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방법 논문

루시퍼 라제 리포터 유전자 RAW264.7 세포를 형질

21.5K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/52807

⸱

2015년 6월 18일

 ,  ,  , 
1Immunity and Infection Research Centre, Vancouver Costal Health Research Institute, 2Department of Surgery, University of British Columbia, 3Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of British Columbia

이 논문에서

요약

대식세포 세포주 RAW264.7로의 형질주입은 이물질에 대한 세포의 자연적인 반응으로 인해 어렵습니다. 여기에서는 루시퍼라제 리포터 유전자를 RAW264.7 세포에 transfection하기 위한 부드럽지만 강력한 절차를 설명했습니다.

초록

원하는 유전 물질을 세포로 형질주입하는 것은 생물 의학 연구 연구에서 불가피한 절차입니다. 수많은 방법이 설명되었지만, 특정 유형의 세포는 이러한 방법 중 다수에 내성이 있고 형질주입 효율이 낮기 때문에1 이러한 세포 유형에 대한 연구를 방해할 수 있습니다. 이 프로토콜에서는 플라스미드 DNA인 루시페라제 리포터 유전자를 RAW264.7 대식세포 세포주에 도입하기 위한 최적화된 transfection 절차를 제시합니다. 두 가지 다른 유형의 transfection 시약(지질 기반 및 폴리아민 기반)이 설명되며, transfection 절차에 의해 RAW264.7 세포가 최소한으로 변경되고 얻은 모든 실험 데이터가 실험 처리의 직접적인 결과임을 보장하기 위해 프로토콜 전반에 걸쳐 중요한 참고 사항이 제공됩니다. transfection 효율은 다른 transfection 방법에 비해 높지 않을 수 있지만, 설명된 절차는 자극에 대한 세포의 생리적 반응을 변경하지 않고 RAW264.7에서 루시페라제 신호를 검출할 수 있을 만큼 충분히 강력합니다.

서론

세포의 핵산의 형질 과학 연구에서 다양한 응용 프로그램을 가지고있다. 예로는 (1) 리포터 유전자, 유전자 발현의 다른 유전자 요소의 역할을 연구하기 위해 (2) 단백 발현 플라스미드 관심 단백질을 과발현, 및 (3) 작은 RNA 간섭하는 유전자 발현을 하향 조절하기 위해 포함된다. 특정 유전자의 발현 량을 조작하는 등의 조작 차동 효과를 측정함으로써, 연구자들은 선택된 생물학적 시스템에서 유전자 기능을 추론 할 수있다. 모든 형질 전환 방법은 동일한 형질 전환 효율을 제공하고, 심지어 같은 형질 전환 방법은 균등 한 모든 유형의 세포를 형질 감염되지 않는다. 따라서, 다른 형질 전환 방법은 인산 칼슘 법, DEAE 덱스 트란, 양이온 성 지질 형질 감염, 비 양이온 성 지질 - 폴리머 형질 감염, 전기 천공, 및 2,3- nucleofection 등이 개발되었다.

대식 세포로 형질은 ESPE입니다cially 어려운 의한 대 식세포 (메틸화) DNA (4) 파생 된 박테리아를 포함하여 이물질에 매우 민감 전문 식세포가 있다는 사실에. 외래 DNA의 도입은 사이토 카인과 산화 질소 (5, 6)의 생산을 유도하는 수신자 같은 수용체 9 (TLR9) 경로를 활성화합니다. 이 활성화 된 대 식세포는 연구자가 조사하고자하는 치료에 덜 반응 할 수있다.

우리 연구소는 정기적으로 루시퍼 라제 리포터 유전자와 RAW264.7 대식 세포주를 transfects, 우리는 배경보다 훨씬 높은 루시 페라 제 신호가 충분히 강력 프로토콜을 개발하지만, 대 식세포가 휴식 상태로 유지하기에 충분한 또한 부드러운했다. 형질 감염된 세포의 행동은 IκBζ (pGL3- IκBζ)의 프로모터 영역을 은닉 반딧불이 루시퍼 라제 - 리포터 유전자에 의해 평가 하였다. IκBζ 발현 박테리아 세포벽 성분의 립에 의해 상향 조절되고opolyssacharide (LPS) 7,8, 및 항 염증성 사이토 카인에 의해 하향 조절, 인터루킨 10 (IL-10) 8. 웰 중에서 형질의 변화를 고려하기 위해 정규화 상업적 레 닐라 루시퍼 라제 유전자 (예 phRL-TK)를 포함하는 제어 플라스미드 - 형질 공동. 설명 프로토콜은 DNA 플라스미드의 다양한 형질 타이밍, 형질 전환 시약의 종류, 형질 전환 시약의 플라스미드 DNA의 양을 포함한 파라미터뿐만 아니라 형질 전환 시약의 비율 테스트 후 최적화된다. 이 프로토콜에 포함 된 두 개의 형질 전환 시약 (1) 지질 계 형질 전환 시약 및 (2) 단백질 / 폴리아민 계 형질 감염 시약이다.

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프로토콜

1. 플라스미드 DNA를 정제

  1. 제조 업체의 프로토콜에 따라 maxiprep 키트를 사용하여 플라스미드 DNA를 추출합니다. TE 완충액 500 μL에 재현 탁 플라스미드 DNA.
  2. 클로로포름 : 페놀 수행 아밀 알코올 추출 및 이소프로판올 침전 세균 잔류 오염물을 제거 하였다. LPS의 존재는 형질 9 방해한다.
    1. 플라스미드 DNA (1, pH가 8 25 : 24), 15 초 동안 격렬하게 흔들어 이소 아밀 알코올 : 클로로포름 : 페놀의 500 μl를 추가합니다. 페놀은 피부에 심한 화상을 일으키는 심각한 손상이 될 때까지 화상 항상 생각되지 않도록 마취입니다. 흄 후드에서 이소 아밀 추출 및주의하십시오 : 클로로포름 : 페놀을 수행합니다.
  3. RT에서 5 분 동안 혼합물을 인큐베이션. 실온에서 10 분 동안 13,000 XG에 원심 분리기. 새로운 1.5 ml의 수집 관에 위 수상의 350 μl를 전송합니다.
  4. 하부 유기상을 포함하는 튜브에 TE 완충액 350 μl를 추가. 15 초 동안 격렬하게 흔들어. 실온에서 5 분 동안 13,000 XG에 원심 분리기. 같은 1.5 ml의 수집 관에 위 수상의 350 μl를 전송합니다.
  5. 3 M 아세트산 나트륨 (PH 5.2)의 70 μl를 넣고 잘 섞는다. 100 % 이소프로판올 700 μl를 추가합니다. 잘 혼합하고 실온에서 10 분을 품어. 10 minat 4 ℃에서 13,000 XG에 원심 분리기. 상층 액을 제거합니다.
  6. 펠렛에 75 % 에탄올 500 μl를 추가합니다. 소용돌이 샘플은 4 ℃에서 5 분 동안 5,000 XG에 혼합하고 원심 분리한다. 상층 액을 제거합니다. DNA는 펠렛입니다.
  7. 튜브의 캡을 열고 공기가 5 실온에서 펠렛을 건조 - 10 분. 펠렛은 반투명하게한다. DNA 펠렛을 재현 탁하는 TE 버퍼의 500 μl를 추가합니다. 50 ℃에서 열 - 10 분 동안 60 °의 C는 DNA 펠렛을 용해.
  8. 260 nm의 (A260) 및 분광계와 280 nm의 (A280)에서 흡광도를 측정한다. 50 NG / μL로 A260 값을 곱함으로써 DNA의 농도를 계산한다. calculatin 의한 DNA의 품질을 평가G A260 / A280 비율. 2.0 - 고품질의 DNA는 1.8 A260 / A280 비율을 제공해야합니다.

2. 세포 배양 및 시드

  1. DMEM에서 배양 된 RAW264.7 세포는 37 ° C, 5 % CO 2 인큐베이터에서 9 % 태아 송아지 혈청 (DMEM / 9 % FCS)으로 보충. 각 통과하는 동안, 파스퇴르 피펫을 사용하여 연속 피펫으로 판에서 세포를 분리. 통로는 세포 2 일마다, 1.5 씨앗 - 주식으로 10cm 조직 배양 처리 접시에 2 백만 세포를. 6 주 - 셀마다 5의 새로운 주식을 해동.
  2. 트랜 스펙 션 당일, DMEM / 9 % FCS 500 μL 부피의 24 웰 플레이트에 웰 당 200,000 세포를 시드. 37 ° C 배양기에서 4 시간 동안 세포를 품어.
  3. 형질 세포 중 지질 계 시약 (단계 3.1) 또는 단백질 / 폴리아민 계 시약 (스텝 3.2)과.

3. 형질

  1. 지질 기반 형질 :
    1. 형질 전환 reagen을 따뜻하게T는 어둠 속에서 실온까지. 무 혈청 배지와 DMEM / 9 % FCS에 37 ° C를 따뜻하게.
    2. 1.5 ML 튜브에서 무 혈청 배지의 플라스미드 DNA 0.5 μg의 50 μl를 추가합니다. 액체의 표면 아래에 피펫 팁과 형질 전환 시약의 2 μl를 추가합니다. 6 초 동안 소용돌이.
    3. 실온에서 30 분 동안 어두운 데에서 시약 / DNA 혼합물을 남기기.
    4. 30 분 동안 배양, 우물에서 미디어를 제거하고 각 웰에 신선한 DMEM / 9 % FCS 250 μl를 추가합니다.
    5. 30 분 후, 반응물 / DNA 혼합물에 DMEM / 9 % FCS 250 μl를 추가한다. 로 pipetting 아래로 잘 섞는다.
    6. 각 웰에 희석 된 혼합물의 300 μl를 추가합니다. 37 ℃, 5 % CO 2 배양기에서 4 시간 - 2 품어.
    7. 형질 전환 솔루션을 제거하고 DMEM / 9 % FCS 500 μl를 추가합니다. 세포 자극하기 전에 37 ℃, 5 % CO 2 배양기에서 48 시간 - 24 품어.
  2. 단백질 / 폴리아민 기반 형질 :
    1. 워밍업 무 혈청매체 및 37 ° C의 DMEM는 / 9 % FCS.
    2. 무 혈청 배지의 18.75 μL에 형질 전환 시약의 0.75 μl를 추가합니다. 소용돌이는 간단히 혼합한다. 5 분 동안 실온에서 인큐베이션. 희석 된 형질 전환 시약에 1 μg의 / μL DNA의 0.5 μl를 추가합니다. 실온에서 10 분 동안 인큐베이션.
    3. 10 분 배양 동안, 24- 웰 플레이트의 각 웰로부터 매체를 제거하고, 각 웰에 250 ㎕의 신선한 DMEM / 9 % FCS를 추가한다.
    4. 10 분 후, 반응물 / DNA 혼합물에 DMEM / 9 % FCS 250 μl를 추가한다.
    5. 우물에 희석 혼합물의 270 μl를 추가합니다. 4 시간 - 2, 37 ℃, 5 % CO 2 배양기에서 품어.
    6. 형질 전환 솔루션을 제거하고 DMEM / 9 % FCS 500 μl를 추가합니다. 37 ℃, 5 % CO 2 배양기에서 48 시간 - 24 품어.

4. 세포 자극과 루시 페라 제의 분석

  1. 신선한 DMEM / 9 % FCS의 잘 250 μL 미디어를 교체합니다.
  2. 50 LPS의 μL 또는 LPS + IL 추가우물에 원하는 농도 -10. 37 ℃, 5 % CO 2 배양기에 플레이트를 돌려줍니다. 6 시간 - 2 자극한다.
  3. , 흡인에 의해 자극 솔루션을 제거 얼음 차가운 PBS로 세척하고, 1X 수동 용해 버퍼 200 μl를 추가합니다. 실온에서 30 분 동안 바위. 긁고 1.5 ml의 튜브에 해물을 전송하고 4 ℃에서 10 분 동안 20,000 XG에 원심 분리하여 세포 파편을 제거합니다.
  4. 전송 제조 업체의 프로토콜에 따라 루시 페라 제 신호를 결정하기 위해 흰색, 분명 바닥 96 웰 플레이트에 분해물 (상층 액)의 40 μL.
  5. 전체 가시 광선 스펙트럼에 걸쳐 루미와 루시 페라 제 신호를 읽어보십시오.

5. 데이터 분석

  1. 각 우물에서 레 닐라 루시퍼의 값으로 반딧불 루시 페라 제의 개별 값을 나누어 레 닐라 비율 : 반딧불을 계산합니다.
  2. 에 의해 잘 치료의 레 닐라 비율 : 반딧불을 나누어 배의 변화를 계산치료 잘하는.

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결과

그림 1은 RAW264.7에있는 두 개의 형질 전환 시약의 형질 전환 효율을 비교합니다. 단백질 / 폴리아민 계 형질 감염은 약 5 %의 효율 (도 1a)의 결과 동안 지질 계 시약은 통상적으로 약 25 %의 형질 도입 율을 주었다. 형질 감염 효율에 차이는 pGL3-IκBζ 프로모터 리포터 (도 1b)로 형질 RAW264.7 세포에서 루시페라아제 신호가 관찰되었다. 이러한 형질 감염된 세포에 LPS를 첨가 반딧불 루시 페라 제 신호, IκBζ 프로모터 기자의 증가 전사 활성의 직접적인 지시 증가했다. 즉, 결과는 LPS 이전보고와 일치 7,8 IκBζ 유전자의 발현을 상향 조절한다는 것을 제안했다. (2) 본 실험에서 얻어진 전형적인 결과를 보여주고, 예를 들어 지질 계 형질 감염을 사용. 인터넷에서 개별 신호 값을 얻은 후refly 루시페라아제 및 레 닐...

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토론

프로토콜은 전적으로 형질 감염 효율에 집중하지 않고 여기에서 설명하지만, 세포의 생리 학적 상태의 효율과 보존 사이의 균형을 유지하는 것을 목표로하고있다. 구체적으로, 우리의 방법은 형질 전환 시약의 독성을 최소화하고 루시페라아제 신호를 최대화하는데 성공.

프로토콜의 하나의 중요한 단계는 셀의 상태이다. 자란 배양 그들의 생리 변화하고, 또한 셀 (10)의 표현형 및 기능을 변경할 수 장시간 RAW264.7 세포의 연속 배양 등의 형질에 적합하지 않다. 낮은 통로 번호가 갓 해동 세포를 형질 전환을 위해 사용하는 것이 좋습니다.

또 다른 중요한 고려 사항은 형질 전환 시약의 선택입니다. 지질 기반 형질 전환 시약은 전형적으로 사용 및 상용화의 용이성에 연구에 사용됩니다. 그러나 이러한 시약 중 일부는 unintende 발생D (통상은 원하지 않는) 형질 감염된 세포를 11,12 글로벌 ...

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공개 사항

저자가 공개하는 게 없다.

감사의 글

이 연구는 캐나다 보건 연구소(Canadian Institutes for Health Research, CIHR) 보조금의 지원을 받았습니다. STC는 CIHR과 Michael Smith Foundation으로부터 박사 학위 연구상을 수상했습니다. EYS는 CIHR 장학금을 보유하고 있습니다. CIHR 이식 교육 프로그램은 또한 STC, EYS 및 SS에 대학원 장학금을 제공했습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
PureLink HiPure 플라스미드 Maxiprep 키트Life TechnologiesK210007모든 maxiprep 키트는
페놀 : 클로로포름 : 이소 아밀 알코올Life Technologies15593-049분자 생물학 등급으로 작동합니다. 페놀은 독성이 있으므로 가능하면 흄 후드에서 작업하십시오. 용기에 두 개의 액체 층이 형성되는 경우 아래쪽의 투명한 유기 층을 사용하십시오.
DMEMThermo ScientificSH30243.01웜 37 ° C 사용 전 수조.
소 태아 혈청Thermo ScientificSH30396.0356 °에서 비활성화; 사용 전 45분 동안 C 수조를 하십시오.
Opti-MEMLife Technologies31985-070사용하기 전에 최소한 실온으로 데우십시오.
XtremeGene HP DBA 트랜스펙션 시약Roche6366236001사용하기 전에 실온으로 데웁니다.
GeneJuiceEMD Millipore70967사용하기 전에 실온으로 데우십시오.
5x 패시브 용해 버퍼PromegaE194130ml는 듀얼 루시페라제 리포터 어세이 시스템
듀얼 루시페라제 리포터 어세이 시스템PromegaE1910
에 포함되어 있습니다.

참고문헌

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