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방법 논문

소프트 한천 콜로니 형성 분석의 활용은 유방암 세포에서 종양 유발의 억제를 확인하는

29.1K 조회수

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DOI:

10.3791/52727

⸱

2015년 5월 20일

 ,  ,  ,  , 
1Department of Baker Institute for Animal Health, Cornell University, 2Department of Molecular Biology and Genetics, Cornell University, 3Department of Biochemistry and Molecular Pharmacology, University of Massachusetts Medical School

이 논문에서

요약

여기에서는 펩티딜아르기닌 데이미나제(PADI) 효소 억제제인 BB-Cl-아미딘이 체외 유방암 종양원성에 미치는 영향을 테스트하기 위해 연질 한천 집락 형성 분석법을 사용하는 방법을 문서화합니다.

초록

생체 내 종양 진행 메커니즘을 조사하는 데 내재된 어려움을 감안할 때, 반고체 매트릭스에서 세포의 증식 능력을 측정하는 연질 한천 집락 형성 분석법(이하 연질 한천 분석법이라고 함)과 같은 세포 기반 분석법은 암 연구의 특징으로 남아 있습니다. 기존 2D 단층 또는 3D 스페로이드 세포 배양 분석에 비해 이 기술의 주요 장점은 3D 세포 환경이 생체 내에서 볼 수 있는 환경과 매우 유사하다는 것입니다. 중요한 것은 연질 한천 분석법이 세포 증식 및 이동에 대한 새로운 화합물 또는 처리 조건의 효과를 엄격하게 테스트할 수 있는 이상적인 도구를 제공한다는 것입니다. 또한 이 분석을 통해 유전적 섭동의 맥락에서 세포 형질전환 가능성의 정량적 평가를 수행할 수 있습니다. 우리는 최근 펩티딜라기닌 데이미나제 2(PADI2)를 잠재적인 유방암 바이오마커 및 치료 표적으로 확인했습니다. 여기에서는 PADI 억제제인 BB-Cl-아미딘(BB-CLAA)이 인간 관 상피내암종(MCF10DCIS) 세포의 종양원성에 미치는 영향을 테스트하여 전임상 항암 연구를 위한 소프트 한천 분석의 유용성을 강조합니다.

서론

비형질전환(정상) 세포와 형질전환된 세포 모두 2D 단층 배양에서 쉽게 증식할 수 있습니다. 이러한 형태의 부착 세포 성장은 유사분열 자극이 없을 때 세포가 미세환경 내에서 빠르게 분열하지 않는 생체 내에서 발생하는 것과는 매우 다릅니다. 반면에 부드러운 한천 분석은 반고체 아가로스 겔1 내에서 현탁액에서 증식하고 콜로니를 형성하는 세포의 능력을 측정하여 종양 원성을 정량화하기 때문에 2D 배양 시스템과 구별됩니다. 이 환경에서 형질전환되지 않은 세포는 세포외 기질(ECM)에 고정되지 않은 상태에서 빠르게 증식할 수 없으며 아노이키스(anoikis)로 알려진 과정인 세포사멸(apoptosis)을 겪습니다. 대조적으로, 악성 형질전환(malicious transformation)을 겪은 세포는 포스파티딜이노시톨 3-키나아제(PI3K)/Akt 및 Rac/Cdc42/PAK와 같은 신호전달 경로의 활성화로 인해 고정 의존성을 잃게 됩니다. 따라서 이러한 세포는 반고체 연질 한천 기질2 내에서 성장하고 군체를 형성할 수 있습니다.

연질 한천 분석의 일반적인 용도는 PADI 억제제와 같은 특정 화합물이 in vitro에서 종양 성장을 억제할 수 있는지 여부를 테스트하는 것입니다. 일반적으로 콜로니 수 또는 콜로니 크기는 세포 종양원성의 차이를 평가하기 위해 대조군과 치료군 간에 비교할 수 있는 분석의 정량적 판독값입니다. 따라서 집락 형성이 약물 농도 증가와 반비례하는 것으로 밝혀지면 해당 약물이 시험관 내 종양 원성의 효과적인 억제제라는 결론을 도출할 수 있습니다. 반면에, 약물이 집락 형성에 영향을 미치지 않는 경우, 약물은 적절한 용량이 아니거나 효과적인 종양 형성 억제제가 아닙니다. 약물의 항종양 효과를 테스트하기 위해 부드러운 한천 분석을 사용하는 것 외에도 이 분석은 특정 유전자와 종양 형성 사이의 관계를 조사하는 데에도 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 종양원성에 대한 PADI2 발현 억제의 효과는 PADI2 특이적 siRNA 처리로 해결할 수 있습니다.

PADI는 칼슘 의존성 효소로, 시트룰린화(citrullination) 또는 탈모방(deimination3-5)으로 알려진 과정에서 양전하를 띤 아르기닌 잔기를 중성하를 띤 시트룰린으로 변환하여 단백질을 번역후 변형합니다. 우리는 최근에 펩티딜라기닌 데이미나제 2 (PADI2)가 새로운 유방암 바이오마커로 기능할 수 있으며, PADI 억제제가 초기 유방암의 후보 치료법임을 발견했다6. 예를 들어, 우리는 이전에 "pan-PADI" 억제제인 Cl-amidine이 2D 단층을 사용하여 유방암 세포의 증식을 억제하고 억제제가 3D 종양 스페로이드의 성장을 억제한다는 것을 입증했습니다6. 이 보고서에서는 이러한 연구를 확장하고, MCF10DCIS유방암 집락의 성장을 억제하는 새로운 PADI 억제제인 BB-CLA의 효능을 테스트함으로써 연질 한천 분석의 유용성을 강조합니다7. 이 실험을 위해 MCF10DCIS 세포를 사용한 이유는 이 세포가 형질전환되지 않은 인간 MCF10A 세포의 발암성 유도체이고 PADI2 단백질8의 높은 정상 상태 수준을 포함하고 있기 때문입니다. 우리는 PADI2 효소 활성이 이 세포주의 종양 형성에 중요한 역할을 하며, PADI2 활성의 BB-CLA 매개 억제가 암 진행을 억제할 것이라는 가설을 세웠습니다.

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프로토콜

3 % 아가 로스 2- 히드 록시 에틸의 제조 1.

  1. 깨끗하고 건조한 100 ml의 유리 병에, 30㎖의 증류수이어서 2- 히드 록시 아가 (아가 로스 VII) 0.9 g을 추가한다.
  2. 15 초 부드럽게의 혼합물이 소용돌이 전자 레인지. 아가로 오스 분말이 완전히 용해 될 때까지이 단계를 적어도 세 번 이상 반복합니다.
  3. 15 분 동안 용액을 함유 한 병을 압력솥.
  4. 아가로 오스 솔루션을 추가로 사용하기 전에 실온까지 냉각 할 수 있습니다. 실온에서 솔루션을 저장합니다.

아래 층의 2. 준비 : 0.6 % 아가 로스 젤

  1. 취급시 피펫에 응고에서 아가로 오스를 방지하기 위해 5 ㎖와 37 ° C 배양기에서 10 ml의 피펫 사전 따뜻한 몇 가지.
  2. 부분적으로 병 뚜껑 마이크로파 15 초 동안 미리 만들어진 3 % 2- 히드 록시 아가로 오스 용액을 느슨하게. 그런 다음, 부드럽게 또 다른 15 초에 대한 솔루션과 전자 레인지를 소용돌이 친다. 주의 : 아가 소용돌이 때주의자체 솔루션 용액이 공기에 노출 이상 유출 할 수있을 때까지 상승하기 때문이다.
  3. 병에 잔류 고체 젤, 몇 초 동안 전자 레인지가있는 경우.
  4. 조기 고화 아가 용액을 방지하기 위해 다음 단계에서 45 ° C의 물 중탕에서 아가로 오스를 포함하는 용액을 보관 용기.
  5. 37 ° C의 물을 욕조에 따뜻한 MCF10DCIS 미디어. 참고 : MCF10DCIS 미디어는 DMEM / F12, 5 % 말 혈청, 5 % 페니실린 스트렙토 마이신으로 구성되어 있습니다.
  6. 전송 멸균 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 예열 피펫을 사용하여 3 % 아가 로즈 용액 3 ㎖.
  7. 즉시 따뜻한 MCF10DCIS 미디어의 12 ml에 추가하고 부드럽게 미디어와 아가로 오스를 혼합 원뿔 튜브를 반전. 그것은 식민지 나중에 계산을 방해하므로 모든 거품을 형성하지보십시오.
  8. 부드럽게 기포를 형성하지 않고 6 웰 배양 플레이트의 각 웰에,이 혼합물을 2 ㎖를 추가한다.
  9. 6 웰 배양 판 horizo​​nta을 품어에서야 1 시간 동안 4 ° C에서 평평한 표면에 혼합물이 응고 할 수 있도록합니다.
  10. 혼합 응고 후, 30 분 동안 37 ° C를 인큐베이터에 접시를 놓습니다. 바닥 층을 사용할 준비가 된 것입니다.

셀 함유층 3. 제조 : 0.3 % 아가로 스겔

  1. 를 Trypsinize MCF10DCIS 세포를 4 × 104 / ml의 세포 농도로 희석.
  2. 멸균 50 ML 원뿔 튜브에 미리 예열 피펫 및 전송을 사용하여 3 % 아가로 오스의 2 mL를 취하여.
  3. 즉시 원뿔 튜브에 MCF10DCIS 미디어의 8 ml에 추가하고 부드럽게 미디어와 아가로 오스를 혼합하는 반전. 모든 거품을 형성하지 마십시오.
  4. (0 μM (DMSO) 또는 1 μM)을 MCF10DCIS 세포 (4 × 104 / ㎖) 2 mL를 취하여 BB-CLA로 처리.
  5. 1 : 1 희석, 0.6 % 아가로 오스와 세포를 섞는다.
  6. 세포 혼합물을 아가로 1 ㎖를 취하여 부드럽게 6 웰 배양 (P)의 바닥층 상에 추가후반 (2 × 104 세포 / ㎖).
  7. 상단 층이 응고 할 수 있도록 적어도 15 분 동안 4 ° C에서 평평한 표면에 수평으로 6 웰 배양 판을 놓습니다.
  8. 혼합 응고 후, 공급 층을 추가하기 전에 일주일 동안 37 ° C의 인큐베이터에 접시를 놓습니다.

세포층 4. 준비 : 0.3 % 아가 로스 젤

  1. 전자 렌지 15 초 동안 미리 만들어진 3 % 2- 히드 록시 아가 용액. 부드럽게 다른 15 초에 대한 솔루션과 전자 레인지를 소용돌이 친다.
  2. 45 ° C의 물을 욕조에 아가로 오스 솔루션 병 평형.
  3. 37 ° C의 물을 욕조에 MCF10DCIS 미디어를 따뜻하게.
  4. 50 ML 원뿔 튜브에 따뜻한 MCF10DCIS 미디어의 9 ml의 3 % 아가로 오스 액 1ml를 섞어 부드럽게 미디어와 아가로 오스를 혼합하는 반전. 공기 방울을 형성하지 마십시오.
  5. BB-CLA와 혼합물 (0 μM (DMSO) 또는 1 μM)을 치료.
  6. 부드럽게에 대한없이 (이 혼합물 1 ㎖를 추가밍 바닥 연질 층을 포함하는 6 웰 배양 플레이트의 각 웰에) 거품.
  7. 혼합물이 응고 할 수 있도록 적어도 15 분 동안 4 ° C에서 평평한 표면에 수평으로 6 웰 배양 플레이트를 놓습니다.
  8. 피더 층이 굳은 후, 37 ° C 배양기에 접시를 놓습니다.
  9. 콜로니 형성이 관찰 될 때까지 새로운 매체를 사용하여 세포를 보충하기 위해 기존의 세포층에 0.3 % 아가로 오스 / 중 / 처리 용액 1 ㎖를 중첩하여이 공급 절차 주간를 반복합니다. 주 : 한천 부드럽고 피더 레이어 것은 따라서, 피더 레이어에서 추가 영양분 용이 세포에 도달하는 셀 - 함유 층으로 확산되며, 매우 부드럽고.

5. 데이터 수집

  1. 소프트 한천에 세포 성장 2.5 주 후, 각 웰을 광학 현미경을 사용하여 콜로니 수를 카운트. 정량을 용이하게하기 위해, 투명도에 그리드를 인쇄에 그리드를 부착6 웰 플레이트는 세포가 계산하는 동안 어디에 찾을 수 있도록 도와줍니다. (각 식민지의 직경에 의해 정량화 등) 식민지의 크기가 달라질 수 있기 때문에, 채점되는 식민지 결정하는 기준 식민지 크기를 미리 정의. 예를 들어, 70 μm의 또는 데이터 분석의 큰 콜로니의 크기를 포함한다.
  2. 더 콜로니 형성과 미래에 대한 계산을 방지하기 위해 4 ° C에서 샘플을 저장합니다. 이 건조 겔을 방지 파라 필름 6 웰 배양 접시를 밀봉.

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결과

소프트 한천 콜로니 형성 분석은 암세포의 종양 유발 문서화 광범위한 애플리케이션에 사용될 수있다. 이 기술의 주요 장점은 반고체 매트릭스 선택적 앵커리지 독립적 인 방식으로 증식 할 수있는 세포의 성장을 선호한다는 것이다. 이 특성은 주로 암세포가 아닌 일반 세포에 의해 발휘된다. 우리는 주로 약물에 의해 종양 성장 억제의 효과를 테스트하고 유방암 세포의 종양 유발에서 과발현 또는 PADI 유전자를 포함하여 우리의 관심 유전자의 고갈의 효과를 테스트하기 위해이 기술을 사용한다. 여기서는 PADI2 MCF10DCIS 과발현 세포의 종양 형성 억제에 BB-CLA의 효과 평가 (도 1 및도 2).

결과는 BB-CLA 크게 MCF10DCIS 세포 유래 콜로니 형성을 억제하는 것을 보여준다.도 3은 도시, 그 PADI 억제제의 존재하에, t DMSO 제어에 비해 모두 여기 콜로니 형성 및 콜로니 크기가 감소했다. ...

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토론

소프트 한천 콜로니 형성 속도는 세포의 종류에 따라 달라 9. 따라서, 셀의 수는 최적화하고 그에 따라 조정되어야로 시작. 제안 된 초기 범위는 잘 6- 웰 플레이트를 이용하여 당 4~10 X 10월 2일부터 1일까지 X (5) 사이의 세포이다. 또한, 콜로니 크기는 각 셀의 성장 속도에 따라 변화한다. 따라서, 콜로니 크기 소정 컷오프 하류 정량적 분석에 대한 개별 콜로니 주석 필요하다. 여기서, 더 이상 70 μm의 도금은 초기로부터 유도되지 않은 세포 증식의 포함을 피하기 위하여 정량 콜로니.

3D 아가 로스 젤을 할 때 최적 성장을 위해, 그것은 일반적으로 2 차원 세포 배양에 사용되는 동일한 세포 배양 배지를 사용하는 것이 바람직하다. 종종 매체를 변경하면, 따라서 세포가 새로운 매체에 적응할 수 있도록하기 위해 추가 계대를 필요로, 세포의 성장 속도를 변경하기 때문이다. 예를 들면, MCF10DCIS 세포는...

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공개 사항

저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

기술적 조언을 제공해 주신 코넬 대학교의 Richard Cerione 박사, Marc Antonyak 박사, Kelly Sullivan과 Olympus CKX41 도립 현미경을 공유해 주신 코넬 대학교의 Gerlinde Van de Walle 박사에게 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Zeiss AxiopotCarl Zeiss 현미경 1021859251
도립 현미경OlympusCKX41
DMEM/F-12Lonza BioWhittaker12-719F
HyClone 기증자 말 혈청Fisher ScientificSH30074.03
페니실린 스트렙토마이신생명 기술15140-122
2-하이드록시에틸라가로오스: 유형 VII, 낮은 겔화 온도시그마-알드리치39346-81-1

참고문헌

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