유세포 분석을 이용하여 DNA 이중 가닥 절단의 마커인 인산화된 히스톤 H2AX를 측정하여 마우스 비장 림프구에서 만성 생체 내 저선량 조사로 인해 유발될 수 있는 DNA 손상 수준 및 DNA 복구 용량의 변화를 평가하기 위한 프로토콜이 제시됩니다.
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이 논문에서
요약
초록
저용량 방사선 노출은 높은 방사선 량에 의해 생성 효과에서 수량과 품질이 상이한 생물학적 효과의 다양성을 생성 할 수있다. 적절한 과학적으로 정당화 방식으로, 환경 산업 및 공중 보건 안전과 관련된 질문을 해결하는 것은 크게 정확하게 방사선 및 화학 물질을 이온화 낮은 복용량 오염 물질의 생물학적 효과를 측정 할 수있는 능력에 의존한다. DNA 손상 및 수리로 인해 암과 같은 잠재적 인 장기 결과에 건강 위험의 가장 중요한 초기 지표입니다. 여기에서 우리는 마우스의 비장 세포에서 DNA 손상 수리 및 γ-와 β-방사선의 낮은 복용량에 생체 노출 만성의 효과를 연구 할 수있는 프로토콜을 설명합니다. DNA 이중 가닥 나누기 일반적으로 받아 들여지는 마커를 사용하여, γH2AX라는 인산화 히스톤 H2AX, 우리는 DNA 손상뿐만 아니라 레벨을 평가하는 데 사용될 수있는 방법을 설명하지만,도 변화DNA 복구 능력에 잠재적으로 생체 내 노출의 저용량에 의해 생산. 많은 수의 샘플에 표지 immunofluorescently γH2AX의 빠르고 정확하고 신뢰성있게 측정 계측법 흐른다. DNA 이중 가닥 브레이크 수리는 (DNA 수리를 트리거 쉬는 충분한 수를 생성하기 위해 2 Gy의의 도전 량 추출 비장 세포를 노출시킴으로써 및 유도 (1 시간 조사 후) 잔류 DNA 손상을 측정함으로써, 24 시간을 평가할 수있다 사후 조사). 잔류 DNA 손상은 불완전한 복구 및 장기 게놈 불안정성과 암의 위험을 나타내는 것이다. 용이하게 생체 내 연구 (예를 들면, 염색체 수차 골수 망상 적혈구의 소핵 주파수, 유전자 발현, 등) 등으로 측정 할 수있는 다른 분석 및 종점과 결합하여,이 방법은 생물학적 효과의 정확한 상황 평가할 수있다 낮은 수준의 스트레스.
서론
(매스 미디어에 의해 악화) 방사선 히로시마와 나가사키 원자 폭탄의 희귀 원자력 발전소 사고의 이미지에 의해 구동 방사선 대중의 공포를, 이온화 낮거나 매우 낮은 용량 중 하나의 잠재적 인 해로운 영향에 비해 상당한 논쟁에 주도하고있다 매우 엄격한 방사선 방호 규제와 잠재적으로 과학적으로 정당하지 않은 기준. 지난 30 년에, 다수의 보고서는 유해의 부족과 낮은 선량 방사선 1-4에 의한 잠재적으로 유익한 생물 효과의 존재를 모두 기록했다. 주요 방사선 건강 위험 요인은 방사선의 높은 또는 중간 용량을 수신 원자 폭탄 생존자의 역학 연구에 기초하여 추정 암의 확률이다. (그래서 선형 노 임계 값 또는 LNT 모델 호출되지) 이러한 데이터의 선형 외삽은 낮은 용량에서 암의 위험을 추정하는 데 사용됩니다. 그러나,이 접근법은 세계적 과학 수용을받지 못한무겁게 5를 논의한다.
그것은 더 연구가이 문제를 명확히하고 아마도 방사선 보호 기준을 개선하는 데 필요한 것이 명백하다. 이러한 연구는 DNA 손상 비율, DNA 수리 및 돌연변이 유발 등과 같은 엔드 포인트 (인간에 효과를 외삽을 위해 최선을) 생체 내 동물 모델에서 만성 치료 (환경 적, 직업적 노출의 가장 근사치)....
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프로토콜
모든 마우스 처리 및 처리 절차는 로컬 동물 관리위원회에 의해 의회 및 / 또는 동물 보호 프로그램에 의해 규정 승인 규칙을 준수해야합니다. 이 프로토콜에 설명 된 모든 방법은 로컬 동물 관리위원회의 승인을 동물 관리에 캐나다위원회의 지침에 따라 수행되었다.
주의 : 방사능 모든 작업은 (포함하지만 방사성 동물 조직, 침구 폐기물 처리, 삼중 수소 처리, 외부 γ-조사에 국한되지 않음) 입법부 및 / 또는 방사선 방호 당국이 정한 규칙을 준수해야하며, 권한을 수행 할 공인 된 실험실 및 / 또는 시설에서 직원.
1. 동물 일
- 동물 그룹화
- 마우스 조직 외부로부터 도착하는 경우, 동물 시설에서 적어도 10 일 동안 동물들을 순응. 연구는 여러 치료 그룹을 포함하는 경우, 동물 공급자가 알을 보낼 수 있도록하나의 배치로 L 동물.
- 무작위 그룹 당 10 쥐의 치료 그룹에 마우스를 할당합니다. C57BL / 6 변형의 수컷 마우스를 사용하는 경우, 침략 문제를 완화하기 위해 자신의 시설에 매우 젊은 C57BL / 6 남성의 무작위를 미리 준비 동물 공급 업체가 있습니다.
- 내부 β-방사선에 쥐의 만성 노출
- HTO와 OBT 솔루션 (삼중 프롤린, 알라닌과 글리신 아미노산....
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결과
비장 예상 그래프 여기서 설명한 방법을 이용하여 제조 계측법도 2는 플로우의 예를 나타낸다. 세포가 처음 <전자 볼륨 측 분산> 산점도를 기반으로 문이된다 (그림 2A 및 2D, 전자 볼륨 앞으로 분산에 해당). FL3 / 프로피 디움 요오드 히스토그램 (도 2B 및 2E)는 정상 세포주기 분포를 확인한다. FL1 채널을 이용하여 계산 γH2AX 신호를 말은 미처리 대조군 (도 2c)에 비해 세포 (도 2F)에 2 Gy를 조사에서 DNA DSB에서> 2 배의 증가를 확인한다. 다음으로, 우리는 immunofluorescently 마우스 비장 세포 유세포 γH2AX 표지 측정 한 방법의 민감도를 조사 하였다.도 3a는 마우스 비장 세포에서 γH2AX 수준 DNA DSB 지시.......
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토론
이 논문에 제시된 프로토콜은 전리 방사선 등 다양한 화학적, 물리적 에이전트의 낮은 수준의 유전 독성 효과를 조사 생체 내 연구에 대규모 마우스를 수행하는 데 유용합니다. 우리 고유의 무균 동물 시설은 GammaBeam 150 조사 장치를 장착하고 30 미터 길이의 조사 홀은 수백 또는 마우스의 수천에 낮거나 매우 낮은 선량률 조사되어 관련된 평생 연구를 수행 할 수 있습니다. 만성 저용량 조사를위한 작은 조사 시설은 방사선 생물학 연구가 정기적으로 실시하고 방사선 보호 지침 / 규정이 구현 된 대학 또는 병원 환경에서 설정할 수 있습니다. 그러나, 규제 강화는 일반적으로 삼중 수소 등의 방사성 핵종의 처리가 수행되는 내부 동물 조사를 위해 설계 시설에 적용됩니다. 드문 있지만, 이러한 내부 방사선 노출 연구 인증 실험실은 다양한 재에 존재검색 기관 세계적 그들의 고유 한 기능이 프로토콜에 설명 된 연구에 사용될 수있다.
프로토콜 내에서, 우리는 정확하게 실험.......
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공개 사항
저자는 알려진 경쟁 재정적 이해관계가 없다고 선언합니다.
감사의 글
저자는 프랑스 파리의 방사선 보호 및 원자력 안전 연구소(Institute of Radioprotection and Nuclear Safety)의 동료 Sandrine Roch-Lefevre와 Eric Gregoire의 기여에 감사를 표합니다. 이 작업은 캐나다 원자력 연구소(캐나다 온타리오주 초크 리버)의 캐나다 정부 과학 기술 프로그램, CANDU 소유자 그룹(캐나다 온타리오주 토론토), 캐나다 원자력 안전 위원회 및 방사선 보호 및 원자력 안전 연구소(프랑스 파리)의 지원을 받았습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| HTO: 삼중화수, [3H] | 원자로에서 국부적으로 획득 | 재고 활성도 3.7 GBq/mL; Perkin Elmer의 HTO로 대체 가능 | |
| OBT: 알라닌, L-[3-3H]: 유기 결합 삼중수소(OBT) | Perkin Elmer | NET348005MC | 1 mCi/ml(185 MBq) |
| OBT: 글리신, [2-3H]: 유기 결합 삼중수소 | Perkin Elmer | NET004005MC | 1 mCi/ml(185 MBq) |
| OBT: 프롤린, L-[2,3-3H]: 유기 결합 삼중수소(OBT) | Perkin Elmer | NET323005MC | 1 mCi/ml (185 MBq) |
| 삼중수, [3H] (HTO) | Perkin Elmer | NET001B005MC | 현지 원산지 HTO를 대체합니다 |
| 현지에서 제조 | GammaBeam 150 | irradiator Atomic Energy of Canada Limited | 는 충분히 낮은 활성의 다른 g-방사선 소스로 대체될 수 있습니다 |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | P1379-500ML | |
| RPMI | Fisher Scientific | SH3025501 | Hyclone RPMI 1640 with L-Glutamine and HEPES 500mL |
| 소 태아 혈청 | Sigma Aldrich | F1051-100ML | |
| anti-gH2AX 항체, 클론 JBW301 | Millipore | 05-636 | |
| Alexa fluor-488 goat anti-mouse 항체 | Life Technologies (이전 Invitrogen) | A21121 | |
| 프로피듐 요오드 | 시그마 Aldrich | P4864-10ML | 1 mg/ml |
| 에탄올 | 상업용 알코올 | P006-EAAN | 500 ml 병 앱솔루트 에탄올 |
| 1.5 ml 튜브 | Fisher Scientific | 2682550 | 마이크로 원심분리기 튜브 |
| 15 ml 튜브 | Fisher Scientific | 05-539-5 | 멸균 폴리프로필렌 원심분리기 튜브 |
| 액체 질소 | 린데 | P110403 | |
| 12 x 75mm 뚜껑이 없는 유리관 | Fisher Scientific | K60B1496126 | 일회용 붕규산 유리관(일반 끝이 있는 |
| T25 플라스크 | VWR | CA15708-120 | nunc tisue 배양 25ml 플라스크(공급업체 번호 156340) |
| 가위 | Fine Science Tools | 14068-12 | Wagner 가위 12cm 날카롭고 날카로운 |
| 집게, 스트레이트 | Fine Science Tools | 11008-13 | 셈켄 집게 13cm, 직선 |
| 집게, 곡선 | Fine Science Tools | 11003-12 | 좁은 패턴 집게 12cm, 곡선 |
| 60mm 페트리 접시 | VWR | CA25382-100 | BD 팔콘 조직 배양 접시 60 x 15mm |
| 세포 여과기, 70mm | Fisher Scientific | 08-771-2 | 팔콘 세포 여과기 50 / 케이스 |
| PBS 레시피: 탈이온수 200ml에 1정을 녹이고 필요한 경우 pH를 7.4로 조정합니다. | Sigma Aldrich | P4417-100TAB | 인산염 완충 식염수 정제 |
| TBS 레시피: 10x 재고 | |||
| 30g TRIS HCl | 만들기 시그마 Aldrich | T3253-1KG | Trizma 염산염 |
| 88g NaCl | Fisher Scientific | S271-500 | 염화나트륨 |
| 2g KCl | Fisher Scientific | P217-500 | 염화 |
| 칼륨탈이온수 1L에 녹이고 pH를 7.4 |
참고문헌
- Mitchel, R. E., Jackson, J. S., McCann, R. A., Boreham, D. R. The adaptive response modifies latency for radiation-induced myeloid leukemia in CBA/H mice. Radiat Res. 152 (3), 273-279 (1999).
- Shadley, J. D. Chromosomal adaptive response in human lymphocytes. Radiat Res<....
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