우리는 체외 유래 마스트 세포의 생성을 위한 방법, 유방 세포 결핍 마우스로그들의 이식, 및 다른 해부학 적인 사이트에 이식된 유방 세포의 표현형, 숫자 및 분포의 분석을 기술합니다. 이 프로토콜은 생체 내에서 마스트 세포의 기능을 평가하는 데 사용할 수 있습니다.
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이 논문에서
요약
초록
비만 세포 (MC)는 다양한 조직에 상주하는 조혈 세포이며, 특히 피부, 기도 및 위장관과 같은 외부 환경에 노출 된 부위에 풍부합니다. IgE 의존성 알레르기 반응에서 해로운 역할로 가장 잘 알려진 MC들은 독과 침입 하는 박테리아와 기생충에 대 한 호스트 방어에 중요 한 선수로 등장 했다. MC 표현형 및 기능은 해부학적 위치에 따라 다를 수 있는 미세 환경적 요인및/또는 면역 반응의 발달의 유형 또는 단계에 따라 영향을 받을 수 있다. 이러한 이유로, 우리와 다른 MC 기능에 대 한 통찰력을 얻기 위해 체 외 메서드를 통해 생체 내 접근에 선호 했다. 여기서는 마우스골수 유래 배양MC(BMCMC), 유전자 MC-결핍 마우스로의 입양 이송, 양상에서 입양된 MC의 수 및 분포 분석 등을 설명하고 있다. '마스트 셀노크인' 접근법이라는 이름의 이 방법은 지난 30년 동안 MC와 MC 파생 제품의 기능을 생체내에서평가하는 데 광범위하게 사용되어 왔다. 우리는 최근 몇 년 동안 개발 된 대체 접근 방식에 비추어이 방법의 장점과 한계에 대해 논의합니다.
서론
비만 세포(MC)는 다능성 골수선조1-3에서발생하는 조혈 세포이다. 골수 회귀에 이어 MC들은 지역성장인자의영향으로 성숙한 MC로 발전하는 다양한 조직으로 이주한다. 조직 거주자 MC는 피부, 기도 및 위장관과 같은 호스트 환경 인터페이스에 전략적으로 위치하며, 외부 모욕에 대한 방어의 첫 번째 선으로행동합니다 3-6. MC는 종종 자신의 "기준"표형 특성과 해부학 위치에 따라 하위 분류된다. 마우스에서는 MC의 두 가지 유형이 설명되었습니다 : "결합 조직 형" MC (CTMC) 및 점막 MC (McC)1-3,7,8. CTMC는 종종 정맥 과 신경 섬유 근처에 위치하고, 혈청 구멍에 거주, MmCs는 창자 및 호흡점막1-3의상피 위치를 차지하는 동안.
9-13MC의생물학적 기능을 연구하기 위해 수많은 방법론이 적용되었다. 많은 그룹은 세포주(인간 MC 라인 HMC114 또는 LAD215,16)를사용하여 체외 접근법에 초점을 맞추고 있으며, 체외 유래 MC(예: 인간 말초 혈액 유래 MC17)또는 마우스 골수 유래 배양MC [BMCMC]18,<....
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프로토콜
모든 동물 관리 및 실험은 건강의 국가 학회의 지침과 스탠포드 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회의 특정 승인을 준수하여 수행되었다.
1. 골수 유래 배양 돛대 세포의 생성 및 특성화 (BMCMC).
참고: 기증자 BMCMC는 받는 사람 MC-결핍 마우스와 동일한 유전 배경의 골수 세포에서 생성되어야 합니다. 남성 유래 기증자 BMCMC는 여성 마우스의 이식에 적합하지 않습니다. 여성 유래 기증자 BMCMC는 성공적으로 남성과 여성 받는 사람 모두에 이식합니다.
- 골수 추출.
- 멸균 인산염 완충식식염(PBS)을 6개의 웰 배양판(마우스당 1음)에 붓고 얼음 위에 놓습니다.
- 해부 기기를 70% 에탄올에 담그면 멸균을 위해 몸을 담그십시오.
- 이산화탄소(CO2)흡입에 의해 기증자 마우스를 안락사시키고 자궁 경부 탈구로 마우스를 분사한 다음 조작 부위에 70%의 에탄올로 마우스를 분사합니다.
- 멸균 해부 기구를 사용하여 뼈 에피피를 자르지 않고 대퇴골, 경골 및 비골 뼈를 추출하십시오.
- 집게로 뼈를 고정하는 동안 멸균 가위 (또는 메스 블레이드)를 사용하여 뼈에서 모든 조직을....
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결과
'마스트 세포노크-인'접근법의 개요는 도 1에도시되며, BMCmC의 생성, i.p., 즉 mc-결핍 마우스로 이식해야 하는 세포의 수(실험 설계에 따라 표시될 경우 숫자가 달라질 수 있음) 및 주사 부위에 따라 이식 및 실험 사이의 간격을 포함할 수 있습니다(이 에 따라 달라질 수 있습니다.) 예를 들어,MC 세포질 과립에 저장된 중재자의 함량은38시에꾸준히 증가한다.) 도 2는 IL-3의 원천으로서 20%의 WEHI-3 세포 조절 배지를 함유하는 DMEM 배지에서 1, 15 및 45일 배양 후 BMCmC의 대표적인 유동 세포 분석 및 토루이딘 블루 염색을 나타낸다. 45일 동안 배양된 BMCmCs는 95% 순수하며, 세포질 과립의 수가 많으며 이식 실험에 사용할 수 있으며, 15일 동안 배양된 세포는 이식에 적합하지 않습니다. 도 3은 i.d. engraftment(도 3.......
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토론
초기 설명 38 년 후 거의30년,'돛대 세포 노크 -in'접근 방식은 MC가 할 수있는 일또는 생체 내에서 할 수없는 일에 대한 귀중한 정보를 계속 제공하고 있습니다. MC의 기능은 오랫동안 알레르기에 있는 그들의 역할에 국한된 것으로 생각되었습니다. '마스트 셀 노크-인'접근법을 이용하여 생성된 데이터는 MC가 특정 병원균4,39또는 독28,31에 대한 호스트 방어에 중요한역할을 할 수 있다는 증거를 제공함으로써 이러한 견해를 변화시켰으며, 또는 특정 면역 반응을 억제할 수있다 29,34,40일까지.
우리의 프로토콜 설명에서, 우리는 골수 유래 배양 MC (BMCMC)의 생성 및 이식에 집중하기로 결정했습니다, 이러한 세포의 많은 수는 야생 유형 또는 돌연변이 마우스의 골수에서 체외에서 생성 될 수 있기 때문에. 그러나, MC들은 배아.......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
N.G.는 프랑스 "퐁디앙 부어 라 레체르체 메디칼 FRM"과 필립 재단의 펠로우십의 수혜자입니다. R.S.는 어린이 건강을 위한 루실 패커드 재단과 스탠포드 NIH/NCRR CTSA 어워드 번호 UL1 RR025744; P.S.는 막스 케이드 재단과 오스트리아 과학 아카데미의 막스 케이드 펠로우십과 오스트리아 과학 기금(FWF) 슈로딩거 펠로우십: J3399-B21의 지원을 받고 있습니다. S.J.G.는 국립 보건원의 지원을 U19 AI104209, NS 080062 및 캘리포니아 대학의 담배 관련 질병 연구 프로그램에서 승인합니다. L.L.R.은 관절염 국립 연구 재단 (ANRF)과 국립 보건 원 보조금 K99AI110645의 지원을 인정합니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 1% 항생제-항진균 용액 | Corning cellgro | 30-004-Cl | |
| 3ml 주사기 | Falcon | 309656 | |
| 35mm x 10mm 접시 | Corning cellgro | 430588 | |
| 5ml 폴리스티렌 원형 바닥 튜브 | Falcon | 352058 | |
| Acetic Acid Glacial | Fisher Scientific | A35-500 | |
| Alcian Blue 8GX | Rowley Biochemical Danver | 33864-99-2 | |
| Allegra 6R 원심분리기 | Beckman | ||
| 안티 마우스 CD16/32(클론 93) 정제 | eBioscience | 14-0161-81 | |
| 2-메르캅토에탄올 | 시그마 Aldrich | M7522 | |
| BD 1ml TB 주사기 | BD 주사기 | 309659 | |
| BD 22G x 1(0.7mm x 25mm) 바늘 | BD 정밀 글라이드 니들 | 205155 | |
| BD 25 G 5/8 바늘 | BD 주사기 | 305122 | |
| BD 30 G x 1/2 바늘 | BD 프리시전 글라이드 | 305106 | |
| 블루 MAX Jr, 15 ml 폴리프로필렌 원뿔형 튜브 | 팔콘 | 352097 | |
| 클로로포름 | Fisher Scientific | C298-500 | |
| Cytoseal 60 마운팅 매체 | Richard-Allan Scientific | 8310-4 | |
| Cytospin3 | Shandon | NA | |
| DakoCytomation 펜 | Dako | S2002 | |
| Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) 1x | Corning cellgro | 15-013-CM | |
| 에탄올 | 시그마 Aldrich | E 7023-500ml | |
| 소 태아 혈청 열 비활성화 | 시그마 Aldrich | F4135-500ml | |
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| 포름알데히드 | Fisher Scientific | F79-500 | |
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| 이소테시아 | Henry Schein Animal Health | 29405 | |
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| 재조합 마우스 SCF | Peprotech | 250-03 |
참고문헌
- Kitamura, Y. Heterogeneity of mast cells and phenotypic change between subpopulations. Annu. Rev. Immunol. 7, 59-76 (1989).
- Galli, S. J., Borregaard, N., Wynn, T. A. Phenotypic and functional plasticity of cells of innate immunity....
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