인간 단클론 항체의 합성은 자가 항체 매개 면역 반응의 병태생리학적 메커니즘을 밝히는 것을 목표로 하는 연구의 첫 번째 단계입니다. 당사는 B 세포 분리, 항체 클로닝 및 체외 합성을 포함하여 혈액 분류 B 세포에서 재조합 인간 면역글로불린 G(IgG) 단클론 항체를 생성하는 프로토콜을 개발했습니다.
방법 논문
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인간 단클론 항체의 합성은 자가 항체 매개 면역 반응의 병태생리학적 메커니즘을 밝히는 것을 목표로 하는 연구의 첫 번째 단계입니다. 당사는 B 세포 분리, 항체 클로닝 및 체외 합성을 포함하여 혈액 분류 B 세포에서 재조합 인간 면역글로불린 G(IgG) 단클론 항체를 생성하는 프로토콜을 개발했습니다.
인간 단클론 항체를 생성하는 새로운 방법을 찾는 것은 면역 치료제 개발을 포함하여 기초 과학 및 응용 과학 모두에 중요한 활발한 연구 분야입니다. 그러나, 이러한 항체를 확인하고 생산하는 기술은 어려운 경향이 있으며, 때로는 항체의 중쇄 및 경쇄 쌍이 해리됩니다. 여기에서는 엡스타인-바 바이러스(EBV) 및 Toll-like 수용체 9 활성화를 통한 불멸화를 사용하여 인간 말초 혈액 단핵 세포에서 인간 재조합 단클론 항체를 생산하는 비교적 간단하고 간단한 프로토콜에 대해 설명합니다. 적절한 염색을 통해 항체를 생산하는 B 세포를 분리하여 후속 불멸화 및 클론 증식을 수행할 수 있습니다. 불멸화된 B 세포 클론에 의해 생성된 항체 전사체는 PCR에 의해 증폭될 수 있으며, 해당 중쇄 및 경쇄 쌍으로 염기서열분석되고 면역글로불린 발현 벡터로 클로닝될 수 있습니다. 이 기술로 얻은 항체는 자가면역을 포함한 관련 인간 면역 반응을 연구하고 새로운 치료법의 기초를 만드는 강력한 도구가 될 수 있습니다.
이 문서의 목적은 구체적으로 생성하여 인간 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)에서 얻은 인간 IgG 단일 클론 항체를 특성화하는 방법을 설명하기위한 것이다.
인간 항체를 연구 관심은 연구의 다양한 분야에서 성장했다. 특히, 많은 연구 그룹들은 자동 항체 1-3로 인한 병리학에 관심을 갖고있다. 우리는 복제 및 병원성 자동 항체 1을 특징으로했다. 자동 항체의 연구는 경쟁 항체 (4)를 사용하여, 예를 들어, 자신의 목표를 확인하고 치료 전략을 개발하는 데 도움이 될 수 있습니다. 또한, 인간 항체의 연구는 또한, 백신 접종 5 이후에 면역 반응을 평가하기 위해 노출 및 특정 병원균 6 공부 내성되었다 된 개인의 항체 프로파일을 특성화하기 위해, 즉, 다른 연구 분야에서 관심을 가질 수있는 항체에자연 레퍼토리 7,12.
몇 가지 기술은 재조합 인간 단일 클론 항체 8-12를 생성하기 위해 개발되어왔다; 이들의 대부분은 파지 디스플레이와 B 세포의 불멸화를 사용한다. 파지 디스플레이의 사용은 광범위하게 새로운 항체
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동의서는 연구의 참가자들로부터 얻은 것입니다. 이 연구는 기관 윤리위원회에 의해 승인되었다.
말초 혈액 단핵 세포의 분리 1. (PBMC를)
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CD22과의 IgG 양성 세포를 염색 한 후 선별 게이팅은도 1에 도시되는 본 이미지에서 이중 양성 세포의 면적 -.의 IgG 항체를 생산하는 B 세포 - 분리 튜브 내의 모든 셀을 정렬하도록 선택된다. 분석에서, 전체 PBMC를 약 1 %의 양이 두 집단에 해당한다. 얻어진 분류 세포의 수는 제 1 항에서 얻은 셀의 개수에 의존 할 것이다.
EBV 불멸화 된 CpG 및 (ODN2006) 자극 5 주 후에 다른 결과는도 2에 도시되어 성장하는 클론의 검출이 용이하다.; WI38 피더 세포는 섬유 아세포보다 긴 형상을 가지며, B 세포 클론 환저 멀티 웰 플레이트의 중앙 클러스터로서 성장하는 매우 작고 둥근 세포를 보인다. 이 단계에서, 일부 클론이 성장을 시작하는 것이 분명하다. 그러나 성장 속도는 웰스 contai 일부 변수가 될 물론 수닝은 세포가 모두 증가하는 어떤 세포가 없을 수 있습니다 불후.
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이 논문에서는, 인간 PBMCs를으로부터의 IgG 항체의 생성을위한 모든 단계가 상세하게 제시된다. 이 프로토콜은 이전에 발행 된 기술에 비해 몇 가지 장점을 포함하고 있습니다. 장점 중 하나는 생성 된 항체는 B 세포 클론 원래 쌍에 대응하는 중쇄 및 경쇄를 유지한다는 것이다. IgG의 항체의 확인은 인간 공여자의 어떤 유형으로 수행 될 수 있으며, 백신 접종 5에 의한 면역 반응의 악화가 필요 없다. 피더 세포와 섬유 아세포 세포주 WI38의 사용은, 그들이 이전에 작동을 설명 피더 세포로서 사용 PBMC를 비교하여, 형태 학적으로 상이하고 구별하기가 매우 용이하기 때문에, 성장하는 클론의보다 빠른 검출을 허용 1,6- 8. 또한 피더 세포 WI38 등의 사용이 용이하게 각 실험 전에 해동하여 배양 할 수있는 세포의 분취 큰 양의 동결을 선호.
치명타 중 하나이 프로토콜의 iCal 단계는 출발 물질이다 PBMC를. 혈액은 원심 분리에.......
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저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.
에 연구 계약 미구엘 세르 베트 (ISCIII CD14 / 00,032) (GN-G.). 에 과학 연구 "번역 상 신경 과학 프로그램의 대학원"에 대한 네덜란드기구 (022,005,019) (CH)에서 원정대.
Prinses 베아트릭스 퐁 (프로젝트 WAR08-12) 및 협회 프랑세즈 contre 레 근육 병증에에서 보조금 (PM-M.) 뿐만 아니라 과학 연구에 대한 네덜란드기구의 왔노 원정대 (916.10.148) 네덜란드의 뇌 재단의 교제로 (FS2008 (1) -28)와 ML에 Prinses 베아트릭스 퐁 (프로젝트 WAR08-12) ( ).
우리는 유동 세포 계측법에 의해 정렬 B 세포에있는 그녀의 도움을 Jozien 야스퍼스 감사합니다.
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