방법 논문

정렬 된 불멸화 된 B 세포로부터 재조합 인간 IgG 단일 클론 항체의 생성

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DOI:

10.3791/52830

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2015년 6월 5일

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School for Mental Health and Neuroscience, Maastricht University, 2Department of Neurosciences, Institut d'Investigació Germans Trias i Pujol

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

인간 단클론 항체의 합성은 자가 항체 매개 면역 반응의 병태생리학적 메커니즘을 밝히는 것을 목표로 하는 연구의 첫 번째 단계입니다. 당사는 B 세포 분리, 항체 클로닝 및 체외 합성을 포함하여 혈액 분류 B 세포에서 재조합 인간 면역글로불린 G(IgG) 단클론 항체를 생성하는 프로토콜을 개발했습니다.

초록

인간 단클론 항체를 생성하는 새로운 방법을 찾는 것은 면역 치료제 개발을 포함하여 기초 과학 및 응용 과학 모두에 중요한 활발한 연구 분야입니다. 그러나, 이러한 항체를 확인하고 생산하는 기술은 어려운 경향이 있으며, 때로는 항체의 중쇄 및 경쇄 쌍이 해리됩니다. 여기에서는 엡스타인-바 바이러스(EBV) 및 Toll-like 수용체 9 활성화를 통한 불멸화를 사용하여 인간 말초 혈액 단핵 세포에서 인간 재조합 단클론 항체를 생산하는 비교적 간단하고 간단한 프로토콜에 대해 설명합니다. 적절한 염색을 통해 항체를 생산하는 B 세포를 분리하여 후속 불멸화 및 클론 증식을 수행할 수 있습니다. 불멸화된 B 세포 클론에 의해 생성된 항체 전사체는 PCR에 의해 증폭될 수 있으며, 해당 중쇄 및 경쇄 쌍으로 염기서열분석되고 면역글로불린 발현 벡터로 클로닝될 수 있습니다. 이 기술로 얻은 항체는 자가면역을 포함한 관련 인간 면역 반응을 연구하고 새로운 치료법의 기초를 만드는 강력한 도구가 될 수 있습니다.

서론

이 문서의 목적은 구체적으로 생성하여 인간 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)에서 얻은 인간 IgG 단일 클론 항체를 특성화하는 방법을 설명하기위한 것이다.

인간 항체를 연구 관심은 연구의 다양한 분야에서 성장했다. 특히, 많은 연구 그룹들은 자동 항체 1-3로 인한 병리학에 관심을 갖고있다. 우리는 복제 및 병원성 자동 항체 1을 특징으로했다. 자동 항체의 연구는 경쟁 항체 (4)를 사용하여, 예를 들어, 자신의 목표를 ​​확인하고 치료 전략을 개발하는 데 도움이 될 수 있습니다. 또한, 인간 항체의 연구는 또한, 백신 접종 5 이후에 면역 반응을 평가하기 위해 노출 및 특정 병원균 6 공부 내성되었다 된 개인의 항체 프로파일을 특성화하기 위해, 즉, 다른 연구 분야에서 관심을 가질 수있는 항체에자연 레퍼토리 7,12.

몇 가지 기술은 재조합 인간 단일 클론 항체 8-12를 생성하기 위해 개발되어왔다; 이들의 대부분은 파지 디스플레이와 B 세포의 불멸화를 사용한다. 파지 디스플레이의 사용은 광범위하게 새로운 항체 (13)의 발견에 적용되어왔다. 그러나 그것은가 인간 면역 글로불린의 중쇄 및 경쇄 쌍 프로세스 해리 즉 있다는 큰 단점을 갖는다. 인간 B 세포 또는 EBV 변환과 하이 브리 도마의 생산은 이러한 단점을 극복한다.

우리는 수신자 같은 수용체 9 (TLR-9)를 통해 6,12 폴리 클로 날 B 세포 자극과 조합 EBV B와 흉선 세포의 감염을 사용한다.

본 논문에서는 구체적으로 우리가 시험 관내 항체 생성에 PBMC 분리의 모든 단계의 전체 개요, IgG의 인간 항체의 개발을 위해 사용하는 기술에 대해 설명합니다. 이프로토콜은 인간 IgG 프로파일의 임의의 유형의 분석에 이용 될 수있다. 실험실에서의 IgG 항체를 생산하는 B 세포는 PBMC를 성공적으로 분류 한 후 나머지로부터 분리되었다. 쉰 정렬 B 세포 8은 멀티 웰 플레이트에 도금 단일 B 세포의 클로 날 팽창을 위해, EBV 및 TLR-9를 활성화하여 불멸화 될 수있다. 피더 세포로서 인간 배아 폐 조직으로부터 섬유 아세포, 불멸화 B 세포의 가시화를 용이 세포주 WI38을 사용되었다. 이러한 B 세포에서의 면역 글로불린 중쇄 및 경쇄 서열을 PCR에 의해 수득 될 수 있고, 항체 '유전자는 면역 글로불린 G 발현 벡터에 클로닝하고 시험 관내에서 생산. 이 기술을 사용하여, 도너 검색된 정확히 같은 단일 항체 서열과 항체를 연구 할 수있다.

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프로토콜

동의서는 연구의 참가자들로부터 얻은 것입니다. 이 연구는 기관 윤리위원회에 의해 승인되었다.

말초 혈액 단핵 세포의 분리 1. (PBMC를)

  1. 원심 분리기 혈액 추출 후 가능한 한 빨리 15 분 동안 900 XG에서 참가자의 헤파린 혈액 25 ml의. 이하 혈액이있는 경우, 따라서 시약을 확장. 후드의 모든 다음 단계를 수행합니다.
  2. 깨끗한 튜브에 혈청을 전송합니다. 그것은 자동 항체를 테스트하기 위해, PBMC를 냉동이나자가 면역 환자의 경우에는 이후의 단계에서 사용될 수있다.
  3. RPMI 1640 미디어 10 mL로 혈액을 희석 최대 피펫 아래로 세포를 재현 탁.
  4. 새로운 50 ㎖ 튜브에 polysucrose diatrizoate 나트륨 (1.077 g / ㎖)를 함유하는 용액 15 ml를 추가.
  5. 부드럽게 튜브 가까운 벗어나서 마치의 두 구멍을 가져 와서 단계 1.4 솔루션의 상단에 피를 층그녀는 두 액체가 접촉하는 매우 느리게 온하고 50 ㎖ 튜브의 상부에 천천히 PBMC 현탁액을 디 캔트까지. 이 단계는 한 PBMC의 분리가 양호한 것이 중요하다.
  6. 20 분 동안 RT에서 브레이크없이 400 XG에서 단계 150에서 얻어진 튜브를 원심 분리기.
  7. 원심 분리 후, 피펫과 PBMC를 들어있는 튜브의 중간 부분에 나타나는 흰색 반지를 복구 할 수 있습니다.
  8. RPMI 1640 미디어의 25 ml의 세포를 씻으십시오.
  9. 10 분 동안 실온에서 300 XG를 원심 분리기.
  10. 뜨는을 취소하고 단계 1.9에서와 같이 다시 RPMI 1640 원심 분리기 10 mL로 세포를 씻어.
  11. 이전에 (14)를보고 노이 바 우어 챔버와 PBMC를를 계산합니다.
  12. (2)에서와 같이 한 PBMC를 처리하거나 다음과 같이 추후 사용을 위해 보관 : 1000 만 PBMC를 단계 120에서 얻어진 10 %의 디메틸 설폭 사이드 (DMSO) 및 90 % 혈청 1 ㎖에 희석 Cryovial 튜브 당 동결 위해. 점진적으로 긴 STO에 대한 동결액체 질소에 분노.

2. 염색 PBMC를 셀 세포 계측법에 의해 CD22 + 및 IgG의 +를 정렬

  1. (L 글루타민, 10 mM의 HEPES 완충액, 50 U / ㎖ 페니실린, 50 μg의 / ㎖ 스트렙토 마이신 및 소 태아 혈청이 10 %가 보충 된) 완전한 RPMI 1640 배지 6 ㎖로 25cm 2 세포 배양 플라스크에 PBMC를 판형 하고 5 %의 CO 2에서 37 ° C에서 인큐베이터에서 O / N을 복구 할 수 있습니다.
  2. 멸균 4 % 알부민의 인산염 완충 식염수 (PBS) 솔루션 O / N과 멸균 외과 튜브를 차단합니다. PBS로 두 번 튜브를 세척하고 완전한 RPMI 1640 배지 500 μL로 채운다. 정렬 후 세포를 복구하는이 튜브를 사용합니다.
  3. 5 분 동안 실온에서 400 XG에 튜브와 원심 분리기에서 PBMC를 수집합니다.
  4. 라벨 버퍼에있는 세포를 (참조 2.5 및 2.6 단계) 재현 탁하고 (14)을 계산합니다. 표시 버퍼 멸균 2 % 소 태아 혈청 및 1 mM의 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA) P로되어BS.
  5. 10 5 세포와 각각 3 형광 활성 세포 정렬 (외과) 튜브를 준비하고 라벨 버퍼 100 μL에서 그들을 재현 탁. 이 튜브는 정렬의 문을 정의하는 역할을합니다.
    1. 제 1 튜브의 세 번째 관에서 두 번째로 튜브 20 (제조업체의 데이터 시트에서 권장) 항 IgG의 PE의 μL, 아무것도에서, (제조 업체의 데이터 시트에서 권장) 항 CD22를 PerCP 항체의 5 μl를 추가합니다. 30 분 동안 얼음과 어둠 속에서 품어.
  6. 재현 탁 5 백만 외과 튜브에 라벨 버퍼 200 μL 세포 및 항 CD22를 PerCP 10 μL 및 안티 IgG의 PE의 40 μl를 추가합니다. 30 분 동안 얼음과 어두운 세포를 품어. 세포의 더 높은 수의 정렬이 요구되는 경우, 모든 시약을 확장.
  7. 실온에서 5 분 동안 낮은 브레이크 400 XG에 원심 분리기 세포.
  8. 부드럽게 뜨는을 가만히 따르다.
  9. 500 μ에 세포를 재현 탁라벨링 버퍼 L. 실온에서 5 분 동안 낮은 브레이크 400 XG에 원심 분리기 세포. 반복 2.7과 2.8 단계
  10. 부드럽게 뜨는을 가만히 따르다 및 RPMI 전체 미디어의 300 μL의 세포를 재현 탁.
  11. 0.45 μm의 필터를 통해 세포를 전달합니다. 세포는 정렬 할 준비가되어 있습니다.

B 세포 CD22 + 및 IgG를 3. 정렬 +

  1. 세포의 생존 능력을 설정하기 위해 3 제어 튜브를 사용한다. 더 염색 제어에서, 림프구 게이팅을 정의하는 순방향 및 크기 분산 플롯을 사용합니다. CD22를 PerCP 및 안티 IgG의 PE와 컨트롤 게이트 및 정렬 게이트를 구축하는 역할을한다. 이전에보고 된 데이터 (15) 다음을 수행.
    주 : 게이트 큰 세트로부터, 우리의 경우 세포, 세포 계측 이벤트의 특정 그룹을 분리하는 역할을 한계 값 (경계)의 집합이다. 게이트 정렬 한계 값의 경우의 내부에있는 세포 계측 이벤트, 세포의 회복을 허용정의 된 경계 : CD22 + 및 IgG를 +.
  2. 정렬의 포집 관으로, 단계 2.2에서 얻은 완전한 RPMI 1640 배지 500 μL와 차단 된 튜브를 사용합니다.
  3. 더블 긍정적 인 (15) 정렬 진행 : CD22 + IgG의 +를. 각 조건에서 세포의 마지막 번호를 확인합니다. 접시는 가능한 빨리 피더 세포 위에 세포를 분류.

피더 세포 4. 조사

주 : 1 사이의 피더 세포의 준비 수행 - 정렬하기 전에 3 일. 적어도 5,000 WI38 세포는 96 라운드 웰 플레이트에 잘 당이 필요하다. 단계 후드 4.1, 4.2 및 4.4를 수행합니다.

  1. 셀의 소정 수에 도달 할 때까지 37 ° C, 5 % 완전한 RPMI 1640 배지에서 CO 2 (PBMC를위한 동일)에서 WI38 세포를 배양.
  2. 16 전에 설명 프로토콜 다음, 50 회색에 그들을 조사. WI38 세포를 트립신과 C에 재현 탁 된 후​​ 조사를 수행RPMI 배지, 또는 문화 플라스크에 부착하고, 조사 후 트립신 WI38와 omplete. WI38 세포의 공급 업체로 표시 트립신의 방법을 따르십시오. (PBMC 전체의 1 %가 1.11 단계에서 계산)의 IgG + B 세포 도금에 필요한 웰을 커버하는데 필요한 세포의 수를 조사한다.
  3. 플레이트 5,000 포함 90 μL는 96 라운드 웰 플레이트의 각 웰에 WI38 세포를 조사. (가 빠르게 증발하기 때문에) 빈 플레이트의 외측 행 웰두고 셀만 도금위한 플레이트의 중앙에 우물 (60)을 사용한다. PBS 200 μL와 함께 접시를 프레이밍하는 외부 우물을 입력합니다.
  4. 필요할 때까지, 5 % CO 2에서 37 ° C에서 인큐베이터에 배치합니다.

5. 도금 정렬 된 PBMC를, EBV 감염과 성장

  1. 96 라운드 웰 플레이트 (이전 도금 재치 1640 완전 배지 아니라 당 RPMI의 50 μl를 50 세포를 판에, 정렬 된 PBMC를 희석시간 WI38 조사 세포). EBV 작업에 장착 된 후드에서 단계를 수행합니다.
    주 : 웰 당 50 세포의 감염이 최적화되고 모노클로 날 항체를 생성하기 위해 8 likehood 증가되고, 그러나, 1,6- 전에 기술 된 바와 같이 PCR에 의해 확인이 권장된다.
  2. 물론 96 라운드 웰 플레이트 (17)에 각 - (4 × 10 8 바이러스 복사 / ㎖ 3를 포함) EBV 상층 액의 60 μl를 추가합니다. 주의는 EBV 작업시주의해야한다.
  3. 의 CpG의 1 μg의 / ㎖ (ODN2006) 당 잘 추가합니다.
  4. 5 % CO 2에서 37 ° C에서 인큐베이터에있는 세포를 남겨주세요.
  5. 일주 한 후 현미경으로 성장 시각적으로 모니터 복제.
    주 : B 세포 성장의 일부 예는 결과 섹션 아래에서 볼 수있다. 클론의 성장 속도는 다를 수 있습니다주의, 그리고 여분의 시간은 잘 중간에 성장하는 일부 세포 질량을보고 시작해야 할 수도 있습니다.
  6. 1 차 이주 후광학 현미경 아래 성장하고 첫 번째 미디어 교류를 진행의 모니터 복제. 천천히 잘의 상단 부분에서 매체의 90 μl를 피펫 깨끗한 96 웰 플레이트에서 수집합니다. (B 세포가 웰의 바닥에 놓여 있으므로이를 흡인하는 위험성이 없다).
    1. 각 웰의 CpG (ODN2006)의 1 ㎍ / ㎖의 IL2 50 U / ㎖로 보충 완료 RPMI 1640 미디어 100 μl를 추가합니다. 클론 성장하는 경우, 6 단계에서 같이 ELISA에 의해 첫 번째 미디어 교환을 분석 할 수 있습니다.
  7. 성장 복제를 모니터링하고 3 차 및 미디어의 90 μl를 복용의 CpG (ODN2006)의 1 ㎍ / ㎖의 50 U / ㎖로 보충 완료 RPMI 1640 미디어 100 μl를 추가하여 다시 성장의 4 번째 주 후 미디어를 변경 IL2. 6 단계에서와 같이 ELISA에 의해 IgG의 생산을 모니터링하는 수집 상등액을 사용.
    참고 : 성장의 한 달 클론 라운드 세포의 집합체 그쪽을 관찰함으로써 분명해야 한t는 보통 웰 둥근 바닥의 중앙에 놓여.
  8. 이 단계에서, 같은 방식으로 그 미디어를 변경 이전 주 오직 완전한 RPMI 1640 매체. 좋은 지표는 황색을 띤 세포가 미디어 교환을해야되는 경우 미디어를 변경할 수있는 권리 순간, 미디어 색 알고 있습니다.
  9. 96- 웰 플레이트는 큰 클론 (약 5 × 105 세포)를 함유하는 경우, 24 웰 플레이트의 웰 플랫로 전송. 새로운 웰에 전체 RPMI 1640 미디어 300 μl를 추가합니다. 로 pipetting하여 균일 분배 새로운 웰에 여러 번 전송하고 세포, 아래, 96 웰 성장하는 클론을 재현 탁. 필요한 경우 새 용지를 추가합니다.
    1. 24 웰 플레이트의 웰 세포 (약 5 × 10 6 세포)들로 가득 할 때, 6 웰 플레이트의 평탄도를 전송할 수 있습니다. 잘 새에 전체 RPMI 1640 미디어 2 ML을 추가합니다. 최대 피펫 팅에 의해 여러 번 아래로 24 웰 플레이트에 세포를 재현 탁, 그들에게 homoge 배포이햇 새로운 잘.
  10. 필요한 경우 미디어를 추가합니다. 세포 배양에서 유지 될 수없는 경우, RT에서 5 분 동안 400 XG에서 세포 펠렛. ELISA 테스트를위한 상층 액을 저장합니다. 5 분 동안 400 XG에 다시 1 × PBS, 원심 분리기로 한 번 세포의 펠렛을 세척하고, RNA 추출 할 때까지 -80 ℃에서 건조 저장.
    1. 6 웰 플레이트의 세포가 합류 (약 20 × 10 6 세포)가되면, 60mm 배양 플레이트에 전송할 수 있습니다. 새로운 판에 완전한 RPMI 1640 미디어의 4 ML을 추가합니다. 수행과 같습니다를 6 웰 플레이트에 세포를 재현 탁하고 전송하면 5.9 및 5.10 단계를 반복합니다.
  11. 필요한 경우 새 용지를 추가합니다. 90 % 소 태아 혈청이 30 만 / ㎖ 및 10 % DMSO -이 단계에서, (10)에서 세포를 동결. 세포의 더 많은 양이 원하는 경우, 더 큰 표면 판에 클론의 확장을 계속합니다.

IgG의 항체 검출 6. ELISA

  1. 잘 ELISA 플레이트 O를 50 μl를 / 분배F 염소 F는 (AB) 2 항 - 인간 항체의 Fc 코팅 완충액으로 희석 한 200. 코팅 버퍼는 50 mM의 나 2 CO 3 pH가 9.6이 포함되어 있습니다.
  2. 플라스틱 스티커 판을 밀봉하고, 37 ℃에서 1 시간을 품어. 또한, 4 ° CO / N에 품어.
  3. 세척 버퍼 200 μL와 각 웰을 6 회 반복한다. 세척 버퍼는 0.05 % 트윈 20 1 × PBS에 포함되어 있습니다. 만지거나 항체가 결합했다 잘 표면을 긁지 마십시오.
  4. 버퍼를 차단, 100 μL / 웰으로 차단합니다. 버퍼를 차단하면 PBS에서 무 지방 분유의 4 %가 포함되어 있습니다. 플레이트를 밀봉하고 37 ℃에서 1 시간을 품어.
  5. 세척하지 마십시오. 차단 버퍼를 취소하고 잔여 액을 제거하기 위해 종이 타월에 거꾸로 판 3 번을 때리고.
  6. 클론 '상층 액과 표준을 품어.
    1. 첫 번째 테스트를 들어, 단계 5.6 또는 RPMI 5.7 1/3에서 얻은 클론의 상층 액을 희석. 표준 RPMI 매체 인간 IgG 용액으로 희석의 경우 도착 : 1000 NG /㎖, 500 ng를 / ㎖, 250 ng를 / ㎖, 125 ng를 / ㎖ 62.5 ng를 / ㎖, 31.25 ng를 / ㎖, 15.6 NG / ㎖ 및 빈. 웰 / 50 μL를 사용하여 60 분 동안 37 ° C에서 배양한다. 이러한 1/10 또는 1/100로 항체 친 화성을 테스트 할 수있는 클론 '상층 액의 추가 희석을 분석합니다.
  7. 단계 6.3에서 수행으로 씻으십시오.
  8. 인큐베이션 완충액 20,000 : 염소 F 50 μL / 웰을 사용하여 (AB) 2 항 - 인간 IgG의 Fc 옥시다아제 1 희석 공액. 부화 버퍼 1X PBS에 1 % BSA 및 0.02 % 트윈 20을 포함한다. 60 분 동안 37 ℃에서 인큐베이션.
  9. 단계 6.3에서 수행으로 씻으십시오.
  10. 0.1 % 3,3 '을 포함하는 100 μL / 잘 기판 솔루션을 추가, 5,5'- 테트라 메틸 벤지딘 (TMB). 우물에서 안정적인 푸른 색이 형성 될 때까지 10 분을 품어. 조심해; 너무 오래 기다리지 않는다!
  11. 2 MH 2 SO 4의 50 μl를 첨가하여 반응을 정지. 반응을 정지 한 후 30 분 이내에, 450 nm에서 흡수를 측정한다.
    참고 : 모든 클론의빈을 통해 3 표준 편차와 upernatants는 IgG의 인간 항체에 대한 긍정적 인 것으로 간주됩니다. 양성 클론의 확인을 위해,이 ELISA는 동일한 클론의 상층 액을 다른 적어도 3 회 반복한다. 또한 불특정 교차 반응의 가능성을 버리고 상층 액이 코팅되지 않은 배양하지만 우물을 차단하는 경우 신호가 없을 것을 보장하는 것이 좋습니다. 이 단계에서, 검출 분석은 관심의 항체의 항원 특이성 부 (7)로 진행하기 전에 수행 될 수 스크리닝한다.

일으키기 IgG의 클론의 7 RNA의 분리 및 우선 가닥의 cDNA 합성

  1. IgG의 생산은 ELISA로 확인하는 즉시로, 클론의 RNA를 추출.
  2. 단계 5.7 또는 5.9에서 성장 세포에서 RNA를 추출, 10,000 세포에서 하나의 셀에 DNA를 얻을 수있는 첨자 III 세포를 직접 cDNA 합성 키트를 사용합니다.
  3. LAR에서 RNA를 추출세포의 게르 양, 또는 단계 5.11에 저장된 펠렛에서 높은 순수한 RNA 분리 키트를 사용합니다. RNA 추출의 다른 시스템도이 단계에 적합 할 수 있습니다. 제조업체의 지침을 따르십시오.
  4. 셀 번호는 역전사 시스템 사용 4 6 10 10 X X 1 ~ 1, 제조자의 지시에 따라. 첫번째 가닥 cDNA 합성을위한 다른 시스템이 또한 사용될 수있다.

8. 1 차 및 중공업의 증폭과 IgG를 생산하는 B 세포 클론의 경쇄에 대한 2 차 PCR

  1. 6 단계에서의 IgG ELISA의 단계 5.6 및 5.7과 플러스 얻어진 세포 클론의 cDNA로, 표 1 프라이머 PCR을 수행한다.
  2. 각각의 IgG 무거운, 카파와 람다 체인에 대한 독립의 PCR을 설정합니다. 앞으로와 원액을 확인하고 동일한 농도로 프라이머를 역. 0.4 μm의 최종 농도에서 반응로를 추가합니다.
  3. 1 차 PCR을 수행하기 위해 cDNA 합성의 1 μl를 사용합니다. 여기에, 다카라 DNA 형성 촉매 제조 업체의 지침을 사용하여 20 μL 반응을 수행 할 수 있습니다. 또한, 다른 중합 효소를 사용합니다.
  4. 다음 사이클 조건에서 1 차 PCR을 놓고 5 분 동안 94 ° C; (50 회 : 30 초 94 ° C 45 초 30 초 58 ° C, 72 ° C ~ 72 ° C의 7 분 동안, 그것은 반응에서 4 ° C.Include 빈에 진정하자, 가능한 오염을 감지합니다.
  5. 1X TBE (89 mM 트리스 - 붕산, 2 mM의 EDTA)를 준비합니다. 1X TBE 100 ㎖의 부피에서 아가 로스 (1 % 아가 로즈 젤) 1 g을 넣고. 아가로 오스가 용해 때까지 약 1 분 동안 전자 레인지에서 솔루션을 가열. 그런 다음 10 ㎎ / ㎖ 에티 디움 브로마이드 (또는 이에 상응하는 DNA 염료)의 4 μL를 추가하고 혼합한다.
    1. 트레이에있는 내용을 붓고 중합 때까지 기다립니다. 밴드를 시각화 겔에 PCR 믹스의 5 μl를 실행합니다. 중쇄 단편400 BP - 빛 체인 300해야하지만, 550 BP - S 400의 주위에 있어야합니다. 밴드가 검출되지 않은 경우, 2 차 PCR에 마찬가지로 진행합니다.
  6. 2 차 PCR을 수행하는 혼합 첫 번째 PCR의 1 μl를 사용합니다. 단계 8.2 그러나 프라이머의 적절한 조합을 사용하여 (표 1 참조) 같은 시약을 사용한다. 2 차 PCR을 사용하여 다음과 같은 조건 : 5 분 94 ° C; ; (30 초 94 ° C ~ 30 초 동안 56.5 ° C와 55 초 동안 72 ° C의 50주기) 7 분 72 ° C; 이 4 ℃에서 냉각 할 수 있습니다. 가능한 PCR의 오염을 검출하는 반응에서 빈을 포함한다.
  7. 8.5에 설명 된대로 아가 로스 젤을 준비합니다. 9 단계에서 복제에 적합한 크기의 조각을 포함 증폭을 사용하여 10 단계에서 항체를 생산 8.5.1에​​서와 같이 PCR 제품을 시각화하는 젤을 실행합니다.
  8. 순서 포함 10 μL 반응을 이용하여 DNA : 2 차 PCR, 0의 100 NG를.프라이머 또는 프라이머 믹스, 터미네이터 1 μL 버퍼의 1 μL의 2 μm의. (: 5 초 동안 50 ° C를 10 초 동안 96 ℃, 4 분 동안 60 ° C까지 25 사이클 :) 이러한 조건에서 시퀀싱 반응을 수행 7 분 60 ° C; 이 4 ℃에서 냉각 할 수 있습니다.
  9. 제조업체의 지침에 따라를 MicroSpin G50 열 시퀀싱 반응을 정화. 18 이전에 설명 된대로 자동 시퀀스 분석에 결찰의 시퀀스를 평가합니다. Electropherograms는 깨끗하고 단일 면역 글로불린 순서와 일치해야합니다.
    참고 : PCR 제품은 불분명 또는 혼합 면역 글로불린 시퀀스를 표시하는 경우, 고립 된 시퀀스를 획득 한 후 9 단계로 진행, TopoTA 시스템을 사용하여 복제 고려하시기 바랍니다.

9. 복제 및 생산 중의 IgG 클론의 중쇄 및 경쇄의 시퀀싱

  1. 벡터의 DNA 1 μg의 pFUSE2ss-CLIg - 홍콩, pFUSE2ss- 준비CLIg-HL2 및 pFUSEss-CHIg-HG1.
  2. 적당한 제한 효소로 벡터를 이러한 다이제스트. pFUSEss-CHIg-HG1에 사용 에코 RI 및 pFUSE2ss-CLIg-HL2에 대한 pFUSE2ss-CLIg - 홍콩, 에코 RI 및 AVR II에 대한 BSI 위스콘신, 에코 RI 및 NHE 나는. 벡터의 DNA 1 μg의 각 제한 효소의 3 대를 사용합니다.
    1. 한 효소로 소화하고 PCR 정제 키트와 함께 소화 제품을 정화. 두 번째 효소로 소화하고 (제조 업체의 프로토콜에 따라) 젤 추출 키트를 정화. 아가로 오스 겔에서 관심의 조각을 잘라. 단계 8.5에서와 같이 아가 로스 젤을 준비합니다.
  3. 에코 RI 및 BSI 위스콘신 카파 체인 증폭, 에코 RI와 AVR II 람다 체인 증폭, 에코 RI 및 NHE 나는 무거운 체인 증폭 : 생산의 IgG 클론의 2 차 PCR 제품을 다이제스트. 한 효소로 소화하고 P와 분해 생성물을 정제CR 정제 키트. 두 번째 효소로 소화하고 PCR 정제 키트와 함께 소화 제품을 정화. 단계 9.2에서와 같이 효소와 DNA의 양을 같은 단위를 사용합니다.
  4. T4 DNA 리가 아제 16 ° CO / N 다음과 같은 제조업체의 권장 사항과 벡터의 내부 PCR 단편을 결찰. 1이어야한다 사용 비율 : 2 (벡터 : 삽입).
  5. DH5α 박테리아를 변환 결찰 1 μl를 사용합니다. 변환에 대한 DH5α 제조업체 '조건을 따릅니다. 사용되는 벡터의 종류에 따라, 또는 블라스트 사이 오신 플레이트에서 박테리아를 확산. 37 ° C에서 판 O / N을 품어.
  6. 제조업체의 지침에 따라, 하나의 식민지를 성장하고, 미니 프렙 키트와 함께 DNA를 추출한다. 하나의 식민지에 사용 증가와 DNA가 DNA의 미니 프렙 키트에서 제조업체의 권장 사항을 추출. 단계 9.2 및 9.3에서와 같이 벡터와 인서트를 제조하는데 사용되는 효소 절단에 의해 이들을 분석한다.
  7. 시퀀스의 DNA, 날기로벡터의 G 100 NG는 단계 8.8 및 8.9에서 수행있다.

HEK 세포에서 항체의 제조 (10)

  1. 150mm 세포 배양 접시에 75 %의 컨 플루 언시에 10 % 소 태아 혈청, 1 % L 글루코오스, 1 % 페니실린 / 스트렙 (DMEM +)이 보충 된 둘 베코 변형 이글 중간 (DMEM)에 HEK 세포 성장. 후드에서 수행하는 10.1-10.7 단계를 반복합니다.
  2. 형질 감염 전에, 우태 혈청없이 이전 그러나 매체를 교환 매체.
  3. 각 무거운 경쇄 형질 들어, (PEI를 (혈청)없이 DMEM 2.5 ㎖, 중쇄 벡터 9 μg의, 경쇄와 벡터 6 μg의 한 폴리에틸렌 이민 100 ㎕와 형질 믹스를 조제 1 μg의 / μL의 재고) 솔루션 (). 실온에서 15 분 동안 인큐베이션.
  4. 조심스럽게 접시에 HEK 세포 단계 10.3에서 제조 된 형질 믹스의 2.5 ml를 추가합니다. 균일하게 배포 판을 바위.
  5. 에24 시간 동안 5 % CO 2로 37 ℃ 배양기에서 세포를 cubate.
  6. 태아 혈청없이 매체에 문화 매체를 변경합니다.
  7. 사일 나중에 판에서 매체를 수집합니다.
    주 : 배지에서 항체는 시험 관내 및 생체 내에서 이들의 반응성을 특성화하는데 사용될 수있다.

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결과

CD22과의 IgG 양성 세포를 염색 한 후 선별 게이팅은도 1에 도시되는 본 이미지에서 이중 양성 세포의 면적 -.의 IgG 항체를 생산하는 B 세포 - 분리 튜브 내의 모든 셀을 정렬하도록 선택된다. 분석에서, 전체 PBMC를 약 1 %의 양이 두 집단에 해당한다. 얻어진 분류 세포의 수는 제 1 항에서 얻은 셀의 개수에 의존 할 것이다.

EBV 불멸화 된 CpG 및 (ODN2006) 자극 5 주 후에 다른 결과는도 2에 도시되어 성장하는 클론의 검출이 용이하다.; WI38 피더 세포는 섬유 아세포보다 긴 형상을 가지며, B 세포 클론 환저 멀티 웰 플레이트의 중앙 클러스터로서 성장하는 매우 작고 둥근 세포를 보인다. 이 단계에서, 일부 클론이 성장을 시작하는 것이 분명하다. 그러나 성장 속도는 웰스 contai 일부 변수가 될 물론 수닝은 세포가 모두 증가하는 어떤 세포가 없을 수 있습니다 불후.

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토론

이 논문에서는, 인간 PBMCs를으로부터의 IgG 항체의 생성을위한 모든 단계가 상세하게 제시된다. 이 프로토콜은 이전에 발행 된 기술에 비해 몇 가지 장점을 포함하고 있습니다. 장점 중 하나는 생성 된 항체는 B 세포 클론 원래 쌍에 대응하는 중쇄 및 경쇄를 유지한다는 것이다. IgG의 항체의 확인은 인간 공여자의 어떤 유형으로 수행 될 수 있으며, 백신 접종 5에 의한 면역 반응의 악화가 필요 없다. 피더 세포와 섬유 아세포 세포주 WI38의 사용은, 그들이 이전에 작동을 설명 피더 세포로서 사용 PBMC를 비교하여, 형태 학적으로 상이하고 구별하기가 매우 용이하기 때문에, 성장하는 클론의보다 빠른 검출을 허용 1,6- 8. 또한 피더 세포 WI38 등의 사용이 용이하게 각 실험 전에 해동하여 배양 할 수있는 세포의 분취 큰 양의 동결을 선호.

치명타 중 하나이 프로토콜의 iCal 단계는 출발 물질이다 PBMC를. 혈액은 원심 분리에...

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공개 사항

저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

감사의 글

에 연구 계약 미구엘 세르 베트 (ISCIII CD14 / 00,032) (GN-G.). 에 과학 연구 "번역 상 신경 과학 프로그램의 대학원"에 대한 네덜란드기구 (022,005,019) (CH)에서 원정대.

Prinses 베아트릭스 퐁 (프로젝트 WAR08-12) 및 협회 프랑세즈 contre 레 근육 병증에에서 보조금 (PM-M.) 뿐만 아니라 과학 연구에 대한 네덜란드기구의 왔노 원정대 (916.10.148) 네덜란드의 뇌 재단의 교제로 (FS2008 (1) -28)와 ML에 Prinses 베아트릭스 퐁 (프로젝트 WAR08-12) ( ).

우리는 유동 세포 계측법에 의해 정렬 B 세포에있는 그녀의 도움을 Jozien 야스퍼스 감사합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
히스토파크-1077 Sigma-Aldrich10771용액은 폴리수크로오스와 디아트리조산나트륨을 함유하고
FACSAria II 세포 분류기 BD 바이오사이언스 
96 U-바닥 마이크로 웰 플레이트 Costar3799
Advanced Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 매체 Gibco, Life Technologies12633-020
B95-8 세포주의 30% v/v EBV 함유 상등액   ATCCCRL-16123.4 x 108 복사/ml
CpG2006 InvivogenODN 7909
Wi38 셀 시그마-알드리치90020107
인터루킨-2로슈 
10799068001 ELISA 플레이트Greiner Bio-One, Microlon655092
AffiniPure F(ab')2 단편 염소 Anti-Human IgG, Fc & gamma; Fragment Specific (unconjugated)Jackson ImmunoResearch109-006-008
4% 무지방 분유 (Blotting Grade Blocker) Biorad170-6404
인간 IgG SigmaI 2511HUMAN IgG 정제 면역글로불린, 5.6 mg/ml
염소 F(ab)2 항인간 IgG Fcγ (과산화효소(PO)와 결합)Jackson ImmunoResearch109-036-008
ELISA 리더 (Perkin Elmer 2030) 퍼킨 엘머 2030-0050
과산화효소 접합 AffiniPure Rabbit Anti-Human IgM, Fc5µ   Jackson ImmunoResearch309-035-095
SuperScript III 세포 직접 cDNA 합성 시스템 인비트로젠 18080-200
Applied Biosystems (ABI) GeneAm PCR 시스템 2700Applied Biosystems
고순도 RNA 분리 키트 Roche11828665001
역전사 시스템 키트 PromegaA3500
재조합 Taq DNA 중합효소TAKARAR001A
프라이머 (2 μ l)시그마
울트라퓨어 아가로스 Invitrogen16500-500
100 bp ladderInvitrogen15628-019
Quantity One 4.5.2 (Gel Doc 2000)Biorad170-8100
QIAquick PCR 정제 키트QIAGEN28106
BigDye Terminator v3.1 주기 시퀀싱 키트 Applied Biosystems4337455
0.1 ml 반응 플레이트 (MicroAMP Optical 96-well)Applied Biosystems4346906
유전자 분석기 ABI300 Applied Biosystems4346906
DH5α 유능한 세포 (E. coli)Invitrogen18263-012
pFUSEss-CHIg-hG1 (4,493 bp)Invivogenpfusess-hchg1
pFUSEss-CHIg-hG4 (4,484 bp) Invivogenpfusess-hchg4
pFUSE2ss-CLIg-hk (3,875 bp)Invivogenpfuse2ss-hclk
pFUSE2ss-CLIg-hl2 (3,883 bp) Invivogenpfuse2ss-hcll2
SOC 매체Invitrogen15544-034
LB 기반 아가르 배지에 Zeocin (Fast-Media Zeo Agar)이 보충된Invivogenfas-zn-s
Terrific Broth (TB) 기반 액체 배지 (Fast-Media Zeo TB)Invivogenfas-zn-l
DNA Miniprep 키트 Omega Bio TechnologyD6942-02
Nanodrop (ND1000 분광 광도계)Blasticidin
LB 기반 한천 배지(Fast-Media Blast Agar)Invivogenfas-bl-s
Terrific Broth (TB) 기반 액체 배지 Blasticidin(Fast-Media Blast TB)Invivogenfas-bl-l
EcoRINew England BiolabsR0101S20,000 U/ml, 10x NEBuffer EcoRI
NheINew England BiolabsR0131S10,000 U/ml, 10x NEBuffer 2.1
2-Log DNA ladderNew England BiolabsN3200S0.1-10.0 kb, 1,000 μ g/ml
XmaINew England BiolabsR0180S10,000 U/ml, 10x CutSmart 버퍼 
BsiWINew England BiolabsR0553S10,000 U/ml, 10x NEBuffer 3.1
AvrIINew England BiolabsR0174S5,000 U/ml, 10x CutSmart Buffer 
FastAP 감열성 알칼리 인산가수분해효소Thermo ScientificEF06511 U/µ l, 10x FastAP 버퍼
DH5α 유능한 세포 Invitrogen18263-012
PE 마우스 안티-휴먼 IgGBD Pharmingen 555787
안티-CD22, PerCP-Cy5.5, 클론: HIB22Fisher scientificBDB563942
QIAprep Spin Miniprep Kit QIAGEN27106
BigDye 터미네이터 v3.1Applied Biosystems4337455
있습니다. 이 보충된 Nanodrop

참고문헌

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