T2를 시각화하기 위해 오버레이 근육을 폐쇄 봄 가위와 무딘 절개를 수행합니다. 집게를 사용하여, 적절한 해부학 적 위치를 확인하기 위해 T3와 T4의 하드 표면에 대한 느낌.
- 봄 가위를 사용하여, T3와 T4 사이의 결합 조직 (2~3mm 깊이) 얕은 측면 인하합니다. 때문에 마우스 척추의 상부 흉추 부분의 척추 사이의 자연 공간에, 후궁 절제술은 척수를 공개 할 필요가 없습니다. 너무 깊은 상처가 관통하고 코드가 손상 될 수 있음을 염두해야합니다.
참고 : 출혈의 작은 정도가이 단계에서 일반적입니다. 이 경우, 출혈이 가라 (30 ~ 60 초)까지 영역에 스폰지 창을 누르고 있습니다. - 척수를 시각화. 코드를 노출하면서이 수막 층이 아직 절단되지 않은 경우는 볼 수 경질의 두꺼운 층으로 덮여됩니다. 눈에 띄는 혈관은 척수의 대략적인 중간 선을 통해 꼬리 / 주동이를 실행합니다.
참고 :이 혈관은 중간 선을위한 랜드 마크로서 사용할 수 없습니다. 대신, 적절한 조명은 등쪽 열 측부 회백색 물질 경계 공개해야하며, 이는 정중선을 추정하는데 사용될 것이다. - 경질 경우이 지워질 때까지 그대로 유지, 32 G 금속 바늘로 부드러운 측면 긁힌 자국을합니다. 목표는 두껍고보고 열심히하지 않은 나머지 기본 수막을 절단하지 않으면 서 경질을 제거하는 것입니다.
참고 : 뇌척수액의 출시는 거미의 위반을 표시하고이 조직에 기계적인 손상없이 발생할 수 있습니다 동안 축적 된 뇌척수액이 더 나은 코드의 표면을 시각화하기 위해 스폰지 창으로 제거해야합니다. - 장소에 주입 주사기를 이동하고 모세관의 끝이 겨우 정중선의 양쪽의 바로 옆의 척수에 닿을 때까지 천천히 내립니다. 장소에 팔을 잠급니다.
- 기준 위치 측정을 할 수있는 Z 방향 정위 아암의 등급 측정을 사용한다. 이 독서에서 1.3 mm를 뺍니다. 조직을 관통하는 빠르고 얕은 하향 움직임을 사용하여 새로운 측정에 도달 할 때까지 조심스럽게 모세관을 낮 춥니 다. 옵션 : 원하는 경우,등의 열에서 병변은 정중선에서 동일한 피어싱 모션 및 0.3 mm (자세한 내용은 설명을 참조)의 깊이에 의해 제조 할 수있다.
참고 :이 값은 T3와 T4 사이에 주입하기위한 고유합니다. 척수의 다른 위치에 주사를 수행하는 말인가하면,이 값은 사용 가능한 마우스 뇌지도 책에서 파생되어야합니다. - 복부 척수의 백질에 리소 레시틴 우울하게하는 미세 조작기를 사용합니다. 0.5 μL의 최종 부피의 결과로, 2 분 동안 미세 조작기의 1 회전 매 5 초마다 확인합니다. 솔루션의 역류를 방지하기 위해 추가로 2 분 동안 자리에 모세관을두고 조심스럽게 캐 필러를 제거합니다.
- 척추를 오버레이 근육 / 지방 조직에서 하나의 봉합사를 묶어. 피부를 닫습니다 비 중단 된 봉합사를 사용합니다. 절개 사이트에 더 많은 요오드를 적용합니다.
- 이 복구 될 때까지, 다음의 케이지에 반환 가열 복구 실에서 동물을 놓습니다. 진통제를 적용 포스트에 작동 기관 동물 관리 규정에 따라. 동물이 즉시 마취에서 그들이 복구와 같은 완전히 외래 및 자체 공급 및 음주 할 수있는 등의 추가 수술 후 치료는 일반적으로 필요하지 않습니다.
- 나머지 동물에 대해이 절차를 반복합니다.
참고 : 구사, 동작은 특히 봉합을 매 두 번째 사람의 도움으로, 동물 당 10-15 분에 완료 될 수있다. 팁이 블런트되고 교체되어야하기 전에 동일한 유리 모세관 15-20 수술에 사용될 수있다. 대신 리소 레시틴의 척수의 PBS로 주입, 제어 된 바와 같이 수술 동일하게 행할 수있다. 우리는 향후 사용을 위해 모세 혈관을 청소하지 않는 것이 좋습니다.
4. 조직 처리 및 분석
- 목적하는 시점에서 케타민 (500 ㎎ / kg)과 자일 라진 (25 ㎎ / kg)을 복강 내 과용과 희생이. 병변은 일반적으로 foll 진화때문에 방법 : 1 ~ 3 일 활성 탈수 초화; 3~7일, OPC 모집; 7~10일, 희소 돌기 아교 세포의 분화; 10-21일, 활성 재유 수화 2,10,11.
- 첫 번째 PBS에서 20 ml의 얼음처럼 차가운 4 % 파라 포름 알데히드 다음 20 ㎖ RT PBS로 transcardial 관류 (12)을 수행, 조직 학적 위해 조직을 준비합니다. 반 또는 얇은 절편을위한 수지 포함 된 조직의 준비를위한 단계 4.9을 참조하십시오.
- 각각의 척추 척추의 자궁 끝에서 시작하여 낮은 흉부 수준까지 작업을 통해 잘라 곡선 뼈 가위를 사용하여 척수를 제거합니다. 4 ° C에서 PBS에서 4 % 파라 포름 알데히드의 척수 O / N을 수정합니다. 최소 72 시간 동안 4 ° C에서 PBS의 30 % 자당에 코드를 전환합니다.
- 척수의 등 표면에 이상으로 주사 부위를 확인합니다. (중앙의 주사 부위와) 조직의 3mm 조각을 잘라 최적의 절단 온도를 포함 cryomolds OCT () 공동의 조각을 정렬mpound. OCT를 완전히 고정 될 때까지 2- 메틸 부탄과 드라이 아이스의 냉장 혼합 cryomolds의 아래쪽을 일시 중단합니다. 섹션 전까지 -80 ° C에서 보관하십시오.
- 현미경 슬라이드 상에 20 ㎛의 폭에서 제 저온 유지 장치에있는 척수 및 건조 공기의 O에 허용 / N -20 ° C에서 슬라이드를 저장하기 전에.
- 미엘린 (13)의 에리 오 크롬 시아닌 조직 학적 염색을 이용하여 병변의 위치와 크기를 검출한다. 실온에서 모든 단계를 수행합니다. 30 분 동안 공기 건조 슬라이드. 1 분마다 등급 에탄올 솔루션 재수 다음 1 분 (100 %, 95 %, 90 %, 70 %, 50 %, 물)에 대한 에이전트를 제거에 배치 슬라이드.
- 물에 1 분 세척 한 다음 15 분 동안 에리 오 크롬 시아닌 용액에 넣어 슬라이드. 물에 1 분간 세척 한 후, 10 초 동안 0.5 % 암모늄 하이드 록 사이드에서 차별화. 밝은 필드 마일에서 1 분 장착 미디어와 각, 커버 슬립 및 이미지 (위에서 설명한 순서를 반대로) 등급 에탄올 용액에서 탈수croscope.
- 축삭과 수초를 시각화하기 위해 면역 조직 화학 염색을 사용합니다. 30 분 동안 공기 건조 슬라이드. RT에서 2 분마다 등급 에탄올 (물, 50 %, 70 %, 90 %, 95 %, 100 %)로 탈수 한 다음 다시 물 역순. 이 단계는 개별 수초 링 (14)의 높은 해상도가 발생합니다.
- RT에서 60 분 동안 PBS 중 10 %의 염소 혈청과 0.25 %의 트리톤 X-100을 사용하여 비 - 특이 적 항체의 상호 작용을 차단. PBS에서 4 ° C에서 / 슬라이드 O에 N을 품어 차 항체 (1000 : 2000, 토끼 항 MBP 한 마우스 항 - SMI312 1) 희석.
- RT에서 PBS로 5 분 동안 5 회 반복한다. PBS와 실온에서 60 분 동안 슬라이드에 부화 차 항체 (500 : 500, 알렉사 546 항 - 마우스 1 알렉사 488 항 - 토끼 1) 희석. RT에서 PBS로 5 분 동안 5 회 반복한다. 마운트는 형광 현미경에 gelvatol과 이미지를 사용하여 커버 슬립과 슬라이드.
- 희소 돌기 아교 세포 계통의 세포를 시각화하기 위해 면역 조직 화학 염색을 사용합니다. 세인트의 절차를 따르십시오EP 4.7, 탈수 / 재수 화 단계를 생략하고, 10 % 말 혈청 대신 염소 혈청을 사용. 다음과 같은 주요 항체 희석을 사용하여 염소 항 - PDGFRα 1 : 100, 마우스 방지 CC1 1 : 200, 토끼 반 Olig2 1 : 200. 알렉사 488 안티 - 염소 1 : 500, 알렉사 594 항 - 마우스 1 : 500, 알렉사 647 항 - 토끼 1 : 500 다음 이차 항체 희석을 사용합니다.
- 제 20 ㎖ PBS에 빙냉 4 % 파라 포름 알데히드 / 1 % 글루 타르 알데히드이어서 20 ml의 PBS로 RT transcardial 12 관류를 수행 세미 또는 초박 절편을 위해 조직을 제조 하였다. 4.3 단계에 설명 된대로 척수를 제거합니다. 4 ° C에서 PBS에서 O / N 4 %에서 파라 포름 알데히드 / 1 % 글루 타르 알데히드를 수정합니다.
- 단계 4.4에 설명 된대로 주사 부위를 확인합니다. 주사 부위를 포함하는 조직의 1mm 조각을 잘라. 필요한 경우 병변의 양쪽에 추가 1mm 블록은 또한 제조 될 수있다.
- 흄 후드에서 얼음에 각각의 블록에 10 배량의 1 % 오스뮴 테트 록 사이드 / 1.5 %의 황 혈염을 추가60 분.
참고 : 오스뮴 테트 록 사이드는 독성이 강한 물질이며 특히주의해서 처리해야합니다. 산화 오스뮴과 접촉하는 모든 물질 중화 옥수수 유 (산화 오스뮴 용액 배 부피)에 배치되어야한다. - 옥수수 기름에 폐기, 실온에서 10 분 동안 0.2 M cacodylate로 코드를 제거하는 과정을 3 회 반복한다. 등급 에탄올 용액 (물, 50 %, 70 %, 90 %, 95 %로 2 회, 100 %의 2 배, 프로필렌 옥사이드 2 회) RT에서 10 분 동안 함께 탈수.
- 제조업체의 지침에 따라 수지에 포함 된 코드.
- 을 Ultramicrotome에 블록을 잘라 현미경 슬라이드에 물방울 위에 섹션을 탑재합니다. 건조까지 핫 플레이트 (약 50 ° C)에 배치 슬라이드.
- 50 ℃에서 10-15 초 동안 슬라이드에 푸른 톨루이딘 1 % / 2 % 붕사 용액 몇 방울을 첨가하여 미엘린 시각화. 설치 매체와 물, 건조 및 커버 슬립 씻어. 밝은 필드 현미경 이미지 섹션.
결과
복부 백질에 리소 레시틴의 초점 주사는 약 3mm (그림 2)의 거리에 감지 할 수있는 별도의 탈수 초성 병변을 생산하고 있습니다. 병변 수초 핵심 (MBP)와 축삭 (SMI312)의 면역 조직 화학 염색을 7 일 (그림 3)에서 수초의 박탈 된 축삭을 보여줍니다. 십사일으로 많은 축색이 재유 수화의 발생을 시사 MBP 양성 링에 의해 둘러싸여있다. 희소 돌기 아교 계통 (PDGFRα, Olig2, CC1)의 세포 염색 칠일뿐만 아니라 OPC를 비교하여 성숙한 희소 돌기 아교 세포의 분포와 비교하여 14 일째 취하여 세포의 총 수 모두에서 상당한 증가가있다 (도 4) . 이러한 발견과 일치, 톨루이딘 블루로 염색 semithin 섹션에서는 이러한 난을 재유 수화되어 있음을 나타냅니다 거의 칠일 (그림 5)에서 감지되지 십사일에 얇은 수초의 존재를 공개nternodes.
절차는 동물 간의 재현성이다. 무거운 호흡의 정지 위치를 변경하면 변화가 발생 모세관을-이 일반적으로 적절한 진정으로 문제가되지 않습니다. 축삭 손상 모델 (1)의 초기 사용 이후에 설명 된 병변의 중심을 제외하고, 최소한의 것으로 보인다. 우리는 PBS 컨트롤을 주입도 관측으로이 유리 모세관에서 기계 부상 할 전망이다. 그럼에도 불구하고, 변동은 작아지는 경향이, 우리와 유사한 절차를 사용하여 다른 그룹 당 15 적게 사로서 동물 실험 조건 사이의 차이를 검출했다.
주입 주사기 그림 1. 조립. (A) 주입 주사기의 너트는 t에 나사 식 그는 자신의 짝짓기 연동을 종료하는 2 페룰 등 뒤에 유리 모세관의 평면 끝. 모세관 단단히 원추형 페룰 가지런되면, 조립체는 꽉 주입 주사기의 단부 상으로 손을 나사 결합된다. (B) 프라이밍 주사기에 부착 된 금속 허브 바늘로 고무 디스크의 중심을 조각으로 미끄러 베이스. (C), 프라이밍 주사기 내로 용액을 리소 레시틴 퇴각. (D)는 부드럽게 리소 레시틴의 첫 방울 바늘의 팁에서 보일 때까지. (E)를 프라이밍 주사기 우울 주입 배럴로 프라이밍 주사기를 삽입 고무 디스크와 회사 인감을, 주사기. 이 모세관의 끝으로 실행될 때까지 조심스럽게 솔루션을 우울. 주입 주사기에 기포를 도입하지 않고, 금속 허브 바늘을 제거하는 플런저에 압력을 유지하면서 조심스럽게 프라이밍 주사기를 철회./ 52679 / 52679fig1large.jpg "대상 ="_ 빈 "을 업로드>이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
에리 오 크롬 시아닌으로 염색 병변 리소 레시틴 그림 2. 대표. 직렬 섹션 에리 오 크롬 시아닌으로 염색 십사일에 특성 리소 레시틴 병변 (400 μm의 이격)는 수초 (파란색)을 시각화합니다. 그 탈수 초화가 복부 백질로 제한됩니다 참고 병변 주동이 / 꼬리 방향으로 약 3mm에 걸쳐있다. 스케일 바 = 1mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. 축삭과 수초에서리소 레시틴 모델. (A) 가짜 (PBS)는 칠일에 척수 주사가 수초 반지에 둘러싸여 건강한 축색 돌기를 보여줍니다. 칠일에 병변이 저하 수초뿐만 아니라 축삭을 무 결함을 보여줍니다 리소 레시틴 (B). (C) 십사일에서, 축삭 (흰색 화살촉로 표시 예)의 비율은 수초 반지의 재현과 연결되어 있습니다. 스케일 바 = 10 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 리소 레시틴 모델 4. 희소 돌기 아교 세포 계통의 세포. (A, C) 칠일에서은 CC1의 +의 희소 돌기 아교 세포 (마젠타 바)에 더 큰 PDGFRα + 개 OPC의 표현 (흰색 막대) 상대가있다; 바 내의 숫자는 비율을 나타냅니다. Olig2가에 프로브되었다희소 돌기 아교 세포 계통 세포의 염색을 확인합니다. (B, C)를 십사일에서,이 칠일 (P <0.05, 두 개의 꼬리 t 테스트에 비해 희소 돌기 아교 세포 계통 세포의 총 수가 크게 증가이고, n = 그룹 당 4 ). 칠일 (P <0.0001, 피셔의 정확한 시험)에 비해 십사일에서 개 OPC에 희소 돌기 아교 세포의 분포에 상당한 증가도 있습니다. 스케일 바는 10 μm의 =. 각 필드는 60X의 원래 배율로 촬영됩니다. 값은 평균 ± SD 있습니다. * P <0.05을 의미합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
리소 레시틴 모델 그림 5. 재유 수화. (A) 혜의 복부 백질의 섹션을 semithin 스테인드 단면 톨루이딘 블루lthy 마우스 (B) 7- 일째. 각 미엘린 두께 구경의 넓은 범위에 걸쳐 축삭을 도시 수초 부족 (오른쪽 하단)에 영향을받지 않는 영역에 인접하여 관찰된다. 십사일에서, (C), 얇게 유수 시스 ( 빨간색 화살표 머리로 표시 예) 재유 수화 세그먼트를 나타내는 병변에 걸쳐 나타납니다. 스케일 바 = 10 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
토론
동물 모델의 수는 MS, 가장 인식 가능 실험적자가 면역 뇌척수염 (EAE) 모델을 연구하기 위해 개발되었다. EAE에서 설치류는 미엘린 펩티드의 조각에 대한 예방 접종과 상승 마비에 명시 염증성 병변 개발을 받아야한다. 반 또는 초박막 위해 조직을 처리 할 때, 우선, 염증성 병변의 위치는 다소 랜덤 한 병변의 위치 :이 모델은 면역 MS 의약품 전임상 실험에 유용되었지만, 세 가지 주요 이유 재유 수화 공부에 적합하지 않다 섹션은 문제가 될 수 있습니다. 두번째 재유 수화가 특정 시간 걸쳐 발생하여, 하나의 EAE 병변의 정확한 연령 지속적인 비 침습성 자기 공명 영상없이 알 수 없기 때문이다. 세 번째는 재유 수화는 약물의 주요 결과하지 않을 수 있습니다 EAE에서 약물 치료 다음과 같은 자연적으로 발생하는 설치류 현상 및 재유 수화의 증거라고하지만,에염증을 감소시키는 현상을 보조 대신 봉.
탈수 초화를 제조하는 또 다른 일반적인 방법은 음식에 구리 킬레이트 cuprizone를 도입함으로써 달성된다. 이로 인해 다음 뇌량에 널리 탈수 초화가 발생합니다. 첫째, 축삭의 직경 (따라서 수초 두께가) 다른 CNS 지역보다 작은, 따라서 얇게 재유 수화 피복이 탈수 초 결코 없었다 것과 구별 될 수 있습니다 다음과 같은 이유로 재유 수화의 사이트로 뇌량을 공부에 제한이 있습니다. 마우스 뇌량이> 70 % 수초 축색 돌기 (16)가 포함되어 있기 때문에 둘째, 그것은 재유 수화 세그먼트 (17)는 일반적으로 발생하는 성인에 손상 수초 또는 드 노보 수초 합성의 진정한 보수인지 불분명 할 수 있습니다.
그것은 재유 수화 공부에 가장 적합한 모델이 독소의 직접 주입, 하나 리소 레시틴, ethid 것을 우리의 믿음입니다꼬리 대뇌 꽃자루 (18) 또는 척수의 백질로 늄 브롬화물, 또는 다른 사람. 전자의 위치는 단지 정확한 3 차원 정위 주사에 의해 달성된다 의한 소뇌 꽃자루의 작은 크기에 큰 설치류 (래트)에 한정된다. 이 탈과 재유 수화를 공부 형질 전환 마우스의 광범위한 리소스를 제외합니다. 척수는, 그러나, 쉽게 접근 할 수 외과 많은 큰 백색질이 포함되어 있습니다. 주동이의 흉부 세그먼트의 척추 사이의 공백은 꼬리 흉부 외과 수술에 필요한 단계입니다 후궁 절제술, 필요없이 척수의 노출 수 있습니다. 특히 복부 백질을 대상의 장점은 축색이 재유 수화의 정량화를 만드는 등의 백질보다 균일하게 큰 것입니다 덜 모호한 작업-유사한 뇌량과 관련된 문제에. 또한, 복부 백질은 훨씬 더 큰 t을 구성주입 영역을 arget; 같은 편차가 복부 여전히 눈에 띄는 탈수 초성 병변을 생산하는 것입니다 동안 측면 등의 지역에서 수백 미크론, 열 외부 모세관을 배치합니다. 일부 프로토콜은 지느러미와 같은 동물 (19)의 복부 컬럼에 모두 리소 레시틴 주입. 이것은 적절한 모세관 배치의 가능성과 적은 수의 동물에서 정량화 병변의 수가 모두 증가시킬 수있다. 제시된 데이터는 현재 동작 시점에서 8-10 주령 동물이지만, 또한 4 재유 수화가 현저히 느린 것으로 설명된다 8-10개월 된 생쥐에 동일한 절차를 사용하여 성공이 있었다.
재유 수화의 정량은 하찮은 작업이 아닙니다. 중앙 교리는 재유 수화 세그먼트가 건강한 비해 평균 길이가 짧고 얇은이며, 단면 반 O를 따라서 g 비율 계산 (축삭 직경 축삭 + 수초 지름으로 나눈 값) 것을 가정한다R의 얇은 섹션은 표준 절차되고있다. 그러나, 재유 수화 세그먼트 시간이 2 위에 두껍게 remyelinating 희소 돌기 아교 세포의 유전자 변형 기자를 사용하여 최근의 연구는 많은 internodes 결국 제어 (20)과 구별 될 수 있음을 시사하는 것으로 알려져있다. 병변 내 성숙 희소 돌기 아교 세포의 수를 정량화 희소 돌기 아교 세포는 internodes 다양한 수를 제조 할 수있는 바와 같이, 보수를 측정하는 간접 방법이며, 재유 수화 의존 모델의 상당수 사용됨 -은 슈반 세포 (3)로부터 발생한다. 재유 수화가 도약적인 전도 (21)의 복원에 링크 된 바와 같이 물론, 수리의 궁극적 인 메트릭은 신경 학적 결손의 기능 회복 될 것입니다. 재유 수화가 어떤 종 (22, 23)의 기능의 회복에 연결되었지만, 여기에 리소 레시틴 뮤린 연구에서 표준 절차가 않았습니다. 이는 명백한 observ의 부족 가능성이러한 EAE 심지어 cuprizone 같은보다 강력한 탈수 초 모델에 비해 지느러미 또는 복부 중 병변 수 적자. 우리는 재유 수화로 주입하고, 이후의 복구를 리소 레시틴으로 인한 기능 적자 만 잘 감각 기능의 민감한 테스트를 사용하여 관찰 될 것이라고 생각합니다.
퉁명스러운 방법 론적 접근 방식이기는하지만, 위의 동물 모델 중 하나와 함께 "재유 수화"의 PubMed를 검색, EAE (188)과 cuprizone (197)에 비해 (109) 리소 레시틴 더 적은 검색 안타를 보여줍니다. 탈수 초화를 리소 레시틴하는 재유 수화 연구를위한 우수한 접근 방법 우리의 인수가 왜 경우 적어도 논의? 아마도이 방법을 사용하는 우려는 외과 수술을 수행하는 기술적 어려움 믿음에서 유래. 실제로,이 절차는 모든 commer있는 재료를 필요로하는, 빠르고 경제적이다없고 루틴 해부 조직보다 더 어렵다일반적으로 구입 가능한. 그것은이 프로토콜은 수초 수리의 흥미 진진하고 확장 필드를 공부에 대한 자신의 레퍼토리에이 강력한 모델을 추가하려는 사람들을위한 유용한 증명하는 것이 우리의 희망입니다.
공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
이 프로젝트는 캐나다 다발성 경화증 협회(Multiple Sclerosis Society of Canada)와 앨버타 이노베이츠(Alberta Innovates) - 건강 솔루션 CRIO 팀 프로그램의 보조금으로 운영되었습니다. MBK는 Alberta Innovates - Health Solutions 및 캐나다 다발성 경화증 협회(Multiple Sclerosis Society of Canada)로부터 장학금을 받았습니다. SKJ는 캐나다 다발성 경화증 학회(Multiple Sclerosis Society of Canada)의 앨버타 endMS 지역 연구 및 교육 센터(Alberta endMS Regional Research and Training Center)의 대학원생 지원 보조금으로 자금을 지원받고 있습니다. 저자는 Jan van Minnen 박사와 신경생물학 핵심 시설의 재생 부서에 장비 교육 및 사용에 대해 감사를 표합니다.
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| 첨가 | 량 | ||
| 에리오크롬 시아닌 R | 0.8g | ||
| 황산 | 400ml, 0.5% | ||
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| 80ml | |||
| *황산에 에리오크롬 시아닌을 첨가한 다음 염화철(III)과 물을 첨가합니다. 용액은 사용 후에 보관할 수 있습니다. 일년에 한 번 신선하게 만드십시오. | |||
| Gelvatol | |||
| 성분 | |||
| PBS | 140 mL | ||
| 폴리비닐 알코올 | 20 g | ||
| 글리세롤 | 40 g | ||
| *잘 섞어서 37 ° C O/N, 1,960 x g 30분에서 원심분리기, 40개의 튜브 |
참고문헌
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