방법 논문

지방 조직의 종점에 이식 캡슐화 열 발생 Preadipocytes

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DOI:

10.3791/52806

⸱

2015년 6월 2일

 ,  ,  ,  , 
1Department of Human Sciences, The Ohio State University, 2Department of Minimally Invasive Surgery, The First Affiliated Hospital of Soochow University, 3NSF Nanoscale Science and Engineering Center for Affordable Nanoengineering of Polymeric Biomedical Devices, The Ohio State University

이 논문에서

요약

여기에서는 복강 내 지방 조직에서 열 생산을 위해 지질을 소비하고 비만 마우스의 에너지 소산을 증가시키는 이화 세포의 캡슐화 프로토콜을 제시합니다.

초록

세포 캡슐화 반투막 내에 생존 세포를 포획하기 위해 개발되었다. 접목 캡슐화 된 세포를 장기 생존율을 달성하기 위해 처리 된 숙주의 조직에 저 분자량 대사를 교환 할 수있다. 반투막 면역계에 의해 거부를 피하기 위하여 캡슐화 된 세포를 접목 허용한다. 캡슐화 과정은 인슐린과 같은 생체 활성 화합물, 기타 호르몬, 사이토 카인의 방출을 제어 할 수 있도록 설계되었다. 여기서 우리는 비만 마우스의 복강 지방 조직에 열 발생과 에너지 손실 (열 발생)에 대한 지질 소비 이화 세포 캡슐화하는 방법을 설명한다. 열 발생 이화 세포의 캡슐화는 비만의 예방 및 치료에 잠재적으로 적용 가능하고 2 형 당뇨병있다. 이화 셀들의 또 다른 잠재적 인 애플리케이션은 알코올 대사 또는 기타 독성 및 환경 오염 물질의 해독을 포함 할 수있다.

서론

만성 질환 1의 증가 빈도는 치료 세포 인구 2의 이식에 대한 연구를 자극했다. Syngenic 동종 또는 줄기 세포는 이러한 애플리케이션 2에 대한 가장 일반적으로 사용되는 세포 유형이다. 그러나 이러한 치료는 이식 후 분화 줄기 세포의 이동의 제어를 허용하지 않는 효율적인 비용이되지 않습니다. 유익한 기능을 가진 유전자 변형 세포의 이식은 많은 질병의 치료 개선을 기대하고있다. 그러나, 유전자 세포 변형이 호스트의 면역 시스템에 의해 인식되고, 따라서, 이러한 치료는 면역 3이 필요합니다. 인슐린 생성 세포의 캡슐화 박사 창 (4)에 의해 개발되었다. 기술은 염화칼슘 수용액에 침지 알긴산 방울 세포의 캡슐화에 기초한다. 알긴산 분자 (G) (M) 만누 및 guluronic 산 구성 및 CA로 연결 될 수 2+. 겔화 후, 비드를 폴리 -L- 라이신 (PLL) 용액에 현탁된다. 이 단계에서, PLL은 캡슐의 멤브레인을 설정 알지네이트 분자에 G와 M에 결합한다. 캡슐의 막의 다공성은 M 및 PLL 농도, 인큐베이션 시간, 온도 변화에 의해 조절 될 수있다. PLL의 결합도 유형과 알긴산의 농도에 따라 달라집니다. 칼슘 이온과 가교 알긴산 행렬, 생리 학적 환경이나 인산과 구연산 이온의 농도가 높은 일반적인 버퍼 솔루션의 불안정하다. 이 버퍼는 알긴산에서 칼슘을 추출하고 핵심을 녹일 수 있습니다. 알지네이트 코어의 액화는 세포 이동과 성장을위한 캡슐 내부에 공간을 제공합니다. 폴리 양이온 폴리 -L- 라이신 (APL)와 음이온 알지네이트에 캡슐화 된 세포는 면역 글로불린에 대한 침투하지만 독소의 영양소의 유입과 유출이 있습니다. 이 APL의 특성은 장기 SU 가능유 전적으로 서로 다른 호스트로 이식 후 캡슐화 된 세포의 rvival. 엘리엇 등 알. 구년 주입 후 5 인간의 환자에서 캡슐 돼지의 췌장 세포 기능의 생존을보고했다.

캡슐화 기술은 마이크로 캡슐화 (3-800 μm의) 및 macroencapsulation (1000 μm의보다 큰)로 분류 될 수있다. 마이크로 캡슐은 macrocapsules 6보다 더 내구성. 박사 장과 1964 년 동료의 발견 이후, 마이크로 캡슐화 널리 인슐린을 생산하는 근육 세포, 다른 호르몬 및 생리 활성 분자 (7)의 캡슐화를 위해 사용되어왔다. 이러한 치료는 섬유화 및 면역 반응 (8)를 포함하는 호스트 조직의 여러 도전에 직면했다. 우선, 생체 고분자의 품질과 관련된 부작용이 해결되었다. 그러나, 근육 세포의 이식은 여전히​​ 호르몬 overpr의 결과로서, 예컨대 섬유증과 같은 부작용을 개시전문 동맥의 외부 PREPARATION 기초 조작 ADVANCED.

최근 수십 년간, 비만과 제 2 형 당뇨병은 전염병 비율 9에 도달했습니다. 성인 사람들의 30 % 이상은 전 세계적으로 과체중과 비만 (10)이다. 증가 된 복강 (IAB) 지방 형성은 만성 염증의 발생 빈도를 증가시키고, 제 2 형 당뇨병, 심혈관 질환, 특정 암 및 기타 합병증 11-13을 촉진합니다. 증거의 여러 라인은 IAB 지방과 관련된 기전이 특정 지방 세포에 의해 피할 수 있음을 제안했다. 최근의 연구는 신진 대사를 개선하고 생체 (14) 설치류에서 비만과 인슐린 저항을 줄일 수 IAB 영역으로 피하 지방 세포의 이식을 보여 주었다. 비만과 인슐린 저항성의 효과적인 감소는 열 (15, 16)의 형태로 에너지를 방출 할 수있는 열 발생 지방 세포와 연결되었습니다. 지방 세포의 열 발생은 안정한 형질 변형함으로써 달성 될 수있다이러한 언 커플 링 단백질 1 (UCP1)로서 또는 다른 열 발생 및 UCP1 유전자 15,16의 발현을 조절하는 유전자의 미토콘드리아의 언 커플 링 프로톤, 참여 유전자. 우리의 최근의 연구는 알데히드 탈수소 효소 (1) A1 (Aldh1a1)의 결핍이 쥐 17, 18에서 비만과 인슐린 저항을 감소 IAB 지방의 열 발생 리모델링에 이르게 것으로 나타났다. 특히, 열 발생 Aldh1a1 결핍의 캡슐화 (Aldh1a1는 - / -) preadipocytes는 IAB 지방 (18)의 치료를위한 새로운 치료 기회를 제안, 비만 야생형 마우스에 IAB 지방에 같은 치료 효과를 매개한다. 실험 설정에서 캡슐화 된 세포는 비용 효과적인 방법으로 19에서 특정 세포 집단의 효과를 연구하기 위해 연구자 수 있습니다. 여기에서는 비만의 마우스 모델에서 열 발생 이화 세포주의 캡슐화 및 실험실 및 치료 적용 방법을 논의한다. 이 프로토콜은 T를 설명마이크로 캡슐의 제조 (도 1)에 대한하는 hree 단계 : 알지네이트 마이크로 비드 (도 1a), 폴리 양이온 성 폴리 -L- 라이신 (PLL) 마이크로 비드의 표면 (도 1b)에 멤브레인의 형성 및 제거의 형성 알지네이트 코어 (그림 1C).

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프로토콜

연구 프로토콜은 오하이오 주립 대학 윤리위원회에 의해 승인되었다. 동물 실험은 IACUC 프로토콜에 의해 승인되었다. 모든 절차는 층류와 레벨 2 바이오 안전성 캐비닛에서 수행 하였다. 우리는 모든 표준 안전 요구 사항 및 절차를 따랐다. 마이크로 캡슐의 제조를위한 마이크로 캡슐화 기술은, (18) (17) 기재된 바와 같이 수행되었다.

재료 1. 준비

  1. 멸균 생리 식염수 (물 중 0.9 % 염화나트륨)에 2 %의 알긴산 나트륨 용액 10 ㎖를 준비한다. 생리 식염수 0.05 % PLL 솔루션을 준비합니다. 전날 이러한 솔루션을 준비하고 밤새 교반. 사용하기 전에 0.22 μm의 필터를 사용하여 솔루션을 필터링합니다.
  2. 50 mM의 시트르산 나트륨 0.9 % 염화나트륨 용액에 100 mM의 CaCl2를 준비하고이를 오토 클레이브.
  3. 모든 솔루션, 바늘, 전극 및 비커를 압력솥. 막힘 방지하기 와이어 철저히 바늘.
  4. (102 마이크로 캡슐이 아니라 모든 CM이 필요한 캡슐 (18) 당 500 세포가 약가된다) 캡슐에 사용할 세포의 적절한 양을 결정합니다. 이백만 세포 당 알긴산 나트륨 1 ㎖를 사용합니다.
  5. 높은 혈당에 '섬유 아세포 성장 보통'포함 10 % 혈청, 100 U / ml의 페니실린 / 스트렙토 마이신을 준비 (4,500 ㎎ / ℓ의 포도당) 둘 베코의 수정 이글의 중간 (DMEM).
    1. DMEM에서 10 % 소 태아 혈청, 10 μg의 / ㎖ 인슐린, 1 μM 덱사메타손 (dexamethasone), 0.5 mM의 3- 이소 부틸 -1- 메틸 크 산틴, 100 U / ml의 페니실린 / 스트렙토 마이신을 함유하는 '분화 중간 I'를 준비한다.
    2. DMEM에서 '분화 중간 II'함유 10 % 소 태아 혈청, 10 μg의 / ㎖ 인슐린, 100 U / ml의 페니실린 / 스트렙토 마이신을 준비한다.
  6. (RI를 10 ml의 라​​디오 - 면역 침전 분석 완충액 당 프로테아제 억제제 정제를 함유하는 용해 버퍼를 준비PA 버퍼).

2. 알긴산 마이크로 비드 준비 (그림 1A)

  1. 세포 배양 플라스크에서 오래된 매체를 제거합니다. PBS의 10 ㎖로 세포를 씻어. 0.25 % 트립신 - EDTA (일 합류 T175 플라스크 당 2 ml)로 서스펜션에 세포를 가져와.
  2. 혈구를 사용하여 세포 현탁액에서 세포를 계산합니다. 세포 현탁액에서 10 ml의 나누어지는을 사용하여 제조업체의 지침에 따라 세포를 계산합니다. 5 분 동안 실온에서 480 XG에서 원심 분리 배지에 남아있는 세포를 원심 분리기.
  3. 단계 1.4에 기재된 바와 같이 알긴산 나트륨의 세포 펠렛을 일시. 5 mL의 주사기에 알긴산 나트륨 용액 세포 이동.
  4. 23 게이지 바늘을 추가, 용액의 기포를 제거하고 공기의 1 ml의 포켓을 만들 주사기를 반전.
  5. 캡슐의 바늘 주둥이에서 100 mM의 염화칼슘 2 용액 144 ml의를 포함하는 작은 비커 (180 ml)에 놓습니다. 팁 approxim로 캡슐에 전극을 부착100 mM의 CaCl2를 용액의 표면 위 ately 2.5 cm.
  6. 단단히 주사기 펌프에 알긴산 나트륨을 세포를 포함하는 용액을 주사기 놓는다. 주사기의 구멍에 고무 튜브를 연결합니다. 알긴산 나트륨 셀 솔루션은 튜브를 통해 중간에 들어갈 때까지 플런저를 밀어 넣습니다. 5.4 kV의에 전압을 조정합니다. 주사기 펌프에 12.06 mm 직경을 설정합니다. 3 ㎖ / 시간에 속도를 조정합니다. 펌프를 시작합니다. 캡슐의 전원을 켜고 5.4 kV로의 전압을 유지한다.
  7. 후드의 창을 닫고 알긴산 마이크로 비드의 형성 끝날 때까지 불필요한 진동을 피하십시오. 모든 용액이 바늘을 통과 한 후, PLL로 코팅하기 전에 추가로 20 분 동안 100 mM의 CaCl2를 용액에 알긴산 공 모양의 마이크로 비드를 고화.

PLL 3. 코팅 마이크로 비드 (그림 1B)

  1. 알긴산 나트륨 셀 볼 형상 마이크로 비드를 함유하는 비이커를 제거하고 이들 microb 전송할50 ㎖ 원심 분리 튜브에 EADS. 마이크로 비드 펠렛에서 염화칼슘 2 용액을 제거합니다.
  2. 0.9 %의 NaCl 30 ㎖를 첨가하여 알긴산 세포 공 모양의 마이크로 비드를 씻는다. 부드럽게 손으로 튜브를 흔들어. 마이크로 비드가 중력에 의해 침전 한 후 25 mL를 피펫으로 0.9 %의 NaCl을 제거합니다. 3 세척 총 두 번 더 반복합니다.
  3. 알긴산 나트륨 수용액의 각 1 ml를 0.05 %의 PLL 용액 10 ㎖을 사용한다. 10 분 동안 분당 1,000 회전에서 0.05 % PLL과 소용돌이를 추가합니다.
    주 : 일반적으로, 10 분 PLL 코팅 충분하다.
  4. PLL 코팅이 형성된 후에, PLL 용액을 제거하고, 3.2에 기재된 바와 같이 캡슐을 3 회 세척 하였다.

알긴산 코어 4. 제거 (그림 1C)

  1. 50 mM 시트르산 나트륨 용액 30 ㎖를 추가한다. 5 분 또는 모든 알긴산 나트륨이 용해 될 때까지 기다립니다. 단계 3.1.1에 기재된 바와 같이 세척 세 번 캡슐.
  2. , 0.9 % NaCl을 제거 50 ML 튜브에 배지 20 ㎖를 추가및 세포 배양 용 플라스크에 세포를 포함하는 모든 캡슐을 전송. 표준 세포 배양 조건 18 세 미만의 캡슐화 된 세포를 처리합니다.

체외 응용 프로그램 5. 세포 사이의 이종 이식 및 숙주 세포의 상호 작용이나 대사 물질 유입의 속도론 / 유출을 연구하기 위해 (그림 2)

  1. 공동 문화에 대한 합류 할 때까지 24 웰 플레이트에 문화 숙주 세포. 배양 preadipocytes의 '섬유 아세포 성장 매체'를 사용합니다.
  2. 24 웰 플레이트 함유 합류 숙주 세포 내로 전송 마이크로 캡슐. 단층을 달성하기 위해 마이크로 캡슐 (102 마이크로 캡슐 / 웰의 CM 2)를 추가합니다.
  3. 육일에 대한 차별화 중간 II에 전 지방 세포의 분화 중간 I.와 차별화마다 48 시간, 변화 미디어를 유도한다. RIPA 완충액으로 세포를 Lyse. 웨스턴 블롯을 사용하여 단백질 발현을 분석 조건 당 50 μg의 단백질을 사용합니다.

Treatm에 대한 생체 응용 프로그램 6.비만의 ENT (그림 3)

  1. 마취의 유지 보수를 위해 산소와 마취 2 % 이소 플루 란의 유도를위한 산소와 4 % 이소 플루 란을 섞는다. 발가락 핀치에 의한 적절한 마취 깊이를 확인합니다.
    1. 건조로부터 각막을 보호하기 위해 눈에 안티 가려움 연고를 적용합니다.
  2. 이러한 녹색 형광 단백질 (GFP)와 같은 영구적 인공 형광 단백질로 표시되어 캡슐화 된 세포를 사용합니다.
  3. 3 ML의 주사기 및 캡슐화 된 세포를 주입하는 20 게이지 바늘을 사용합니다.
    1. 0.5 × 10 6 세포가도 3에 도시 된 바와 같이, 생식선 및 신장 사이 복강 지역에있는 각 IAB 지방 저장소 내로 PBS 0.2 ㎖에 현탁 분사.의 평균 중량 생쥐이 PBS의 부피와 세포 수를 사용 40g. 다른 중량 용량 의존적 효과의 측정을 위해이 생쥐의 세포 수와 볼륨을 조정합니다.

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결과

도 1은 마이크로 비드 제조의 모든 단계가 현미경으로 제어 될 수 있음을 나타낸다.도 2a는 공동 배양하는 방법을 지방 세포를 캡슐화 된 세포의 단층으로 도시한다.도 2b는 지방 세포 / 마이크로 공동 배양을 이용하여 정량적 연구의 대표적인 예이며 그 지방 세포는 웨스턴 블롯을 이용하여 분석 하였다 제 5 해물에 설명했다. 캡슐화 된 세포는 본 실험에서 분석되지 않았다. 1,000 희석 차 ATGL와 β-액틴 항체는 1에서 사용되었다. ATGL의 비율은 β - 굴지의 정보는 다음의 제품에 3 개의 독립적 인 실험으로 평균 SD를 표시됩니다. 유사 공동 배양 방법은 공동 배양에 캡슐화 세포 및 지방 세포 상호 작용의 효과를 mRNA를 분석하고 연구하는데 사용될 수있다. - / - 지방 세포 encapsula에 비해 지방 세포에서 ATGL 리파제 및 지질 분해 (18)의 훨씬 높은 수준을 유도 열 발생 <...

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토론

다양한 건조 방법, 압출, 및 에멀젼을 포함하여 19 세포를 캡슐화하는데 사용되어왔다. 이 방법에서는, 알기 네이트 비드는 PLL로 코팅 및 알지네이트 코어 캡슐화를 완료 용해되고, 바늘 통해 압출된다. 이 방법이 수년 동안 사용되었지만, 원하는 크기와 형상으로 구형 비드의 형성은 여전히​​ 도전. 캡슐의 크기는 알긴산 나트륨 용액, 압출기는 직경 바늘 끝과 CaCl2를 용액 (20) 사이의 거리의 점도에 크게 의존한다. 니들 팁과 CaCl2를 용액의 표면 사이에 더 짧은 거리가 작은 구슬 일어난다된다. 설명 프로토콜은 기공 (<32 kD의)와 APL의 생산 효율을 높일 수있다. 기공 크기는 실험적으로 미리 18 바와 같이 형광 면역 글로불린 (> 32 kD의) 형광 작은 펩티드를 사용하여 테스트 할 수있다. 이이야기공의이지는 2 주 동안 적어도 팔십일 18 지방 조직으로 주입 한 후 생체 내...

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공개 사항

이해 상충이 선언되지 않았습니다.

감사의 글

우리는 편집 도움 제니퍼 Petrosino 다윗 DiSilvestro에게 감사의 말씀을 전합니다. 이 연구는 미국의 계란 이사회와 노보 노 디스크 제약에서 상 번호 10040042에서뿐만 아니라 OSU에서 식품 혁신 센터, 사무실 국제 문제에 대한 고급 기능 식품 연구 센터 및 기업가 정신에 의해뿐만 아니라 같은 상 번호 20020728에 의해 지원되었다 국립 과학 재단 (National Science Foundation)은 EEC-0914790 (LJL)을 부여합니다. 의료 연구에 대한 NIH 로드맵에 의해 건강 (OD)의 이사, 국립 연구소의 사무실에 의해 투자 및 지원 연구 자원을위한 국가 센터에서 수상 번호 R21OD017244 (OZ)과 UL1RR025755 (OSUCCC)에 의해 지원되었다 기술 프로젝트, NCI P30CA16058. 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 연구 자원을위한 국가 센터 또는 국립 보건원의 공식 견해를 대변하지 않습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
캡슐화 장치 (VAR V1)NiscoLIN-0042없음
KD 과학 주사기 펌프KD 과학780100Y없음
올림푸스 현미경 Olympus OpticalIX70-S8F2없음
알긴산 나트륨시그마MKBP8122V없음
폴리-L-라이신 하이드로 브로마이드 (PLL)시그마020M5006V없음
염화칼슘그마SLBJ2662V없음
구연산 나트륨 삼염기 이수화물시그마030M0200없음
염화나트륨시그마SLBD2595V없음
Mini-PROTEAN TGX GelsBio-Rad456-1093없음
ATGL 1차 항체(토끼에서)Cell Signaling2138S없음
2차 항체(토끼 방지)LI-COR926-68071없음
Radio-Immunoprecipitation Assay (RIPA) bufferBoston BioProductsD25Y6ZNone
Phosphate buffered 식염수 (PBS)SigmaRNBD2893없음
TrypsinGibco25200-056없음
Cortizone 10 anti-itch ointmentCortizone 10C4029138없음
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Gibco11965-092None
Newborn calf serum (CS)SigmaN4762None
Fetal bovine serum (FBS)SigmaF4135없음
3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)SigmaI0516없음
덱사메타손SigmaD4902없음
인슐린(소)SigmaI5879
없음 프로테아제 억제제 칵테일 정제Roche4693159001없음
시

참고문헌

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