방법 논문

동축 노즐을 사용하여 다 능성 줄기 세포의 알긴산 캡슐화

DOI:

10.3791/52835

⸱

2015년 7월 2일

 , 
1Center for International Research on Integrative Biomedical System, Institute of Industrial Science, The University of Tokyo

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리는 동축 노즐을 사용하여 만능 줄기 세포(PS 세포)를 알기네이트 하이드로겔 캡슐에 캡슐화하는 방법을 확립했습니다. 이는 세포가 과도하게 응집되는 것을 방지하고 현탁 배양에서 세포가 겪는 전단 응력을 제한합니다. 이 기술은 PS 세포의 대량 생산과 줄기 세포 틈새 시장에 대한 연구에 적용할 수 있습니다.

초록

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

만능줄기세포(PS cell)는 재생 의학 및 약물 스크리닝에서의 역할로 인해 집중적인 연구의 초점입니다. 그러나 이러한 응용 분야에서 PS 셀을 사용하기 위해서는 대량 배양 시스템의 개발이 필요합니다. 현탁 배양은 PS 세포의 대량 생산을 위한 유망한 배양 방법 중 하나이지만, 응집 제어 및 배양 배지의 전단 응력 제한과 같은 몇 가지 문제는 아직 해결되지 않았습니다. 이러한 문제를 해결하기 위해 동축 노즐을 사용하여 알긴산 칼슘(Alg-Ca) 캡슐화 방법을 개발했습니다. 이 방법은N2 가스를 함께 유동시켜 캡슐의 크기를 쉽게 제어할 수 있습니다. 제어 가능한 캡슐 직경은 500μm보다 커야 하는데,N2 가스의 유속이 너무 높으면 액적이 분해되어 이종 크기의 캡슐이 생성되기 때문입니다. 또한, Alg-Na 및 CaCl2 의 농도가 낮으면 구형 캡슐이 생성되지 않습니다. Alg-PLL 코팅이 없는 Alg-Ca 캡슐은 쉽게 용해되어 세포를 수집할 수 있지만 Alg-PLL 코팅이 없는 캡슐에서 잠재적으로 누출될 수도 있습니다. 실제로, 알긴산-PLL 코팅은 세포 누출을 방지할 수 있지만 파손되기 어렵습니다. 이 기술은 캡슐화를 통해 세포외 기질과 분비 인자의 농도 등 세포를 둘러싼 미세환경을 변형시킬 수 있기 때문에 줄기세포 틈새 연구와 PS 세포의 대량 생산에 활용할 수 있습니다.

서론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

유도만능줄기세포(iPS cell)는 재생 의학에서의 역할로 인해 현재 집중적인 연구의 원천입니다. 그러나 조직 재생에는 엄청난 양의 세포가 필요합니다. 예를 들어, 1형 당뇨병 환자1에게는 약 10억 개의 췌장 세포가 필요합니다. 그러나 기존의 접시 배양은 1 × 105 cells/cm2만 얻을 수 있으므로 1형 당뇨병 환자를 치료하기에 충분한 줄기세포 유래 췌장 세포를 얻기 위해1m2의 배양 면적이 필요합니다. 따라서 재생의학에는 마이크로캐리어2 및 현탁 배양과 같은 만능 줄기세포의 대량 배양을 위한 시스템의 개발이 필요합니다. 현탁 배양은 유망한 대량 배양 방법이지만 인간 iPS 세포의 직접 현탁 배양에서는 세포 응집을 제어하는 것이 어렵습니다3. 실제로, 부유 세포는 전단 응력에 노출되어 세포 손상3 또는 분화4를 유발합니다.

현탁액 배양과 관련된 문제를 해결하기 위해 하이드로겔 기반 캡슐화에 대한 연구가 수행되었습니다. 하이드로겔 캡슐에서 세포는 배지의 흐름으로부터 보호됩니다. 이전 보고서에서는 세포 캡슐화를 위해 아가로스5, PEG6 및 알긴산염(Alg)을 포함한 다양한 유형의 하이드로겔을 사용하는 방법을 문서화했습니다. Alg-Ca 하이드로겔은 Alg-Ca 하이드로겔이 알긴산 용액을 CaCl2 용액에 떨어뜨린 직후 형성되고 효소 또는 킬레이트 시약에 의해 쉽게 분해되기 때문에 세포 캡슐화에 가장 유용한 하이드로겔 중 하나입니다.

여기에서는 동축 노즐을 사용하여 iPS 셀에 대한 안정적인 알긴산 캡슐화 공정을 확립했습니다. 액적을 형성하기 위해N2 가스 흐름을 사용하면 오일과 같은 다른 시약이 필요 없이 세포를 균일한 캡슐로 캡슐화할 수 있습니다. 이 방법에서 N2 의 유속과 CaCl2 및 알긴산의 농도는 캡슐의 크기, 모양 및 균일성에 영향을 미치는 주요 작동 조건입니다. 이 보고서는 고속 카메라와 현미경을 사용하여 이러한 작동 조건을 최적화한 방법을 보여줍니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

프로토콜

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 준비 재료

  1. 10 mM의 HEPES 버퍼를 준비합니다. 실온에서 7.0으로 pH를 조정하고 0.9 %의 염화나트륨을 추가합니다.
  2. 1.1 준비 HEPES 완충 식염수를 혼합하여 5 % 알긴산 용액 10 mM의 EDTA 솔루션을 준비합니다. 실온에서 7.0으로 pH를 조절합니다.
  3. 121 ℃에서 20 분 동안 시약 (1.1, 1.2)를 압력솥.
  4. DMEM 10 % ES-자격 FBS와 90 마이 토마 이신 C의 10 ㎍ / ㎖의를 포함하는 내 배양 피더 세포로 처리됩니다 2.0 × 10 6 마우스 배아 섬유 아세포 (MEF) 세포, - 1.2 계층화 젤라틴 코팅 60mm 요리를 준비합니다 - 120 분.
  5. (ES-정규화 FBS 20 % 2- 머 캅토 에탄올, 비 필수 아미노산 및 항생제 50 μM을 함유하는 5 ㎖의 DMEM 고 글루코오스의 존재 하에서 피더 세포와 접시에 세포 (IPS) 마우스 유도 된 다 능성 줄기 유지 페니실린 G 나트륨, 황산 스트렙토 마이신 100 μg의 / ㎖의 100 단위 / ㎖ 및 250 ng를 amphoteri / ㎖CIN의 B).
  6. 시드 4 × 10 5 만능 줄기 젤라틴 코팅 60mm 접시에 세포 및 CO 2를 37 ° C에서 그들을 품어 5 %. 배양시 배양 배지 매일을 변경합니다. 3 후 - 문화의 4 일, 37 ° C에서 0.05 % 트립신은 0.02 %의 EDTA를 포함하는 500 μL와 1 분 5 % CO 2 세포를 Trypsinize. 그 후, 배양 접시에 10 번을 두드려서 세포를 분리.
  7. 3 분 동안 160 × g에서 원심 분리기 세포 현탁액 (세 번 1,000 μL 마이크로 피펫과 피펫 팅하여 단일 세포로 분리 마우스 IPS 세포 다음) FBS와 항생제 ES-자격의 10 % DMEM의 2.5 ML을 추가하고 상층 액을 제거하고 세포를 계산 . 셀 카운팅 후, 젤라틴 코팅 접시에 세포를 수집하고 시드 MEF 세포로부터 만능 줄기 세포를 분리하기 위해 30 분 동안 배양한다. 세포를 카운팅 한 후 (일반적으로 1 - × 106 세포 / 접시가 수집 될 수 있음), 4 × 105 IPS 세포를 시드요리.

알긴산 하이드로 겔 캡슐에 2 셀 캡슐화

  1. 1.5 및 1.6에 기재된 방법과 동일한 방법에 의해 세포를 수집. 3 분 동안 160 × g에서 원심 분리 후, 세 번 HEPES 완충 식염수와 유도 만능 줄기 세포 펠렛을 씻는다. HEPES 완충 식염수에 세포를 다시 현탁 한 후, 별도로 노즐을 막히게 할 수있는 큰 응집체를 제거하기 위해 40 μm의 셀 스트레이너를 통해 세포 현탁액을 필터.
  2. HEPES 완충 식염수 내에서 세포 현탁액 2 ㎖ 및 5 % Δ1g의-나트륨 용액 3 mL를 섞는다. 마지막으로 3 % Δ1g의-나트륨 용액 내 세포 현탁액 5 ml를 얻을 수있다. 셀 밀도는 바람직하게 10 개 이상 6 세포 / ml이다.
  3. 5 ML의 주사기로 세포 현탁액을 수집 한 후, 주사기에 동축 노즐 (그림 1A, B)를 설치하고 주사기 펌프를 설정합니다. 발광 N 2 가스 유동 (저급 1L / 분 이하) 동축 노즐의 외 바늘 통해내부 노즐을 통해 세포 현탁액을 추방.
  4. 0.5 % CaCl2를 250 ml의 용액에 방울을 모아서 10 기다려 - 60-90 rpm에서 교반하면서 겔을 20 분.

알긴산 캡슐 3. 치료 (선택 사항)

  1. 0.05 %에서 Δ1g의 - 칼슘 캡슐 부화 폴리 -L- 라이신 (PLL) 37 ° C에서 5 분 동안 5 % 용액 (/ V w) CO 2.
  2. HEPES 완충 식염수와 캡슐을 세척 한 후, DMEM는 그 표면에 전하를 중화하기 위해 10 % FBS를 함유하는 배양에서 그들을. 코팅 캡슐 (그림 1C)로 활용.
  3. 5 분 동안 10 mM의 EDTA를 함유하는 HEPES 완충 식염수에서 캡슐 부화. EDTA 처리 된 캡슐 빈 캡슐 (그림 1C)로 사용된다.

알긴산 캡슐 4. 문화 및 수집 세포

  1. 37 ℃ 및 5 % CO 2에서 진탕 75 rpm에서 캡슐화 된 세포를 부화십일합니다.
  2. 수집하고 10 분 동안 CO 2, 37 ℃에서 10 mM의 EDTA에 캡슐을 배양하고, 5 %. 3 분 1,000 × g에서 원심 분리하여 PLL을 처리하지 않고 알긴산 캡슐에서 세포를 수집합니다.
  3. 5 분 동안 5,000 ×의 G - 알지네이트 캡슐이 PLL로 처리하는 경우, 최대 피펫 아래로 열 배 1,000에서 주사기와 원심 분리기를에 부착 된 바늘에 의해 ALG 파일-PLL 막을 휴식. 니들 직경은 캡슐의 크기 및 25 G (260 μm의) 바늘이 실험에서 사용되는보다 낮아야한다 (600 μm의)
  4. 당신이 세포에서 mRNA의 샘플을 수집 할 경우 원심 분리 후, 깨진 Δ1g의-PLL 막으로부터 엄격하게 세포 펠렛을 수집합니다. 남은 Δ1g의-PLL 막은 가능한 mRNA의 정제를 방지한다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

결과

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

프로토콜 2.5에서 추방 알지네이트 솔루션은 추방 후 즉시 구형 (- H 그림 2A)를 형성한다. 현탁액을 1L / 분 이하 N 2 유량으로 배출되는 경우, 액 적의 크기가 균일 한 (도 2I)이다. N 2 흐름은 1L / 분보다 큰 경우, 액체 방울 (도 2G, 흰색 화살표로)을 분해 및 액 적의 크기가 불균일 (도 2J)를하게된다. 이 주어지면,이 방법을 사용하여 500 ㎛의보다 작은 액 적을 제조하는 것은 곤란하다.

Δ1g의-나트륨 (3 % 이하)의 농도가 충분 (도 3E-H, K, I) 인 경우, 겔화 과정 (프로토콜 2.4)에서, Δ1g의 - 나이 CaCl2를 용액에 구형 Δ1g의 - 칼슘 캡슐을 형성 방울입니다. Δ1g의-나트륨 (3 % 이하)의 농도는 낮은...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

토론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

캡슐화 배양 직접 현탁 배양 물과 비교 될 수있다. 현탁 배양은 캡슐화 방법보다 다 능성 줄기 세포를 대량으로 얻을 수있는 간단한 방법이다. 그러나, 현탁 배양 세포의 집계를 제어하는​​ 것은 여전히​​ 어렵습니다. 밀봉 방법에서, 세포 응집은 캡슐에 제한되며, 따라서 잘 제어 할 수있다. 이전 간행물은 큰 세포 덩어리가 자유 현탁 배양 7에 등장하는 반면 캡슐화 된 세포, 균일 한 크기의 집계를 형성 것으로 나타났다. 또한, 이전 보고서는 강한 교반 PS 세포의 직접 서스펜션 문화에 세포 죽음을 일으키는 것을 증명; 따라서 제한된 교반 속도를 필요로. 반대로, 심지어 캡슐화 서스펜션 전단 응력 조건에서 세포를 보호 할 수있다. 부유 세포를 성장하는 경우에 밀봉 방법 따라서 운전 조건에 유연성의 수준을 허용한다.

"ove_content는> 캡슐화는 양산 공정의 변형뿐만 아니라 줄기 세포 연구 모두에 유용한 도구이다. 줄기 세포의 캡슐화가 세포 외 기질 및 성장 인자를 포함하는...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

본 연구는 일본과학기술개발기구(JST)의 S-Innovation 프로젝트, 도쿄대학 생명혁신대학원프로그램(GPLLI), 일본과학진흥회 청년과학자연구펠로우십의 지원을 받았습니다. 고속 카메라를 사용하여 동영상을 촬영해 주신 nac Image Technology Inc.에 감사드립니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
마우스 배아 섬유아세포BiolabsSNL 76/7
마우스 유도 만능 줄기세포RIKEN Bio resorce 센터iPS-MEF-Ng-20D-17
DMEM 고포도당GIBCO11995
ES 인증  FBSGIBCO16141079
항균 항생제GIBCO15240
비필수 아미노산GIBCO11140
2-메르캅토에탄올GIBCO21985-023
ESGRO 백혈병 억제 인자Merck MilliporeESG1107
Trypsin/EDTAGIBCO25300
26 g/16 G 바늘Hoshiseido
10 ml 주사기TERUMOSS-10ESZ
나트륨  염화물Wako191-01665
HEPESSIGMAH4034
알긴산 나트륨Wako194-09955
염화칼슘Wako039-00475
폴리 L- 라이신 (MW = 15,000 - 30,000)SIGMAP7890
EDTADOJINDO345-01865
실링 펌프AS ONE
현미경올림푸스IX71
현미경LeicaDM IRB
고속 카메라nac 이미지 기술Memrecam HX-3

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zweigerdt, R. Large scale production of stem cells and their derivatives. Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 114, 201-235 (2009).
  2. Chen, A., Chen, X., Choo, A. B. H., Reuveny, S., Oh, S. K. W. Critical microcarrier properties affecting the expansion of undifferentiated human embryonic stem cells. Stem cell Res. 7 (2), 97-111 (2011).
  3. Schroeder, M., et al. Differentiation and lineage selection of mouse embryonic stem cells in a stirred bench scale bioreactor with automated process control. Biotechnol. Bioeng. 92 (7), 920-933 (2005).
  4. Leung, H. W., Chen, A., Choo, A. B. H., Reuveny, S., Oh, S. K. W. Agitation can induce differentiation of human pluripotent stem cells in microcarrier cultures. Tissue Eng. Part C. 17 (2), 165-172 (2011).
  5. Dang, S. M., Gerecht-Nir, S., Chen, J., Itskovitz-Eldor, J., Zandstra, P. W. Controlled, scalable embryonic stem cell differentiation culture. Stem Cells. 22 (3), 275-282 (2004).
  6. Weber, L. M., He, J., Haskins, K., Anseth, K. S. PEG-based hydrogels as an in vitro encapsulation platform for testing controlled for testing controlled ß-cell microenvironments. Acta Biomater. 2 (1), 1-8 (2006).
  7. Horiguchi, I., Chowdhury, M. M., Sakai, Y., Tabata, Y. Proliferation, morphology, and pluripotency of mouse induced pluripotent stem cells in three different types of alginate beads for mass production. Biotechnol. Prog. 30 (4), 896-904 (2014).
  8. Rahman, N., Purpura, K. A., Wylie, R. G., Zandstra, P. W., Shoichet, M. S. The use of vascular endothelial growth factor functionalized agarose to guide pluripotent stem cell aggregates toward blood progenitor cells. Biomaterials. 31 (32), 8262-8270 (2010).
  9. Siti-Ismail, N., Bishop, A. E., Polak, J. M., Mantalaris, A. The benefit of human embryonic stem cell encapsulation for prolonged feeder-free maintenance. Biomaterials. 29, 3946-3952 (2008).
  10. Magyer, J. P., Nemir, M., Ehler, E., Suter, N., Perriard, J., Eppenberger, H. M. Mass Production of Embryoid Bodies in Microbeads. Ann. N. Y. Acad. Sci. 944, 135-143 (2001).
  11. Xu, J., Li, S., Tan, J., Luo, G. Controllable Preparation of Monodispersed Calcium Alginate Microbeads in a Novel Microfluidic System. Chem. Eng. Technol. 31 (8), 1223-1226 (2008).
  12. Sakai, M. P., Y, Development of Bioactive Hydrogel Capsules for The 3D Expansion of Pluripotent Stem Cells in Bioreactors. Biomater. Sci. 2 (176), 176-183 (2014).
  13. Chowdhury, M. M., Katsuda, T., Montagne, K., Kimura, H., Kojima, N., Akutsu, H., Ochiya, T., Fujii, T., Sakai, Y. Enhanced effects of secreted soluble factor preserve better pluripotent state of embry- onic stem cell culture in a membrane-based compartmentalized micro-bioreactor. Biomed. Microdevices. 12 (6), 1097-1105 (2010).
  14. Chowdhury, M. M., Kimura, H., Fujii, T., Sakai, Y. Induction of alternative fate other than default neuronal fate of embryonic stem cells in a membrane-based two-chambered micro- bioreactor by cell-secreted BMP4. Biomicrofluidics. 6 (1), 14117-14117-13 (2012).

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재인쇄 및 허가

이 JoVE 논문의 텍스트 또는 그림 재사용 허가 요청

허가 요청

태그

LEDTA

관련 논문