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방법 논문

철 염화물에 의한 경동맥 및 장간막 용기에 혈전증 마우스 모델

18.6K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/52838

⸱

2015년 6월 29일

 , 
1Vascular Biotechnology Laboratory, Baker IDI Heart and Diabetes Institute

이 논문에서

요약

마우스의 FeCl3 유도 혈전증 모델이 여기에 설명되어 있습니다. 장간막 혈관에 대한 생체 내 현미경 관찰과 경동맥의 혈류 측정을 통해 혈전 성장을 모니터링하는 방법이 제시됩니다.

초록

심한 혈전증과 심근경색, 폐색전증, 뇌졸중과 같은 허혈성 질환은 전 세계적으로 중요한 건강 문제입니다. 염화제이철 손상은 이제 노출된 정맥이나 크고 작은 직경의 동맥에서 혈전의 형성을 빠르고 정확하게 유도하는 잘 정립된 기술입니다. 이 모델은 혈전증의 병태생리학 연구, 새로운 항혈전제 약물의 발견 및 검증, 이러한 새로운 제제의 작용 메커니즘에 대한 이해에 중요한 역할을 했습니다. 여기에서는 마우스의 장간막 혈관 및 경동맥에 대한 이 기술의 구현이 제시됩니다. 이 방법은 순환하는 백혈구와 혈소판에 형광 염료를 표지하는 방법과 노출된 장간막에 대한 생체 내 현미경 검사를 통해 혈전을 형성하는 손상된 혈관 벽에 축적되는 것을 관찰하는 방법을 설명합니다. 경동맥에서 혈전 형성으로 인한 폐색은 도플러 프로브로 혈류를 모니터링하여 측정합니다.

서론

혈전증의 개발 및 항 혈전 약제의 효과의 평가에 관련된 메카니즘의 연구는 또한 실험 동물 모델을 확립 요구한다. 설치류가 1보다 인간에게 더 큰 용기가 제공 유사한 큰 동물 모델을 사용하는 제했다. 그러나 높은 비용이 요구되는 더 큰 시설을 조작하는데 어려움이 유전자의 사용에 큰 단점이며, 설치류에 예비 시험이 결정적인 결과 2 주어진 일단 큰 동물은 지금 늦은 전임상 연구로 제한됩니다. 생체 내 테스트에 필요한 혈전 약물의 양을 최소화하는 유전자 및 녹아웃 균주 및 작은 크기의 넓은 가용성, 생쥐는 주로 혈전증 연구에 사용된다. 따라서, 혈전 성 질환의 몇몇 모델 생쥐 3에 개발되어왔다.

대부분의 설립 혈전증 모델은 intim을 방해혈전 (4)의 형성을 유도하는 혈액 흐름에 서브 내피 세포 외 기질의 노출 뒤에 혈관 벽의 층. 혈전은 /과 응고 캐스케이드 (5)를 활성화 조직 인자의 노출 또는 혈소판 활성화를 트리거 콜라겐 노출 될 수 있습니다. 몇 가지 기술이어서 초기 혈관 손상을 달성하기 위해 사용된다. Pierangeli는 외. 대퇴부 정맥 6 미세 도구 기계적 파괴 모델을 개발 하였다. Kikushi 등은. 녹색 등 (540 ㎚) 7 관심의 혈관 벽의 특정 여기 뒤에 내피 세포의 지질 이중층에 축적 사진 반응성 화합물 (로즈 벵갈)의 관리에있다 모델을 설명했다. 상처는 짧은 고강도의 펄스 레이저 조명 (8)에 의해 유도 될 수있다. 또 다른 기술은 먼저 쥐의 경동맥에 설립염화 제이철의 국소 적용 (50ml을) 구에있다. 이 경우, FeCl3를 생성 유리기로부터 용기 삭박 결과는 내피 세포 (10)의 지질 과산화 및 파괴를 야기한다. 부상 백혈구 모집뿐만 아니라 혈소판 부착 및 응집을 유발 여러 부착 분자의 발현을 유도한다. 이것은 백혈구, 특히 호중구, 혈전증 11 이어지는 혈액 응고 캐스케이드의 활성화에 결정적인 역할을한다는 것을 증명되었다. 이 방법은 잘 응고 캐스케이드를 재현 적합하다; 연구자들은 인간의 혈전증은 주로 병에 걸린 예에서 발생되는 반면,이 마우스 모델에서, 혈전증은 일반적으로 건강한 혈관에 유도되어, 명심해야합니다. 동맥 경화성 혈관.

이 모델은 구현하기 매우 간단하고 또한 마우스에서 효과적이기 때문에, 지금 주로 사용 혈전증 모드생체 내 연구에서 작은 동물을위한 L. 또한,이 기술은 용기의 다양한 혈전의 형성을 유도 할 가능성을 제공한다. 대상 선박은 동맥 또는 큰 직경 (경동맥, 대퇴, 대정맥) 또는 작은 직경 (장간막, cremaster) 12-14의 정맥이 될 수 있습니다. 최근에, 또한 스트로크 (15)의 모델을 개발하기 위해 근위 중뇌 동맥에 사용 하였다. 혈전 형성이 직접 혈소판 및 백혈구의 형광 표지 한 후 현미경으로 관찰하여 생체 내에 또는 온도 프로브 또는 도플러 프로브 12,16,17과 혈류의 감소를 측정함으로써 모니터링 될 수있다. 이러한 폐색 시간, 혈전 형성 시간이나 혈전 크기와 같은 여러 파라미터는 조사 될 수있다. 혈관 사이의 생리적 차이가 얻은 혈전에 상당한 변화에서 결과를 조사 하였다. 따라서, 연구자들은 일반적으로 그들이 measu 원하는 매개 변수에 따라 상기 타겟 용기를 선택다시 및 / 또는 조사하려는 설정 질병. 일반적으로 경동맥의 모델은 대정맥에 대한 연구가 깊은 정맥 혈전증에 대한 연구에 대한 관련성 반면 심근 경색 또는 뇌졸중에 관한 죽상 혈전증에 대한 연구에 더 관련이있다. 다른 혈관의 접근성 또한 혈전 성장을 측정하는 데 사용되는 방법을 결정한다. 예를 들어, 장간막 혈관은 생체 내에 현미경 관찰 및 혈전 형성의 역학 연구를위한이 모델이 적합하다 액세스하기 쉽다. 경동맥 적게 액세스 가능하지만 혈류 측정 크다 및 폐쇄성 혈전을 연구 우수한 모델을 제공한다.

염화 제이철 유도 혈전증 모델이 병리의 이해에 엄청난 진전을 제공하고 있습니다. 이는 혈전 형성 (18,19)에 폰 빌레 브란트 인자의 역할에 초점을 여러 연구에 사용되었다. 유전 MODI와 결합문법을 없애는 기술은 또한 혈전 성 질환에 관여하는 많은 유전자의 특정 식별을 허용했다. Lamrani 등은. 예컨대 JAK2 V617F 유전자의 녹아웃에 혈병이 불안정 (20)의 가속 형성과 연관되어 있음을 보여 주었다. 장 등이. P2Y12 혈소판 수용체의 생리 학적 의미를 조사 혈소판 특이 수용체를 과발현하는 형질 전환 마우스 만, FeCl3를 21 부상 장간막 동맥에서보다 신속하고 안정적인 혈전 형성을 표시 것을 증명 하였다. 조직 - 형 플라스 미노 겐 활성제 (TPA)과 섬유소 분해 공정에서 키나아제 형 플라스 미노 겐 활성제 UPA ()의 중요한 역할은이 방법 (22)에서 조사되고있다. 또한,이 모델은 또한, 생체 내에서 많은 신규 한 약품의 섬유소 용해 능력을 시험하는 간단하고 정확한 방법을 제공한다. 예를 들어, 왕 등 알. 일이 모델을 사용하고 있습니다활성화 된 혈소판 (23)에 대해 목표로 새로운 재조합 플라스 미노 겐 활성제의 전자 전임상 유효성 검사. 이 방법은 진드기, 뱀파이어 박쥐, 및 모기의 타액이나 대상 24 ~ 27의 특정 식별과 뱀의 독에서 분리 된 치료 용 단백질의 유효성 검사를 활성화. 이러한 예 염화철 모델의 다양성을 증명한다. 이 문서에서 우리는 두 가지 방법에 초점을 두 개의 서로 다른 선종에 염화 제이철 유도 혈전증을 연구; 장간막 혈관 및 경동맥.

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프로토콜

동물과 관련된 모든 실험은 알프레드 의학 연구 및 교육 선거구 동물 윤리위원회 (E / 2,015분의 1,534 / B)에 의해 승인되었다. 모든 수술 조작은 완전 마취 하에서 수행하고, 동물은 임의의 단계에서의 통증을 경험하지 않았다. 기재된 모든 실험은 비 - 회복된다.

1. 준비

  1. 종이 필터 (1mm × 2 ㎜)의 얇은 밴드를 잘라.
  2. 갓 4 % 염화 제이철 용액이 준비 (w / v)의 6 % (W / V)를 탈 이온수로 희석 하였다. 0.22 μm의를 통해 여과, PBS에 로다 민 6G 솔루션 0.3 %를 준비합니다.
  3. 주사기 래퍼의 흰색 플라스틱 작은 조각 (5mm X 1cm)을 잘라.

생체 내에 현미경으로 관찰 2. 장간막 세동맥 혈전 형성

  1. 10 ~ 12 주 된 남성 C57BL / 6 야생형 마우스의 무게를 측정하고 복강 내 주사 비록 케타민의 혼합물 (100 ㎎ / ㎏)과 자일 라진 (10 ㎎ / ㎏)에 따라 마취. 발가락, 꼬리 및 / 또는 피부 핀치, 각막과 눈꺼풀 핀치에서 반응성과 수염 운동의 부재에 응답하여 마취의 깊이를 모니터링합니다. 필요한 경우, 동물의 마취를 유지하기 케타민의 투여 제 (50 밀리그램 / kg)을 주사. 마취 동안 건조를 방지하기 위해 눈에 수의사 연고를 적용합니다. 37 ℃로 조정 가열 패드에 배치 작은 배양 접시에 마우스를 놓습니다.
    참고 : IP 주입은 동물의 고통을 초래할 수 있지만,이 불편의 기간이 최소 (이하 3 초)입니다. 주입과 관련된 통증과 불편 경험이 풍부한 유능한 인력과 적절한 바늘 크기 (25 G)의 사용을 통해 최소화 할 것입니다. 모든 절차에 따라, 자궁 경부 전위 다음 케타민과 자일 라진의 과다 복용을 사용하여 모든 동물을 안락사.
  2. 피부에 약 3cm의 복부 정중선 절개를 수행하고 조심스럽게 복막을 잘라.
  3. 애완 동물의 측면에 마우스를 위치리 접시, 부드럽게 장을 외면 화하다 조심스럽게 페트리 접시의 표면에 적당한 용기를 가지고 2 면봉으로 장간막을 확산. 섬세한 와이퍼가 제대로 건조.
    주 : 장간막 혈관의 이동을 제한하기 위해는, 파파 베린은 소화관의 연동 운동을 억제하는 데 사용될 수있다.
  4. 혈관을 팽창 및 백혈구 및 혈소판 레이블을 29 G 주사기와 마우스의 꼬리 정맥에 로다 민 6G (0.3 %)의 30 μl를 주입하기 위해 따뜻한 물에서 마우스의 꼬리를 만끽 해보세요.
  5. 도립 현미경으로 페트리 접시를 놓고 시야 채널을 이용하여 선택된 세동맥에 초점을 맞춘다.
  6. 6 % (w / v)의 철 (III) 클로라이드로 여과지 밴드 담가 두 집게 세동맥에 여과지를 적용; 첫 번째 여과지 부드럽게 관심 영역에 그것을 누르 초 하나를 보유한다. 여과지의 증착 다음 처음 10 초에서 혈전 형성을 관찰한다.
    참고 : 아주 통신입니다둘러싸인 미세 혈관 및 여과지의 증착 및 부드럽게 압력의 정밀도를 손상하는 데에이 문제를 제한하는 것이 중요하다.
  7. 여과지 : 형광 현미경으로 혈전 형성 (피크 557 nm의 여기, 576 nm의 발광 피크 TRITC 채널)을 관찰한다. 혈전에 로다 민 6G과 통합을 촬영 한 순환 백혈구와 혈소판을 준수하는 것은 따라서 쉽게 식별 할 수 있습니다.
  8. 철 (III) 클로라이드로 1 분간 노광 후 여과지를 벗고 혈전의 형성을 모니터링하는 것을 계속한다. PBS로 용기를 세척 할 것.
  9. 관찰하고 로다 민 6G와 혈소판 및 백혈구의 표시로 강조 혈전의 동적 형성을 기록한다. 이미지를 캡처하고 혈전의 크기를 측정한다. 본원에 제시된 이미지 TRITC 형광 채널, 대물 4X 불구 반전 생체 내에 현미경으로 얻었다.
  10. F모든 절차를 따르게, 자궁 경부 전위 다음 케타민과 자일 라진의 과다 복용을 이용하여 동물을 안락사.

3. 경동맥 동맥 혈전 형성은 혈류의 속도 측정에 의해 평가

  1. 10-12주에게 세 남성 C57BL / 6 마​​우스의 무게를 측정하고 복강 내 주사하지만 케타민 (100 ㎎ / ㎏)과 자일 라진 (10 ㎎ / ㎏)의 혼합물로 따라 마취. 마취 동안 건조를 방지하기 위해 눈에 수의사 연고를 적용합니다.
  2. 37 ° C로 조정 한 가열 패드, 다리에 접착 테이프를 이용하여 운영 현미경 마우스를 고정.
  3. 하나의 와이퍼에서 작은 베개를 확인하고 약간 머리를 상승 마우스의 머리 밑에 테이프. (윗니를 사용) 주둥이를 아래로 당겨 집게로 스레드 루프를 사용합니다. 이것은 쉽게 액세스 경동맥의 영역을 노출한다.
  4. 아래 흉골에 직접 턱 아래 피부의 작은 5mm 깊이 절개를 수행합니다.
  5. FA를 해부하다scia 및 분기 위의 왼쪽 또는 오른쪽 경동맥 중 하나의 단편을 격리 할 것.
  6. 조심스럽게-에서의 동맥을 분리하는 신경 핀셋을 소개합니다. 가까운 동맥에 실행 신경을 방해하고 수있는 혈관의 손상을 야기으로 경동맥을 너무 많이 만지지 않도록하지 마십시오. 동맥의 적어도 5 mm의 섹션을 분리.
  7. 액체는 FeCl3를 방해하는 것을 피하기 적절히 와이퍼 동맥의 면적을 건조.
  8. 주변 조직에 흡수되지 않는 50ml을 너무 경동맥의 절연 부분 아래에 작은 흰색 플라스틱 조각을 넣어. 이를 위해, 동맥 하에서 플라스틱 용지를 천천히 후 처음으로 조각을 가지고 밀어 제 집게를 사용한다.
  9. 4 % (W / V) 또는 6 % (W / V) 염화 제이철과 필터 종이를 적시하고 동맥 주위에 모두 배치합니다.
  10. 3 분 노출 후, 여과지를 벗고 PBS로 씻어 와트 지역을 건조i 번째 와이퍼.
  11. 부상당한 지역에서 선박 주위의 도플러 흐름 프로브를 놓고 흐름의 변화를 기록하기 시작합니다. 성체 마우스의 건강한 경동맥에서, 흐름은 일반적으로 약 1 ㎖ / 분이다. 주의! 접촉은 피해야한다, 그래서 염화 제이철과 프로브의 접촉 프로브가 손상 될 수 있습니다. 본원에 제시된 데이터는 나노 도플러 유동 탐침 0.5 PBS 구비 천음속 시스템 사 유량계, TS420 혈관 주위 모듈 얻었다.
    주 : 염화철의 농도가 서로 다른 시간 폐색 결과 혈전 형성의 동력학을 수정할 수있다. 따라서, 6 %에 노출 (/ W가 V) 염화 제이철은 염화 제이철 (/ V W) 4 %로 노출보다 빠른 폐쇄를 제공합니다.
  12. 모든 절차에 따라, 자궁 경부 전위 다음 케타민과 자일 라진의 과다 복용을 사용하여 모든 동물을 안락사 조심스럽게 도플러 프로브를 청소합니다.

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결과

로다 민 6G의 축적을 발표 할 예정 장간막의 형광 생체 내에 현미경 관찰 50ml을 부상으로 혈관 벽을 따라 혈소판 및 백혈구를 표시. 부분 혈전의 점진적 형성은 200 μm의의 장간막 용기 (그림 1)에서 모니터링된다. 혈전 서서히 나타나며 명백하게 FeCl3를 노출 제 분 후에 식별 가능한 (도 1, t는 60 초 =). 40 초 FeCl3를 적신 여과지 제거한 후, 혈전증이 빠르게 진행되고, 최종적으로 관찰 된 전체 용기 구획의 벽에 존재한다 (도 1, t는 100 초 =).

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그림 1 :. 혈전 성장 장간막 용기에 형광 ...

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토론

염화철 유도 혈전증 모델은 우수한 연구 도구이다. 본 연구에서 나타난 바와 같이, 그 구현이 매우 용이하고, 생체 내에 현미경 또는 도플러 유량계와 조합하여 사용될 때, 혈전 형성의 좋은 실시간 모니터링을 제공한다. 노출 시간과의 FeCl3의 농도를 조정, 또한 비 또는 폐쇄성 혈전 폐색 하나를 생성 할 수있는 가능성을 제공한다.

그러나,이 방법은 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 경동맥, 주요 단점은 가림 시간을 효과적으로 개질 할 수 있지만, 모델 재현성 정확하게 혈전 크기와 성장 속도를 제어하기 위해 열이 너무 약한 남아 있다는 것이다. 몇몇 그룹은 모델 (28, 29)의 표준화에 일했다. 오웬스 등. 그 신뢰성과 재현성 가림 시간 연습과 같은 세 모든 변동 요인을 감소시킴으로써 얻어 질 수있다 제안했다쥐, 생쥐의 유전 배경 이용 마취, 염화 제이철 박람회 기술과 염화 제이철 용...

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공개 사항

저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

저자는 NHMRC와 NHF의 기술 기쁨 야오 박사 카렌 Alt 키의 지원뿐만 아니라 자금을 인정하고 싶습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Whatman 크로마토그래피 종이GE 헬스케어3030917
철 (III) 염화 40% (w/v)VWR24212.298
로다민 6G시그마R4127
도립 현미경 OlympusIX81
디지털 흑백 카메라 OlympusXM10
도플러 플로우미터TransonicTS420
나노 도플러 플로우 프로브Transonic0.5 PBS
케타민호스피라 0409-2051-05
자일라진(램푼)바이엘75313 
페트리 접시Sarstedt82.1472
인슐린 주사기 (29 G)BD 초미세326103
면 팁 애플리케이터BSN 의료211827A
Dynek dysilk 봉합사Dynek Pty LtdCS30100
Dulbecco의 인산염 완충액 식염수 (PBS)Gibco life technologies21600-069
발열 패드KirchnerT60

참고문헌

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염화철 혈전증생체 내 현미경 검사도플러 혈류 측정기형광 표지혈전 형성혈류 측정혈관 폐쇄
철 염화물에 의한 경동맥 및 장간막 용기에 혈전증 마우스 모델
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